Síntesis, caracterización y aplicación de nanosondas de óxido de hierro superparamagnético sin empleo para la detección de tuberculosis extrapulmonar

Resumen

Para mejorar las pruebas diagnósticas serológicas de antígenos de Mycobacterium tuberculosis, desarrollamos nanosondas de óxido de hierro superparamagnético para detectar la tuberculosis extrapulmonar.

Resumen

Se sintetizó una sonda de imagen molecular compuesta por nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIO) y anticuerpos superficiales de Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) para mejorar la sensibilidad a la toma de imágenes para la tuberculosis extrapulmonar (ETB). Una nanosonda SPIO fue sintetizada y conjugada con MtbsAb. La nanosonda sPIO-MtbsAb purificada se caracterizó utilizando TEM y NMR. Para determinar la capacidad de focalización de la sonda, las nanosondas SPIO-MtbsAb se incubaron con Mtb para ensayos de imágenes in vitro y se inyectaron en ratones inoculados por Mtb para la investigación in vivo con resonancia magnética (RM). La reducción de la mejora del contraste en la resonancia magnética (RM) de las células Mtb y THP1 mostró proporcional a la concentración de nanosondas SPIO-MtbsAb. Después de 30 minutos de inyección intravenosa de nanosondas SPIO-MtbsAb en ratones infectados por Mtb, la intensidad de la señal del sitio granulomatoso se mejoró por 14 veces en las imágenes de RM ponderadas por T2 en comparación con la de los ratones que recibieron inyección de PBS. Las nanosondas MtbsAb se pueden utilizar como una modalidad novedosa para la detección de ETB.

Introducción

A nivel mundial, la tuberculosis extrapulmonar representa una proporción significativa de los casos de tuberculosis (TB). Sin embargo, el diagnóstico de ETB a menudo se olvida o se retrasa debido a su insidiosa presentación clínica y el bajo rendimiento en las pruebas diagnósticas; los resultados falsos incluyen frotis de esputo negativos para bacilos ácidos rápidos, falta de tejido granulomatoso en histopatología o falta de cultivo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). En relación con los casos típicos, la ETB ocurre con menos frecuencia e implica poca liberación de los bacilos de Mtb. Además, generalmente se localiza en sitios de difícil acceso, como ganglios linfáticos, pleura y áreas osteoarticulares^1. Así, los procedimientos invasivos para la obtención de muestras clínicas adecuadas, lo que hace que la confirmación bacteriológica sea arriesgante y difícil, son esenciales^2,3,4.

Las pruebas de detección de anticuerpos disponibles comercialmente para la ETB no son fiables para la detección clínica debido a su amplia gama de sensibilidad (0,00-1,00) y especificidad (0,59-1,00) para todos los sitios extrapulmonares combinados⁵. Los ensayos de inmunospot ligado a enzimas (ELISPOT) para el interferón, la proteína filtrada de cultivo (CFP) y el objetivo antigénico del secretor temprano (ESAT) se han utilizado para diagnosticar la tuberculosis latente y activa. Sin embargo, los resultados varían entre diferentes sitios de la enfermedad para el diagnóstico de ETB^6,7,8. Además, la piel PPD (derivado de proteína purificada) y QuantiFERON-TB con frecuencia proporcionaron resultados falsos negativos⁹. QuantiFERON-TB-2G es un ensayo de reactividad inmune de sangre completa, que no requiere una muestra del órgano afectado y puede ser una herramienta de diagnóstico alternativa^6,10,11. Otros métodos de diagnóstico utilizados normalmente para la meningitis por tuberculosis, como la reacción en cadena de la polimerasa, siguen siendo demasiado insensibles a excluir con confianza el diagnóstico clínico^12,13. Estas pruebas convencionales demuestran información diagnóstica insuficiente para descubrir el sitio de infección extrapulmonar. Por lo tanto, se requieren clínicamente nuevas modalidades de diagnóstico.

La imagen molecular tiene como objetivo diseñar nuevas herramientas que puedan examinar directamente objetivos moleculares específicos de los procesos de la enfermedad in vivo^14,15. El óxido de hierro superparamagnético (SPIO), un agente de contraste de RMN ponderado por T2, puede mejorar significativamente la especificidad y sensibilidad de la resonancia magnética (RM)^16,17. Esta nueva modalidad de imagen funcional puede esbozar con precisión los cambios de tejido a nivel molecular a través de interacciones ligando-receptor. En este estudio, se sintetizó una nueva sonda de imágenes moleculares, que comprende nanopartículas SPIO, para conjugar con el anticuerpo de superficie Mtb (MtbsAb) para el diagnóstico de ETB. Las nanosondas SPIO son mínimamente invasivas para los tejidos y cuerpos bajo examen^18,19. Además, estas nanosondas pueden demostrar imágenes mr precisas a bajas concentraciones debido a sus propiedades paramagnéticas. Además, las nanosondas SPIO aparecen que son menos alérgicas porque la presencia de iones de hierro es parte de la fisiología normal. Aquí, la sensibilidad y especificidad de las nanosondas SPIO-MtbsAb dirigidas a ETB se evaluaron tanto en modelos celulares como animales. Los resultados demostraron que las nano sondas eran aplicables como agentes de imágenes ultrasensibles para el diagnóstico de ETB.

Protocolo

Todo protocolo relativo al experimento con animales sigue los procedimientos operativos estándar para la cría de animales de laboratorio de acuerdo con las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8a Edición, 2011) y está aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales.

1. Síntesis de nanopartículas SPIO

1. Preparar nanopartículas magnéticas de óxido de hierro recubiertas de dextran agitando vigorosamente una mezcla de dextran T-40 (5 mL; 50% p/p) y soluciones acuosas de FeCl₃x 6H₂O (0,45 g; 2,77 mmol) y FeCl₂x 4H₂O (0,32 g; 2,52 mmol) a temperatura ambiente.
2. Añadir NH₄OH (10 mL; 7.5% v/v) rápidamente.
3. Agitar aún más la suspensión negra durante 1 h; posteriormente, centrífuga a 17.300 x g durante 10 minutos y luego eliminar los agregados.
4. Separe los productos SPIO finales de la dextranT T-40 sin consolidar mediante cromatografía de filtración en gel²⁰.
5. Cargue la mezcla de reacción (volumen total de 5 ml) en una columna de 2,5 cm a 33 cm y eluya con una solución tampón que contenga 0,1 M de acetato de Na y 0,15 M de NaCl a pH 7,0.
6. Recoger las nanopartículas magnéticas de óxido de hierro recubierto de dextran purificado en el volumen vacío y ensayo los eluatos de columna para hierro y deextran a 330 y 490 nm mediante el uso de ácido clorhídrico y los métodos de fenol/ácido sulfúrico²⁰, respectivamente.

2. Síntesis SPIO-MtbsAb

1. Sintetizar EDBE conjugado por SPIO utilizando los métodos^21,22.
2. Sintetizar anhydrida SPIO-EDBE-succínico (SA).
   1. Revuelva una solución alcalina (5 M NaOH; 10 mL)) de SPIO-EDBE y SA (1 g; 10 omol) a temperatura ambiente durante 24 h.
   2. Dialyze la solución con 20 cambios de 2 L de agua destilada utilizando tubos de membrana molecular porosa (12.000-14.000 MW de corte). 6 h por cada cambio.
3. Por último, añadir 100 l de SPIO-EDBE-SA (4 mg/ml de Fe) a 400 éL de 4,5 mg/ml de MtbsAb para sintetizar SPIO-MtbsAb utilizando 1-hidroxibenzotriazol y (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluoro como catalizador y agitar la solución de la sala de 24.
4. Por último, separe las soluciones del anticuerpo no unido mediante cromatografía de filtración en gel.
5. Cargue la mezcla de reacción (5 ml) en una columna de 2,5 cm a 33 cm y eluda con un búfer PBS. Confirme el complejo Ab-nanopartículas (es decir, nanosonda) utilizando un kit de ensayo de proteína de ácido bicinhiniico²³.

3. Observación de la morfología de las partículas y medición del nivel de relajación

1. Examine el tamaño medio de las partículas, la morfología y la distribución del tamaño utilizando un microscopio electrónico de transmisión a una tensión de 100 kV.
   1. Coloque la dispersión compuesta en una rejilla de cobre de 200 mallas y seque al aire a temperatura ambiente antes de cargarla en el microscopio.
2. Mida los valores de tiempo de relajación (T₁ y T₂) de las nano sondas utilizando el relajanteómetro de RMN a 20 MHz y 37,0 oC a 0,1 oC.
   1. Calibre el relajanteómetro antes de cada medición.
   2. Registre los valores r₁ y r₂ de los ocho puntos de datos generados a través de la inversión-recuperación y la secuencia de pulsos Carr-Purcell-Meiboom-Gill, respectivamente, para determinar r₁ y r₂ relaxivities²⁰.

4. Imágenes celulares

1. Cultivar monocitos humanos THP-1 en RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10%, sulfato de gentamicina de 50 g/ml, 100 unidades/ml de penicilina G sódica, 100 g de sulfato de estreptomicina y 0,25 g/ml de fungizona en una incubadora de 5% de CO₂ a 37 oC.
2. Incubar nanosondas SPIO-MtbsAb (2 mM) con 10⁶ unidades formadoras de colonias (CFU) de Mycobacterium bovis BCG preincubado con 1 x 10⁷ monocitos activados en tubos de microcentrífuga (1 ml) en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 oC durante 1 h.
3. Tubos centrífugos a 200 x g y desechar el sobrenadante. Volver a disolver los gránulos en el medio (200 l).
4. Escanee las muestras utilizando una secuencia de pulsos de eco de gradiente rápido (Tiempo de repetición (TR) a 500; Tiempo de eco (TE) á 20; Gire el ángulo de 10o) a través de una resonancia magnética de 3,0 T para determinar la especificidad y sensibilidad de la nanosonda^21,22.

5. BcG (Bacillus Calmette–Guérin) inoculación

1. Reconstituir la vacuna liofilizada o el stock bacteriano en el medio de Sauton y luego diluir la población con salina hasta que se disperse adecuadamente como se describió anteriormente²⁴.
2. Inocular una cepa viva atenuada de M. bovis BCG, obtenida de ADIMMUNE (Taipei, Taiwán) (cepa connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) a un volumen de 0,1 ml/ratón (es decir, 10⁷ CFU) intrador en la piel escapular dorsal izquierda o derecha de los ratones, como se describió anteriormente²³. Inyecte salina en ratones como control negativo. Monitoree a los animales diariamente después de la inoculación de BCG.
3. Sacrificar animales 1 mes después de la inoculación de bacterias utilizando eutanasia de dióxido de carbono. Extraer el tejido del sitio de inoculación intradérmica. Fijar el tejido en 10% de formalina e incrustar en parafina para secciones en serie a 5-10 m. Secciones de tejido de mancha con las manchas de hematoxilina/eosina y Ziehl-Neelsen para bacterias ácidas^{rápidas 24} y con azul berlinés para hierro férrico²⁵.

6. RMN in vivo

1. Inyectar ketamina (80 mg/kg de peso corporal) y xilazina (12 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea en ratones para la anestesia animal.
2. Inyectar sondas SPIO-TbsAb (2 nmol/200 l) en las venas de la cola de los ratones. Imágenes de RM nórfusiones antes e inmediatamente después de la inyección de la sonda y luego cada 5 minutos durante 30 minutos para adquirir imágenes de eco de giro rápido ponderadas en T2 (TR a 3000; TE 90; campo de visión n.o 8).
3. Analizar cuantitativamente todas las imágenes de RM utilizando intensidad de señal (SI), una medición de regiones definidas de interés en lugares comparables de un centro de granuloma Mtb y el músculo posterior adyacente a un área granulomatosa.
4. Calcular mejoras de señal relativas utilizando la medición SI antes (SIpre; control) y 0-3 h después de la inyección (SIpost) de los agentes de contraste utilizando la fórmula
   
   [(SIpost - SIpre)/SIpre] á 100
   
   donde SIpre es el SI de la lesión en la exploración pre-mejorada y SIpost es el SI de la lesión en la exploración post-mejorada^21,22.

Resultados

Síntesis y caracterización de nanosondas SPIO-MtbsAb
Las nanopartículas SPIO fueron diseñadas para conjugar con MtbsAb. El dextran estabilizado en la superficie de las nanopartículas SPIO fue reticulado por epiclorohydrin. Posteriormente se incorporaron nanopartículas SPIO con EDBE para activar grupos funcionales de amina primaria en los extremos de la dextran. SA fue conjugada para formar SPIO-EDBE-SA. Las nanosondas SPIO-MtbsAb se formaron en el último paso a través de la conjugación de Mtb...

Discusión

Al igual que en estudios relevantes, nuestros hallazgos sobre nanosondas SPIO-MtbsAb demostraron una especificidad significativa para Mtb^27,28. El granuloma subcutáneo de Mtb se encontró 1 mes después de la inyección de tuberculosis en los modelos de ratón. Los hallazgos típicos de la histología granulomatosa de tuberculosis incluyeron infiltración de linfocitos, presencia de macrófagos epitelioides y neovascularización. Los bacilos ácidos rápidos se ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate	Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole	Sigma-Aldrich
dextran(T-40)	GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine)	Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate	Fluka
ferrous chloride tetrahydrate	Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG	Pasteur Mérieux	Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI	GE medical Systems	3.0-T, Signa
NH4OH	Fluka
NMR relaxometer	Bruker	NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300	GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25	GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off	Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb	Acris Antibodies GmbH	BP2027
transmission electron microscope	JEOL	JEM-2000 EX II