JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mycobacterium tuberculosis antijenleri için serolojik tanı testlerini geliştirmek için ekstrapulmoner tüberkülozu tespit etmek için süperparamanyetik demir oksit nanoprobları geliştirdik.

Özet

Süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nano partikülleri ve Mycobacterium tuberculosis yüzey antikorlarından (MtbsAb) oluşan moleküler görüntüleme sondası, ekstrapulmoner tüberküloz (ETB) için görüntüleme hassasiyetini artırmak için sentezlendi. Bir SPIO nanoprobub sentezlendi ve MtbsAb ile konjuge edildi. Saflaştırılmış SPIO-MtbsAb nanoprobutem ve NMR kullanılarak karakterize edildi. Sondanın hedefleme yeteneğini belirlemek için SPIO-MtbsAb nanoprobları in vitro görüntüleme tahlilleri için Mtb ile kuluçkaya yatırıldı ve manyetik rezonans (MR) ile in vivo araştırma için Mtb-inoprole farelere enjekte edildi. Mtb ve THP1 hücrelerinin manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kontrast geliştirme azaltma SPIO-MtbsAb nanoprob konsantrasyonu ile orantılı gösterdi. Mtb enfekte fareleriçine intravenöz SPIO-MtbsAb nanoprobe enjeksiyon 30 dakika sonra, granülomatöz sitenin sinyal yoğunluğu 14 kat T2 ağırlıklı MR görüntüleri ile pbs enjeksiyonu alan fareler ile karşılaştırıldığında geliştirilmiştir. MtbsAb nanoprobları ETB tespiti için yeni bir yöntem olarak kullanılabilir.

Giriş

Küresel olarak, ekstrapulmoner tüberküloz (ETB) tüberküloz (TB) olgularının önemli bir oranını temsil eder. Bununla birlikte, ETB tanısı genellikle cevapsız veya gecikmiş nedeniyle sinsi klinik sunum ve tanı testlerinde kötü performans; yanlış sonuçlar arasında asit hızlı basiller için negatif balgam yaymaları, histopatolojide granülomatöz doku eksikliği veya Kültür Mycobacterium tuberculosis 'in (Mtb) başarısızlığı sayılabilir. Tipik vakalara göre, ETB daha az sıklıkta ortaya çıkar ve Mtb basilinin çok az serbestliğini içerir. Buna ek olarak, genellikle lenf düğümleri, plevra ve osteoartiküleralanlar1 gibi ulaşılabilmek zor sitelerde lokalize edilir. Bu nedenle, bakteriyolojik doğrulamariskli ve zor kılan yeterli klinik örneklerin elde edilmesi için invaziv prosedürler, gerekli2,3,4.

ETB için ticari olarak mevcut antikor algılama testleri klinik algılama için güvenilmez çünkü duyarlılık geniş bir yelpazede (0.00-1.00) ve özgüllük (0.59-1.00) kombine tüm ekstrapulmoner siteler için5. Enzime bağlı immünspot (ELISPOT) interferon-γ, kültür filtrat proteini (CFP) ve erken salgı antijenik hedef (ESAT) için tahliller gizli ve aktif Tüberküloz tanısı için kullanılmıştır. Ancak, sonuçlar ETB tanısı için farklı hastalık siteleri arasında değişir6,7,8. Buna ek olarak, cilt PPD (saflaştırılmış protein türevi) ve QuantiFERON-TB sık yanlış negatifsonuçlar9 sağladı. QuantiFERON-TB-2G etkilenen organdan bir örnek gerektirmez ve bu alternatif bir tanıaracı6 olabilir tam bir kan immün reaktivite tahlili,10,11. Genellikle TB menenjit için kullanılan diğer tanı yöntemleri, polimeraz zincir reaksiyonu gibi, hala çok emin klinik tanı dışlamak için duyarsız12,13. Bu konvansiyonel testler ekstrapulmoner enfeksiyon bölgesini keşfetmek için yeterli tanısal bilgi göstermez. Bu nedenle, yeni tanı yöntemleri klinik olarak gereklidir.

Moleküler görüntüleme, vivo14,15'tehastalık süreçlerinin spesifik moleküler hedeflerini doğrudan tarayabilen yeni araçlar tasarlamayı amaçlamaktadır. Süperparamanyetik demir oksit (SPIO), Bir T2 ağırlıklı NMR kontrast ajan, önemli ölçüde özgüllük ve manyetik rezonans duyarlılığı artırabilir (MR) görüntüleme (MRG)16,17. Bu yeni fonksiyonel görüntüleme yöntemi, ligand-reseptör etkileşimleri yoluyla doku değişikliklerini moleküler düzeyde tam olarak çizebilir. Bu çalışmada, SPIO nano partiküllerinden oluşan yeni bir moleküler görüntüleme sondası, ETB tanısı için Mtb yüzey antikor (MtbsAb) ile eşleşecek şekilde sentezlendi. SPIO nanoproblar muayene altında doku ve organları minimal invaziv18,19. Ayrıca, bu nanoproblar paramanyetik özellikleri nedeniyle düşük konsantrasyonlarda hassas MR görüntüleri gösterebilir. Buna ek olarak, SPIO nanoproblar demir iyonlarının varlığı normal fizyolojinin bir parçası olduğu için en az alerjik reaksiyonlar ortaya çıkargörünür. Burada ETB'yi hedef alan SPIO-MtbsAb nanoproblarının duyarlılığı ve özgüllüğü hem hücre hem de hayvan modellerinde değerlendirildi. Sonuçlar, nanoprobların ETB tanısı için ultra duyarlı görüntüleme ajanları olarak uygulanabilir olduğunu göstermiştir.

Protokol

Hayvan deneyi ile ilgili tüm protokol, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Yönergeleri uyarınca laboratuvar hayvanı ıslahı için standart çalışma prosedürlerini izler ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi.

1. SPIO nanopartikül sentezi

  1. Dekstran T-40 (5 mL; %50 w/w) ve sulu FeCl3×6H2O (0,45 g; 2,77 mmol) ve FeCl2×4H2O (0,32 g; 2,52 mmol) çözeltilerini oda sıcaklığında şiddetle karıştırarak dekstran kaplı demir oksit manyetik nano partikülleri hazırlayın.
  2. NH4OH (10 mL; %7,5 v/v) hızla ekleyin.
  3. Daha fazla 1 saat için siyah süspansiyon karıştırın; daha sonra, 10 dakika için 17.300 x g santrifüj ve daha sonra agregaları kaldırın.
  4. Jel filtrasyon kromatografisi20ile son SPIO ürünlerini bağlanmamış dekstran T-40'tan ayırın.
  5. Reaksiyon karışımını (toplam hacim = 5 mL) 2,5 cm × 33 cm'lik bir kolona yükleyin ve pH 7,0'da 0,1 M Na asetat ve 0,15 M NaCl içeren bir tampon çözeltisi ile elitedin.
  6. Void hacminde saflaştırılmış dekstran kaplı demir oksit manyetik nano tanecikleri toplamak ve kolon hidroklorik asit ve fenol / sülfürik asityöntemlerikullanarak 330 ve 490 nm demir ve dekstran için eluates tahmin, sırasıyla.

2. SPIO-MtbsAb sentezi

  1. Synthesize SPIO-konjuge EDBE daha önce bildirilen yöntemler kullanılarak21,22.
  2. Synthesize SPIO-EDBE-succinic anhidrit (SA).
    1. 24 saat oda sıcaklığında SPIO-EDBE ve SA (1 g; 10 μmol) alkali çözeltisini (5 M NaOH; 10 mL)) karıştırın.
    2. Moleküler gözenekli membran borusu (12.000-14.000 MW kesme) kullanarak 2 L distile su 20 L değişiklikler ile çözelti diyaliz. Her değişiklik için 6 saat.
  3. Son olarak, SPIO-MtbsAb'ı kullanarak sentezlemek için 400 μL 400 mg/mL MtbsAb'ye 100 μL SPIO-EDBE-SA (4 mg/mL Fe) ekleyin 1-hidroksibenzotriazol ve (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinofosfonium hexafluorophosphate katalizör olarak ve 24 saat oda sıcaklığında çözelti karıştırın.
  4. Son olarak, jel filtrasyon kromatografisi ile bağlanmamış antikordan çözeltileri ayırın.
  5. Reaksiyon karışımını (5 mL) 2,5 cm × 33 cm kolona yükleyin ve PBS tamponu kullanarak elte olun. Ab-nanopartikül kompleksi (yani, nanoprob) bir bicinchoninic asit protein asit araştırma kiti kullanarak onaylamak23.

3. Parçacık morfolojisi gözlem ve gevşeme kademeölçümü

  1. 100 kV'luk bir voltajda iletim elektron mikroskobu kullanarak ortalama parçacık boyutunu, morfolojisini ve boyut dağılımını inceleyin.
    1. Kompozit dağılımını 200 örgülü bakır ızgaraya bırakın ve mikroskoba yüklemeden önce oda sıcaklığında kuruhava.
  2. 20 MHz ve 37.0 °C ± 0.1 °C'de NMR relaxometresini kullanarak nanoprozların gevşeme süresi değerlerini(T1 ve T2)ölçün.
    1. Her ölçümden önce relaxometreyi kalibre edin.
    2. R 1 ve r2 relaxivitelerini belirlemek için, sırasıyla, tersine çevirme-kurtarma ve Carr-Purcell-Meiboom-Gill darbe dizisi ile oluşturulan sekiz veri noktasından r 1 ve r2 değerlerinikaydedin.

4. Hücre görüntüleme

  1. RPMI 1640'ta %10 fetal sığır serumu, 50 g/mL gentamisin sülfat, 100 ünite/mL penisilin G sodyum, 100 μg streptomisin sülfat ve %5 CO2 inkuvtorda 0,25 μg/mL fungizone ile insan monositleri THP-1'i yetiştirin.
  2. Incubate SPIO-MtbsAb nanoproblar (2 mM) ile 106 koloni şekillendirme birimleri (CFU) Mycobacterium bovis BCG ile preincubated 1 × 107 aktif monositmikrocentrifuge tüpler (1 mL) bir 5% CO2 kuluçka içinde 37 ° c için 1 saat.
  3. 200 x g centrifuge tüpleri ve supernatant atın. Pelletleri ortamda yeniden çözün (200 μL).
  4. Hızlı degrade lisanlı yankı darbesi dizisi (Tekrarlama süresi (TR) = 500 kullanarak örnekleri taziz; Yankı süresi(TE) = 20; Çevirme açısı = 10°) ile 3.0-T MRG ile nanoprobun özgüllüğünü ve hassasiyetini belirlemek için21,22.

5. BCG (Bacillus Calmette-Guérin) aşılama

  1. Sauton's orta lyophilized aşı veya bakteri stok yeniden ve daha önce açıklandığı gibi düzgün dağıtılana kadar tuzlu su ile stok seyreltmek24.
  2. ADIMMUNE (Taipei, Tayvan) (Connaught suş elde M. bovis BCG, canlı zayıflatılmış suşu inoculate; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) 0.1 mL/fare hacminde (yani, 107 CFU) farelerin sol veya sağ dorsal skapular deri içine intradermally, daha önce açıklandığı gibi23. Negatif kontrol olarak farelere tuzlu su enjekte edin. BCG aşısından sonra hayvanları günlük olarak izleyin.
  3. Karbondioksit ötanazi kullanarak bakteri aşılama 1 ay sonra hayvanları kurban. Dokuları intradermal aşılama bölgesinden alın. 5-10 μm. Asit hızlı bakteriler için hematoksilin / eozin ve Ziehl-Neelsen lekeleri ile leke doku bölümleri ile seri bölümler için 10% formalin ve parafin gömmek doku düzeltin24 ve ferrik demir için Berlin maviile 25.

6. In vivo MRG

  1. Hayvan anestezisi için farelere ketamin (80 mg/kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (12 mg/kg vücut ağırlığı) deri altı enjekte edin.
  2. SpiO-TbsAb problarını (2 nmol/200 μL) farelerin kuyruk damarlarına enjekte edin. MR görüntü fareler önce ve hemen prob enjeksiyonu sonra ve daha sonra her 5 dk için 30 dk T2 ağırlıklı hızlı spin-yankı görüntüleri elde etmek için (TR = 3000; TE = 90; görüş alanı = 8).
  3. Bir Mtb granülom merkezinin ve granülomatöz alana bitişik arka kanın karşılaştırılabilir konumlarında tanımlanmış ilgi bölgelerinin ölçümü olan sinyal yoğunluğu (SI) kullanarak tüm MR görüntülerini nicel olarak analiz edin.
  4. Formülü kullanarak kontrast maddelerin (SIpre; kontrol) ve 0-3 h (SIpost) enjeksiyonundan önce SI ölçümü kullanarak göreli sinyal geliştirmelerini hesaplayın

    [(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100

    nerede SIpre önceden geliştirilmiş tsam üzerinde lezyonun SI ve SIpost post-enhanced tcan21,22üzerinde lezyonun SI olduğunu .

Sonuçlar

SPIO-MtbsAb nanoprob sentezi ve karakterizasyonu
SPIO nano tanecikleri MtbsAb ile biraraya getirmek için tasarlanmıştır. SPIO nano taneciklerinin yüzeyinde stabilize dekstran epiklorohidrin ile çapraz bağlandı. SPIO nano tanecikleri daha sonra dextran uçlarında birincil amin fonksiyonel grupları etkinleştirmek için EDBE ile dahil edildi. SA daha sonra SPIO-EDBE-SA oluşturmak için konjuge edildi. SPIO-MtbsAb nanoprobları, MtbsAb'ın SPIO-EDBE-SA ile kaplin ajanlarının varlığında ç...

Tartışmalar

İlgili çalışmalara benzer şekilde, SPIO-MtbsAb nanoprobları ile ilgili bulgularımız Mtb27,28için önemli bir özgüllük göstermiştir. Fare modellerinde tb enjeksiyonundan 1 ay sonra deri altı Mtb granülomu bulundu. Tipik Tüberküloz granülomatöz histoloji bulguları lenfosit infiltrasyonu, epiteloid makrofajvarlığı ve nevasaskülarizasyon dur. Asit hızlı basiller Tüberküloz lezyonlarına dağıldı ve MtbsAb immünohistokimya bulgularını...

Açıklamalar

Yazarların hiçbiri bu çalışmada incelenen malzemelerherhangi bir özel ilgi vardır.

Teşekkürler

Yazarlar Ekonomi Bakanlığı Tayvan mali destek için müteşekkir (verir NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) bu araştırma çalışması gerçekleştirmek için. Bu el yazması Wallace Akademik Düzenleme tarafından düzenlenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphateSigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazoleSigma-Aldrich
dextran(T-40)GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine)Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrateFluka
ferrous chloride tetrahydrateFluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCGPasteur MérieuxConnaught strain; ImmuCyst Aventis
MRIGE medical Systems3.0-T, Signa
NH4OHFluka
NMR relaxometerBrukerNMS-120 Minispec
Sephacryl S-300GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut offSpectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to MtbAcris Antibodies GmbHBP2027
transmission electron microscopeJEOLJEM-2000 EX II

Referanslar

  1. Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
  2. Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, 25-55 (1984).
  3. Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
  4. Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
  5. Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
  6. Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
  7. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
  8. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
  9. Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
  10. Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
  11. Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
  12. Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
  13. Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
  14. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. , 1-7 (2003).
  15. Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219, 316-333 (2001).
  16. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
  17. Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
  18. Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. , 106-115 (2009).
  19. Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
  20. Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
  21. Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
  22. Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
  23. Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
  24. Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
  25. Woods, A. E., Ellis, R. . Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. , 6-11 (1994).
  26. Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
  27. Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
  28. Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
  29. Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
  30. von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 156Ekstrapulmonermolek ler g r nt lemeMycobaterium tuberculosisnanoprobetanBerlin mavi lekesiZiehl Neelsen lekesi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır