JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لتحسين الاختبارات التشخيصية المصلية لمضدات السل المتفطرة، قمنا بتطوير مسبر نانوية لأكسيد الحديد فوق المغناطيسي ة للكشف عن السل خارج الرئة.

Abstract

تم تصنيع مسبار تصوير جزيئي يتكون من جسيمات نانوية من أكسيد الحديد فوق المغناطيسي (SPIO) والأجسام المضادة لسطح السل المتفطرة (MtbsAb) لتعزيز حساسية التصوير للسل خارج الرئة (ETB). تم تصنيع مسبار نانوي SPIO واقترانه مع MtbsAb. وقد تميز المسبار النانوي SPIO-MtbsAb المنقى المنقى باستخدام TEM و NMR. لتحديد القدرة على استهداف المسبار، تم احتضان مسبر نانوSPIO-MtbsAb مع Mtb لفحوصات التصوير في المختبر وحقنها في الفئران التي تم تلقيحها في فحص الجسم الحي بالرنين المغناطيسي (MR). أظهر الحد من تعزيز التباين على التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لخلايا Mtb و THP1 متناسبًا مع تركيز مسبار نانوSPIO-MtbsAb. بعد 30 دقيقة من حقن حقن النانو SPIO-MtbsAb الوريدي في الفئران المصابة بـ Mtb ، تم تعزيز شدة الإشارة في موقع الورم الحبيبي بمقدار 14 مرة في صور MR المرجحة T2 مقارنة ً بالفئران التي تتلقى حقن PBS. يمكن استخدام مسبر MtbsAb النانوية كطريقة جديدة للكشف عن ETB.

Introduction

على الصعيد العالمي، يمثل السل خارج الرئة نسبة كبيرة من حالات السل. ومع ذلك، غالباً ما يتم تفويت تشخيص ETB أو تأخيربسبب عرضه السريري الغادر والأداء الضعيف في الاختبارات التشخيصية. نتائج كاذبة تشمل مسحات البلغم السلبية لعصيات حمض سريع, عدم وجود الأنسجة الحبيبية على علم الأمراض الأنسجة, أو الفشل في ثقافة السل المتفطرة (Mtb). وبالنسبة للحالات النموذجية، يحدث ETB بشكل أقل تواتراً وينطوي على تحرير القليل من عصيات Mtb. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما يتم توطينها في مواقع يصعب الوصول إليها ، مثل الغدد الليمفاوية والجنبة والمناطق العظمية1. وهكذا ، فإن الإجراءات الغازية للحصول على عينات سريرية كافية ، مما يجعل التأكيد البكتريولوجي محفوفًا بالمخاطر وصعبًا ، ضرورية2و3و4.

اختبارات الكشف عن الأجسام المضادة المتاحة تجاريا لETB غير موثوق بها للكشف السريري بسبب مجموعة واسعة من الحساسية (0.00-1.00) وخصوصية (0.59-1.00) لجميع المواقع خارج الرئة مجتمعة5. وقد استخدمت اختبارات المناعة المرتبطة بالإنزيم (ELISPOT) للإنترفيرون-α، وبروتين الفيرات الثقافي (CFP)، والهدف المستضدي الإفرازي المبكر (ESAT) لتشخيص السل الكامن والنشط. ومع ذلك ، فإن النتائج تختلف بين مواقع الأمراض المختلفة لتشخيص ETB6،7،8. وبالإضافة إلى ذلك، PPD الجلد (مشتق البروتين المنقى) وQuantiFERON-السل كثيرا ما قدمت نتائج سلبية كاذبة9. QuantiFERON-TB-2G هو فحص تفاعل المناعة في الدم كله، والذي لا يتطلب عينة من الجهاز المصاب وهذا قد يكون أداة تشخيصية بديلة6،10،11. طرق التشخيص الأخرى المستخدمة عادة لالتهاب السحايا السل، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل، لا تزال غير حساسة جدا لاستبعاد التشخيص السريري بثقة12،13. تظهر هذه الاختبارات التقليدية معلومات تشخيصية غير كافية لاكتشاف موقع العدوى خارج الرئة. وبالتالي، فإن طرائق التشخيص الجديدة مطلوبة سريرياً.

يهدف التصوير الجزيئي إلى تصميم أدوات جديدة يمكنها فحص الأهداف الجزيئية المحددة لعمليات المرض مباشرة في الجسم الحي14و15. يمكن لأكسيد الحديد فائق الكثافة (SPIO)، وهو عامل تباين NMR مرجح T2، أن يعزز بشكل كبير خصوصية وحساسية التصوير بالرنين المغناطيسي (MR) (MRI)16،17. يمكن لطريقة التصوير الوظيفية الجديدة هذه رسم تغييرات الأنسجة بدقة على المستوى الجزيئي من خلال تفاعلات مستقبلات ليغاند. في هذه الدراسة ، تم تصنيع مسبار تصوير جزيئي جديد ، يتألف من جسيمات نانوية SPIO ، لاقترانه بجسم مضاد سطح Mtb (MtbsAb) لتشخيص ETB. SPIO nanoprobes هي طفيفة التوغل في الأنسجة والهيئات قيد الفحص18،19. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه النانوتحقيقات إظهار صور التصوير بالرنين المغناطيسي دقيقة في تركيزات منخفضة بسبب خصائصها شبه المغناطيسية. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر تحقيقات SPIO النانوية أقل ردود الفعل التحسسية لأن وجود الأيون الحديدي هو جزء من علم وظائف الأعضاء الطبيعي. هنا، تم تقييم حساسية وخصوصية مسبر SPIO-MtbsAb النانوية التي تستهدف ETB في كل من نماذج الخلايا والحيوانات. أظهرت النتائج أن المسابر النانوية قابلة للتطبيق كعوامل تصوير شديدة الحساسية لتشخيص ETB.

Protocol

يتبع كل بروتوكول يتعلق بتجربة الحيوان إجراءات التشغيل القياسية لتربية الحيوانات المختبرية وفقًا للمعاهد الوطنية للمبادئ التوجيهية الصحية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الطبعة الثامنة، 2011) وتمت الموافقة عليها من قبل مؤسسة رعاية الحيوانات ولجنة الاستخدام.

1. SPIO تخليق الجسيمات النانوية

  1. إعداد الجسيمات النانوية المغناطيسية لأكسيد الحديد المغلفة dextran عن طريق التحريك بقوة خليط من dextran T-40 (5 مل؛ 50٪ ث / ث) ومائي FeCl3× 6H2O (0.45 g; 2.77 mmol) وFeCl2× 4H2O (0.32 غرام؛ 2.52 ملليمول) الحلول في درجة حرارة الغرفة.
  2. أضف NH4OH (10 مل؛ 7.5٪ v/v) بسرعة.
  3. مزيد من اثارة تعليق أسود لمدة 1 ساعة; في وقت لاحق، والطرد المركزي في 17300 × ز لمدة 10 دقيقة ومن ثم إزالة المجاميع.
  4. فصل المنتجات SPIO النهائي من Dextran T-40 غير المنضم ة بواسطة الكروماتوغرافيا الترشيح هلام20.
  5. تحميل خليط التفاعل (الحجم الإجمالي = 5 مل) في عمود 2.5 سم × 33 سم وelute مع محلول عازل يحتوي على 0.1 M Na خلات و 0.15 M NaCl في درجة الحموضة 7.0.
  6. جمع الجسيمات النانوية المغناطيسية أكسيد الحديد المغلفة dextran المغلفة في حجم الفراغ ومقالب eluates العمود للحديد وdextran في 330 و 490 نانومتر باستخدام حمض الهيدروكلوريك وطرق حمض الفينول / الكبريتيك20، على التوالي.

2. SPIO-MtbsAb التوليف

  1. توليف SPIO-مترافقED باستخدام أساليب ذكرت سابقا21،22.
  2. توليف SPIO-EDBE-succiic أنهيدريد (SA).
    1. حرّك محلولقلي (5 M NaOH؛ 10 مل)) من SPIO-EDBE وSA (1 غرام؛ 10 ميكرومول) في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
    2. دياليز الحل مع 20 تغييرات من 2 لتر من الماء المقطر باستخدام أنابيب الأغشية المسامية الجزيئية (12،000-14،000 ميغاواط قطع). 6 ساعة لكل تغيير.
  3. وأخيراً، إضافة 100 ميكرولتر من SPIO-EDBE-SA (4 ملغ/مل من Fe) إلى 400 ميكرولتر من 4.5 ملغ/مل MtbsAb لتوليف SPIO-MtbsAb باستخدام 1-هيدروكسي بنزوتريازول و (benzotriazol-1-yloxy) tripyrroliphosphonium سداسي فلوروفوسفات كمحفزات وتحريك الحل في درجة حرارة الغرفة
  4. وأخيرا، فصل الحلول من الأجسام المضادة غير المنضمة من خلال الكروماتوغرافيا الترشيح هلام.
  5. تحميل خليط التفاعل (5 مل) على 2.5 سم × عمود 33 سم وelute باستخدام المخزن المؤقت PBS. تأكيد Ab-nanoparticle complex (أي nanoprobe) باستخدام مجموعة فحص بروتين حمض البيسيندونينيك23.

3. مراقبة مورفولوجيا الجسيمات وقياس مستوى الاسترخاء

  1. فحص متوسط حجم الجسيمات، المورفولوجيا، وتوزيع الحجم باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال في جهد 100 كيلو فولت.
    1. قطرة يلقي التشتت المركب على شبكة النحاس 200 شبكة والهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة قبل تحميله على المجهر.
  2. قياس قيم وقت الاسترخاء(T1 و T2)من تحقيقات نانوباستخدام مقياس الاسترخاء NMR في 20 ميغاهرتز و 37.0 درجة مئوية ± 0.1 درجة مئوية.
    1. معايرة relaxometer قبل كل قياس.
    2. سجل القيم r1 و r2 من نقاط البيانات الثمانية التي تم إنشاؤها من خلال عكس الانتعاش وتسلسل نبض Carr-Purcell-Meiboom-Gill ، على التوالي ، لتحديد r1 و r2 relaxivities20.

4. تصوير الخلايا

  1. زراعة monocytes الإنسان THP-1 في RPMI 1640 مع 10٪ مصل الأبقار الجنينية، 50 ميكروغرام / مل كبريتات جنتاميكسين، 100 وحدة / مل بنسلين الصوديوم G، 100 ميكروغرام من كبريتات العقدتوموسين، و 0.25 ميكروغرام / مل الفطريات في حاضنة 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية.
  2. تحضن SPIO-MtbsAb nanoprobes (2 mM) مع 106 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) من Mycobacterium bovis BCG preincubated مع 1 × 107 monocytes المنشط في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (1 مل) في 5٪ CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. أنابيب الطرد المركزي في 200 × ز وتجاهل supernatant. إعادة حل الكريات في الوسط (200 ميكرولتر).
  4. مسح العينات باستخدام تسلسل نبض صدى التدرج السريع (وقت التكرار (TR) = 500؛ صدى الوقت (TE) = 20؛ زاوية الوجه = 10 درجة) من خلال 3.0-T التصوير بالرنين المغناطيسي لتحديد خصوصية وحساسية nanoprobe21،22.

5. BCG (عصية كالميت - غيرين) التلقيح

  1. إعادة تشكيل لقاح lyophilized أو المخزون البكتيري في وسط Sauton ومن ثم تمييع المخزون مع المالحة حتى تفرق بشكل صحيح كما هو موضح سابقا24.
  2. تطعيم سلالة حية مخففة من M. bovis BCG ، التي تم الحصول عليها من ADIMMUNE (تايبيه ، تايوان) (سلالة كونوت ؛ ImmuCyst Aventis، باستور Mérieux) في حجم 0.1 مل / الماوس (أي 107 CFU) intradermally في الجلد الفصط الظهري الأيسر أو الأيمن من الفئران، كما هو موضح سابقا23. حقن المالحة في الفئران والسيطرة السلبية. مراقبة الحيوانات يوميا بعد تلقيح BCG.
  3. التضحية بالحيوانات بعد شهر واحد من تلقيح البكتيريا باستخدام القتل الرحيم ثاني أكسيد الكربون. حصاد الأنسجة من موقع التلقيح intradermal. إصلاح الأنسجة في 10٪ formalin وتضمينها في البارافين للأقسام التسلسلية في 5-10 ميكرومتر. بقع الأنسجة وصمة عار مع بقع هيماتوكسيلين / إيوسين وزيل نيلسن للبكتيريا سريعة الحمض24 ومع برلين الأزرق للحديد الحديدي25.

6. في التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي

  1. حقن الكيتامين (80 ملغ/كغ من وزن الجسم) وإكسيلازين (12 ملغم/كغ وزن الجسم) تحت الجلد في الفئران للتخدير الحيواني.
  2. حقن مسابر SPIO-TbsAb (2 nmol/200 μL) في عروق ذيل الفئران. صور MR الفئران قبل ومباشرة بعد حقن التحقيق ثم كل 5 دقائق لمدة 30 دقيقة للحصول على T2 المرجح سريع تدور صدى الصور (TR = 3000; TE = 90؛ مجال الرؤية = 8).
  3. تحليل كمي لجميع الصور MR باستخدام كثافة الإشارة (SI)، وهو قياس المناطق المحددة من الاهتمام في مواقع مماثلة من مركز الورم الحبيبي Mtb والعضلات الخلفية المجاورة لمنطقة الحبيبية.
  4. حساب التحسينات إشارة النسبية باستخدام قياس SI قبل (SIpre؛ التحكم) و 0-3 ح بعد حقن (SIpost) من عوامل التباين باستخدام الصيغة

    [(سيبوست - سيبري)/سيبري] × 100

    حيث سيبري هو SI من الآفة على المسح قبل تعزيز وSIpost هو SI من الآفة على مسح ما بعد تعزيز21،22.

النتائج

SPIO-MtbsAb توليف nanoprobe وتوصيف
تم تصميم الجسيمات النانوية SPIO لاقتران مع MtbsAb. استقر اكستراين على سطح الجسيمات النانوية SPIO كان عبر هابيكلوروهيدرين. تم دمج الجسيمات النانوية SPIO في وقت لاحق مع EDBE لتنشيط المجموعات الوظيفية الأمين الأولية في نهايات dextran. SA ثم تم الاقتران لتشكيل SPIO-EDBE-SA. SPIO-Mt...

Discussion

على غرار الدراسات ذات الصلة ، أظهرت النتائج التي توصلنا إليها فيما يتعلق بتحقيقات نانوSPIO-MtbsAb خصوصية كبيرة لـ Mtb27،28. تم العثور على الورم الحبيبي Mtb تحت الجلد 1 شهر بعد حقن السل في نماذج الماوس. وشملت النتائج النموذجية لعلم الأنسجة الحبيبي السل تسلل الخلايا ال?...

Disclosures

لا أحد من المؤلفين لديه أي مصلحة ملكية في المواد التي تم فحصها في هذه الدراسة.

Acknowledgements

ويشكر المؤلفون على الدعم المالي المقدم من وزارة الاقتصاد في تايوان (يمنح NSC-101-2120-M-038-001، MOST 104-2622-B-038-007، MOST 105-2622-B-038-004) لأداء هذا العمل البحثي. تم تحرير هذه المخطوطة من قبل والاس التحرير الأكاديمي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphateSigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazoleSigma-Aldrich
dextran(T-40)GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine)Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrateFluka
ferrous chloride tetrahydrateFluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCGPasteur MérieuxConnaught strain; ImmuCyst Aventis
MRIGE medical Systems3.0-T, Signa
NH4OHFluka
NMR relaxometerBrukerNMS-120 Minispec
Sephacryl S-300GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut offSpectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to MtbAcris Antibodies GmbHBP2027
transmission electron microscopeJEOLJEM-2000 EX II

References

  1. Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
  2. Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, 25-55 (1984).
  3. Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
  4. Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
  5. Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
  6. Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
  7. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
  8. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
  9. Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
  10. Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
  11. Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
  12. Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
  13. Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
  14. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. , 1-7 (2003).
  15. Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219, 316-333 (2001).
  16. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
  17. Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
  18. Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).
  19. Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
  20. Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
  21. Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
  22. Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
  23. Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
  24. Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
  25. Woods, A. E., Ellis, R. . Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , 6-11 (1994).
  26. Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
  27. Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
  28. Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
  29. Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
  30. von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156 Mycobaterium nanoprobe

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved