Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ونشاطر هنا، أساليب لقياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية، تعريف مفهوم علم الطاقة الغذائية، وتسرب بروتون، السبب الرئيسي لعدم الكفاءة في جيل الميتوكوندريا من ATP. هذه النتائج يمكن أن تمثل 30 في المائة الطاقة المفقودة في استخدام المواد الغذائية للمساعدة في تقييم الوظيفة المتقدرية.

Abstract

استهلاك الأوكسجين، دافع بروتون القوة (تحلان) وتسرب بروتون قياسات التنفس المتقدرية، أو مدى الميتوكوندريا قادرة على تحويل ATP NADH والقوات المسلحة الهايتية. منذ الميتوكوندريا هي أيضا الموقع الأساسي لاستخدام الأوكسجين والمغذيات الأكسدة إلى ثاني أكسيد الكربون والماء، مدى فعالية استخدام الأوكسجين، وإنتاج ATP مباشرة تتصل بكفاءة الأيض المغذيات، المتطلبات الغذائية من الحيوان، و صحة الحيوان. والغرض من هذا الأسلوب هو فحص التنفس المتقدرية، التي يمكن استخدامها لدراسة آثار المخدرات المختلفة، والوجبات الغذائية والآثار البيئية على الأيض المتقدرية. وتشمل النتائج استهلاك الأوكسجين قياس التنفس يتوقف بروتون (3 الدولة) وبروتون تسرب تعتمد التنفس (4 الدولة). يعرف بأنه نسبة التحكم الجهاز التنفسي (آر) نسبة التنفس الدولة 4 (3) الدولة ويمكن أن تمثل كفاءة حيوية المتقدرية. تسرب بروتون المتقدرية هي عملية تسمح تبديد للغشاء الميتوكوندريا المحتملة (MMP) يفصل الفسفرة من ADP تناقص كفاءة توليف ATP. تستخدم أقطاب حساس الأكسجين وترمب + مع ركائز mitochondrial ومثبطات سلسلة نقل الإلكترون لقياس الدولة 3 و 4 حالة التنفس، غشاء الميتوكوندريا تحلان (أو يمكن أن تنتج ATP) وتسرب بروتون. القيود على هذا الأسلوب هي أن نسيج الكبد يجب أن تكون طازجة قدر الإمكان ويجب تنفيذ جميع خزعات وفحوصات في أقل من 10 ح. وهذا يحصر عدد العينات التي يمكن جمعها ومعالجتها بواسطة شخص واحد في يوم واحد لحوالي 5. ومع ذلك، مطلوب 1 جرام فقط من أنسجة الكبد، حتى في الحيوانات الكبيرة، مثل الأبقار الحلوب، كمية العينة المطلوبة صغيرة بالنسبة لحجم الكبد، وهناك القليل من الوقت الانتعاش اللازم.

Introduction

الميتوكوندريا حساسة للغاية للتأكيد وبيئتها الخلوية يمكن أن تسهم في مجموعة متنوعة واسعة من الأمراض الأيضية. استهلاك الأوكسجين وتسرب بروتون في الميتوكوندريا مؤشرات الصحة الميتوكوندريا. الطرق الموضحة في هذه الورقة كفاءة الطاقة المتقدرية تقدير استخدام آر استناداً إلى استهلاك الأوكسجين مع أو بدون تسرب بروتون. هذه النتائج يمكن أن تمثل 30 في المائة الطاقة المفقودة في استخدام المغذيات1. يمكن تحديد التغييرات في الاستهلاك وبروتون تسرب الأوكسجين خلل mitochondrial الذي يساهم في الأمراض الأيضية وتؤدي إلى انخفاض الطاقة الكفاءة. يمكن أيضا استخدام هذه الأساليب دراسة تأثير العلاجات المختلفة في التنفس المتقدرية. والهدف العام لقياس استهلاك الأوكسجين mitochondrial وحركية تسرب بروتون تقييم الوظيفة المتقدرية وكفاءة حيوية.

خلل المتقدرية الكبدية ارتبطت بالعديد من الأمراض في الأبقار الحلوب. تتأثر قدرة الأيض الخلوية للتبديل بين أنواع الوقود الكربوهيدرات والدهون عندما تواجه بعجز الطاقة في الرضاعة المبكرة بعدد ووظيفة الميتوكوندريا في الخلية2. العيوب الموجودة في الميتوكوندريا قادرة على التكيف مع زيادة طلب على الطاقة وزيادة بيتا--الأكسدة يمكن أن يؤدي إلى تراكم الدهون داخل الخلايا المرتبطة بمقاومة الأنسولين ويمكن أن يؤدي إلى تشكيل الكبد الدهني في الأبقار الحلوب الرضاعة المبكرة. الميتوكوندريا، كموقع هيئة كيتون الإنتاج والاستخدام، يمكن أن تلعب دوراً رئيسيا في الكيتوزيه في الأبقار الحلوب3. الافتقار إلى الميتوكوندريا أو خلل mitochondrial سوف تؤثر على توافر الوقود إلى الهامش، وتنعكس في التغيرات في استهلاك الأكسجين أو آر.

التغييرات استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا استجابة لالتهاب. دجاجة عمره سبعة أيام تم عشوائياً إلى مجموعة المصابين مع ماكسيما ايميريا و مجموعة تحكم4. الفراريج التي لم تطرأ التحدي الكوكسيديا قد خفض استهلاك الأكسجين بسبب تسرب بروتون وار أعلى مما يشير إلى أن الميتوكوندريا الكبد الاستجابة لتحدي منأى بزيادة بروتون تسرب. حين تسرب بروتون ورد الفعل إنتاج الأنواع الأوكسجين كان يعتبر علامة على الخلل في غشاء الميتوكوندريا وتضر بكفاءة حيوية، الآن ومن المعروف أن من المهم للبروتينات والكالسيوم استيراد الميتوكوندريا5 ، ومن أجل توليد الحرارة1.

تسرب إلكترون من سلسلة التنفس يجعل الميتوكوندريا عرضه لإنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية والضرر التأكسدي للغشاء الميتوكوندريا والبروتينات، والدهون والحمض النووي. كما سن الميتوكوندريا، يمكن أن تتراكم الأضرار خاصة إلى متدنا تسبب مزيدا من الخلل في التمثيل الغذائي المتقدرية6 وقابلية أكبر للبقرة للمرض. في الممارسة العملية، ويتم تغذية العديد من المواشي الحيوانات مستويات عالية من المكملات الغذائية مثل النحاس والزنك ومينيسوتا لتعزيز وظيفة المضادة للأكسدة. ومع ذلك، تغذية مستويات عالية من النحاس، الزنك والمنغنيز انخفاض إنتاج الحليب وزيادة استهلاك الأكسجين بسبب بروتون تسرب (4 حالة التنفس)7.

البحوث السابقة بشأن دور الوظيفة المتقدرية في كفاءة استخدام الطاقة في الماشية تركز على التغيرات في استهلاك الأكسجين الميتوكوندريا وتسرب بروتون. وقد نشرت دراسات قليلة جداً في الأبقار الحلوب وأوراق معظم مقارنة كفاءة الإنتاج في شكل كمية الأعلاف المتبقية (آر إف أي) للوظيفة المتقدرية في الأبقار. تقلب في التنفس المتقدرية بحثت معدلات قياس الدولة 3، 4 وار في كبد من بقرة هولشتاين الحوامل والمرضعات من لحوم البقر الأبقار (انجوس، برانجوس وهيريفورد)8. الباحثون لم تجد أي علاقة في التنفس المتقدرية مع النمو أو الصفات للأبقار الحلوب ولكنها قدمت تقريرا علاقة بين التنفس المتقدرية وحلب الصفات الهولشتاين. في دراستين، تمت مقارنة RFI في الأبقار إلى معدلات التنفس المتقدرية (الدولة 3، الدولة 4 وار) في العضلات الميتوكوندريا9،10. تغيير معدلات التنفس المتقدرية ردا على DMI وانخفاض معدلات كانت ترتبط بأقل كفاءة من يرسم لحوم البقر. وفي دراسة أخرى، قورنت RFI ليرسم من الثيران آر إف أي ارتفاع أو انخفاض معدلات التنفس المتقدرية وبروتون تسرب حركية بين هاتين المجموعتين من ذرية11. وتعزى الاختلافات مكسب يؤكد الاستنتاج بأن اكتساب عدم تأثير التنفس المتقدرية في الأبقار.

في هذه الورقة، وتجربة دراسة الكبد سي ردا على تغذية 3 المضادة للأكسدة المعادن المرضعات ماشية الألبان يوضح استخدام أساليب لقياس استهلاك الأوكسجين أثناء الدولة 4 و 3 التنفس وتحلان.

Protocol

جميع الأساليب والبروتوكول والدراسات الموضحة هنا بموافقة "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة كاليفورنيا في ديفيز.

1-الحصول على عينة من كبد من بقرة هولشتاين الألبان

ملاحظة: ينبغي إجراء خزعة كبد بطبيب بيطري مرخص. يمكن إجراء خزعات الكبد على الموقع الألبان حيث توجد الأبقار. الأبقار الحلوب المرضعات يمكن الاستمرار في أن تكون حلب عادة والحليب لا تحتاج إلى أن تنسحب من الإمدادات الغذائية قبل أو بعد الإجراء. من المستحسن أن مالا يقل عن 4 أشخاص هناك حاجة لإجراء خزعة الكبد على بقرة الألبان: طبيب بيطري لإجراء الخزعة، معالج حيوان على الوقوف في الورك أن البقرة لحماية منطقة خزعة وطبيب بيطري، فني مختبر في خارج القلم إلى ترانسف أية أدوات ومواد وخزعة عينة من الطبيب البيطري والحفاظ على المنطقة نظيفة، الذي يمكن أن يكون في الجزء الخلفي من سيارة (الشكل 1)، وفني لاسترداد عينة الكبد وتبدأ العزلة المتقدرية.

  1. شهر واحد قبل خزعات الكبد، الأبقار تعطي تطعيم كلوستريديا. إنشاء حزم الجراحية مناشف التعقيم الجراحي، وصك خزعة، أصحاب مشرط والمعدات الجراحية.
  2. خزعة الكبد، قبل يوم واحد من حقن البقرة هيدروكلوريد سيفتيوفور 0.044 مل/كغ وزن الجسم تحت الجلد في الرقبة. رصد درجة الحرارة البقر والمدخول وعشرات البراز لاستخدامها كخط أساس لوظيفة طبيعية.
  3. إنشاء الميتوكوندريا العزلة الإعلامية (ميم) كونتينينينج 220 مم المانيتول، السكروز 70 ملم، 20 ملم حبيس ويدتا 1 ملم 0.1% (w/v) الأحماض الدهنية الحرة BSA، درجة الحموضة 7.4 في 4 درجات مئوية. ستكون هناك حاجة إلى حوالي 30 مل كل عينة.
  4. كبح جماح البقر فعلياً استخدام headlock مع هالتر حسب الحاجة (الشكل 2). استخدام الرسن، ربط رأسها إلى الجانب الأيسر من ستانتشيون. إذا لزم الأمر، ضبط النفس كيميائية (إكسيلازيني هيدروكلوريد 100 مغ/مل الرابع في 0.010-0.015 مغ/كغ وزن الجسم) يمكن استخدامها.
  5. تم العثور على مجال عينة في حق 10 11 المساحة ربية (الشكل 3). رسم خط مستقيم من الورك درنة الحق إلى نقطة الكتف الأيمن. الموقع خزعة حيث يتقاطع هذا الخط مع مساحة ربية 10 11. تعقيم منطقة البقر أن فحص بحلق منطقة مربعة 10 سم (الشكل 4). تغسل المنطقة بنسبة 10 في المائة بروفيدوني فرك (الشكل 5) باستخدام حركة دائرية. رش المنطقة بمحلول الإيثانول 70% (الشكل 6). كرر يغسل بروفيدوني والإيثانول.
    ملاحظة: الكبد في موقف مختلف قليلاً في هولشتاين ماشية الألبان مقارنة بالابقار.
  6. حقن ليدوكائين 2% HCl (10-15 مل) محلياً إلى المنطقة لتقديم التخدير من الجلد والعضلات والنسيج الضام (الشكل 7) الأساسية. كرر بروفيدوني ويغسل إيثانول 70%.
    ملاحظة: النهايات العصبية في الجلد والعضلات، ولكن الأجهزة الداخلية لا، ذلك إلا محلي أنيسثيستيك المسبق. على الأكثر، البقرة ينبغي إلا تشعر ببعض الضغوط ولا الألم أثناء إجراء خزعة.
  7. جعل شق طعنه سم 1-2 عن طريق جلد الفضاء ربية 10 11 (الشكل 8). تمرير أداة خزعة كبد بقرى كورتني شاكيلفورد عن طريق الجلد والمباشرة في الصك خزعة في اتجاه الجمجمة طفيفة بينما تواصل من خلال الحجاب الحاجز وفي الكبد (الشكل 9، الرقم 10). الحصول على عينة 1 غ من الكبد وإزالة هذا الصك (الشكل 11). إغلاق الجلد بخياطة التنسيب (الشكل 12).
  8. ضع عينة الكبد في أنبوب مخروطي مع الفلز كافية لتغطية عينة، على الجليد للعزل الفوري الميتوكوندريا
  9. شق الاختيار لأي احمرار، تورم، الحرارة، أو ألم في غضون 24 ساعة خزعة وحقن البقرة هيدروكلوريد سيفتيوفور 0.044 مل/كغ وزن الجسم تحت الجلد في الرقبة مرة واحدة في يوم لمدة 3 الأيام (الشكل 13). رصد درجة الحرارة أن البقرة والمدخول وعشرات البراز يوميا لمدة أسبوع واحد بعد خزعة الكبد. إذا كان يطور حمى، تواصل المضادات الحيوية بناء على تقدير الطبيب البيطري.
    ملاحظة: إذا كان هذا يعرض بقرة علامات الألم، مثل الركل في موقع شق، ريكومبانسي، والاحمرار، والحرارة، أو رد فعل للمس ضمن ح 1 بعد خزعة الكبد، يمكن استخدام حقنه رابعا 1 مغ/كغ وزن الجسم من ميجلوميني فلونيكسين لتخفيف الألم والالتهاب. يمكن أن تدار حقن ثاني إذا لزم الأمر.
  10. إزالة خيوط 7 أيام بعد خزعة.

2-عزل الميتوكوندريا من البقرة الحلوب الكبد

  1. وقت ممكن بعد إزالة عينة الكبد من البقرة، يغسل عينة الكبد في الفلز (الخطوة 1.3) إزالة خلايا الدم الحمراء وفرم ناعما العينة مع المقص. ينبغي أن يكون مفروم الكبد في كوب مبردة تحتوي على وسائط العزلة ما يكفي للحفاظ الأنسجة الرطبة.
  2. وضع الكبد المفروم في قنينة زجاج 30 مل مع مدقة تفلون إزالة 0.16 مم المحتضنة في الجليد، ويحتوي على الفلز (1:4 w/v).
  3. مجانسة عينة الكبد في مدقة تفلون 500 لفة في الدقيقة لدقيقة مع السكتات الدماغية الدقيقة 4.
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ هوموجيناتي الكبد في الكأس وجبات الجليد في الفلز أثناء العملية برمتها، ويتم إكمال كافة الخطوات التالية استخدام الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية
  4. الطرد المركزي هوموجيناتي في 500 غرام x لمدة 10 دقائق، وتجاهل بيليه، نقل المادة طافية إلى أنبوب الطرد مركزي المبرد وثم الطرد المركزي الناتجة عن المادة طافية في س 10,000 ز لمدة 10 دقيقة للحصول على بيليه المتقدرية.
  5. ريسوسبيند وغسل بيليه في 10 مل الفلز مع الأحماض الدهنية الحرة جيش صرب البوسنة والطرد المركزي في غ س 8100 للمادة 10 دقيقة تجاهل طافية.
  6. ريسوسبيند وغسل بيليه في 10 مل الفلز دون الأحماض الدهنية الحرة جيش صرب البوسنة والطرد المركزي في غ س 8100 للمادة 10 دقيقة تجاهل طافية.
  7. تعليق بيليه في 200 ميليلتر من العزلة الإعلامية ووضع على الجليد حتى استخدامها لاستهلاك الأوكسجين وبروتون تسرب الاختبارات الحركية.
  8. تحديد تركيز البروتين من تعليق بيليه (تمييع 1/100) باستخدام مجموعة (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك الواحدة والبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة مع جيش صرب البوسنة كالمعيار. يعتبر جميع البروتين البروتين المتقدرية.

3-قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية (الدولة 4 3 والدولة)

  1. إنشاء وسائط استهلاك الأكسجين (OCM) من عيار 120 ملم بوكل، 5 مم خ2ص4، 5 مم مجكل2، حبيس 5 و 1 ملم عطا، درجة الحموضة 7.4 في 30 درجة مئوية مع 0.3% كاكاو جيش صرب البوسنة. ستكون هناك حاجة إلى حوالي 3 مل كل عينة. كما تعد حلاً من 8 ميكروغرام/مل أوليجوميسين في الإيثانول.
  2. احتضان OCM عند 30 درجة مئوية. إعداد قطب الدائرة وضخ الأكسجين تنفس وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة (نظام أوكسيجراف). البرنامج أوكسيجراف يجب أن تكون مثبتة بالفعل على جهاز الكمبيوتر.
  3. ضع 1 مل OCM داخل قاعة التنفس ويقلب بشدة. هذا سوف يساعد على ضمان أن الحل يصبح مشبعة بالهواء.
  4. إضافة البروتين 0.35 ملغ من البروتين المتقدرية إلى دائرة التنفس والحفاظ على درجة حرارة 30 درجة مئوية.
  5. تسجيل استهلاك الأكسجين لمدة 5 دقائق تقريبا. الزيادات التنفس، وتركيز الأكسجين وذلك يقلل تركيز الأوكسجين سجلات النظام أوكسيجراف. عندما يصبح استهلاك الأكسجين ثابت (خط مستقيم متناقص)، استهلاك الأكسجين السجل (منحدر خط = تركيز الأكسجين/الزمنية). وهذا الأساس استهلاك الأوكسجين.
  6. إضافة ميليلتر 1.25 من 4 مم والروتينون حل لتمنع مجمع أنا ثم قم بإضافة 5 ميليلتر م 1 سوكسيناتي حل للتوصل إلى تركيز نهائية في قاعة التنفسية succinate 5 ملم. هذا هو التنفس الدولة 4.
  7. أضف 1 ميليلتر من 100 ملم ADP الحل للوصول إلى تركيز نهائية في قاعة التنفس من 100 ميكرومتر. سوف ينخفض تركيز الأكسجين (زيادة التنفس) ومن ثم بعد حوالي 5 دقائق يصبح خط مستقيم. تسجيل استهلاك الأكسجين (منحدر خط = تركيز الأكسجين/الزمنية). هذا هو التنفس 3 الدولة.
  8. اختياري: في نهاية الشوط، إضافة فككب (الحجم الإجمالي 0.2 ميكرومتر) للحث على التنفس القصوى. تسجيل التنفس لمدة حوالي 5 دقائق (تقريبا). عندما يصبح استهلاك الأوكسجين استهلاك الأوكسجين المستمر، وسجل. هذا استهلاك الأوكسجين القصوى.
  9. حساب نسبة التحكم الجهاز التنفسي (آر) باستخدام معادلة الاستهلاك الأكسجين 3 الدولة/الولاية 4 استهلاك الأوكسجين.
  10. نضح كافة الحلول خارج قاعة التنفس. شطف الدائرة عدة مرات مع المياه مزدوجة.

4-قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) والقوة المحركة بروتون (تحلان)

  1. إعداد حل نيجيريسين نانوغرام/مليلتر 80 في الإيثانول.
    ملاحظة: يتم حل هذه المواد الكيميائية في الإيثانول، وينبغي بذل كل جهد ممكن للحد من الكمية الإيثانول التي يتم إضافتها إلى أقل من 1 ميكروليتر، حيث يمكن فصل نظام نقل الإلكترون الإيثانول وتسبب الخلل في ميتشوندريال.
  2. بعد دقة الشطف الدائرة مع المياه مزدوجة، ضع 1 مل من OCM في قاعة التنفس ويقلب بقوة مع شريط إثارة مغناطيسية. هذا سوف يساعد على ضمان أن الحل يصبح مشبعة بالهواء. إضافة الميثيل-ثلاثي فينيل-فوسفونيوم (تبمب +) الحساسة الكهربائي الدائرة الإعداد. يجب أن تكون متصلاً تبمب + القطب مقياس الأس الهيدروجيني وتتم قراءة القيم من مقياس الأس الهيدروجيني.
  3. إضافة 0.35 ملغ بروتين المتقدرية إلى دائرة التنفس.
  4. إضافة ميليلتر 1.25 من 4 مم والروتينون حل تعوق التنفس "المعقدة أولاً السجل" لمدة 2-5 دقائق (تقريبا). عندما يصبح استهلاك الأوكسجين استهلاك الأوكسجين المستمر، وسجل.
  5. إضافة ميكروليتر 0.56 ميكروغرام/مل 8 أوليجوميسين حل لتركيز نهائي من 2.8 ميكروغرام أوليجوميسين 0.35 ملغ بروتين المتقدرية تحول دون استغلال ADP. تسجيل التنفس لمدة 2-5 دقائق (تقريبا). عندما يصبح استهلاك الأوكسجين استهلاك الأوكسجين المستمر، وسجل.
  6. إضافة ميكروليتر 0.112 80 نانوغرام/مل نيجيريسين حل لإلغاء التدرج درجة الحموضة عبر الغشاء الداخلي المتقدرية. تسجيل التنفس لمدة 2-5 دقائق (تقريبا). عندما يصبح استهلاك الأوكسجين استهلاك الأوكسجين المستمر، وسجل.
    ملاحظة: يتم استخدام والروتينون وأوليجوميسين لكتلة الإلكترون النقل سلسلة في المجمع الأول و ATP synthase، على التوالي. نيجيريسين إضافة إلى تحويل transmembrane H + التدرج على تدرج K + الذي يمكن أن يقاس مع قطب كهربائي.
  7. إعداد منحنى قياسي لتبمب + بإضافة 5 ميليلتر من 10 مم تبمب + الحل للاحتضان المتقدرية. كرر هذه الخطوة أربع مرات أكثر حتى تم إضافة مجموع تركيز 2.5 ميكرومتر تبمب +.
  8. بدء التنفس بإضافة 5 ميكروليتر من سوكسيناتي م 1 للدائرة.
  9. سجل التنفس حتى حققت عملية تتبع مستقرة، ومن ثم تيتراتي النظام بإضافة مالوناتي. ينبغي أن تكون إضافات مالوناتي 0.5 ميليلتر، 1 ميليلتر، ميليلتر 1.5, 3.0 ميليلتر، ميليلتر 6.0، 9.0 ميليلتر, ثم 12.5 ميليلتر من 0.1 مالوناتي حل لتحقيق إضافات متتالية من تركيزات مالوناتي في غرفة الحضانة من 0.1، 0.2، 0.3، 0.6، 1.2، 1.8، و 2.5 ملم.
  10. جمع البيانات من قطبين (الأوكسجين وتبمب+). يمكن استخدام برامج الحصول على البيانات من نظام أوكسيجراف لجمع قياسات متزامنة لاستهلاك الأكسجين الميتوكوندريا وغشاء الميتوكوندريا المحتملة، ومراقبة التغيرات في استهلاك الأوكسجين في الوقت الحقيقي. ويبين الشكل 14 كيف يسجل النظام أوكسيجراف استهلاك الأوكسجين كما تقدم التجربة.
  11. حساب نظام التمثيل التناسبي المختلط في المتوسط استناداً إلى المعادلة] [نرنست]:
    نظام التمثيل التناسبي المختلط = 61.5 سجل ([+ تبمب] وأضاف – الخارجية [+ تبمب]) تصحيح ملزمة x TPMP+/(0.001 x ملغ من البروتين/mL x [+ تبمب])
    يتم استخدام تصحيح ربط تبمب + 0.4 ميليلتر/ملغ من البروتين المتقدرية-1 .
    مثال على حساب استناداً إلى التركيزات في البروتوكول:
    نظام التمثيل التناسبي المختلط = 61.5 سجل س (5 ميكرون – 2 ميكرومتر) × 0.4/(0.001 × 0.35 ملغ المتقدرية البروتين/مل x 2 ميكرومتر)
    نظام التمثيل التناسبي المختلط = 198.9 mV
  12. تقدير تحلان برسم رسم بياني لنظام التمثيل التناسبي المختلط مقابل استهلاك الأوكسجين (الشكل 15). تحلان لم تبلغ عن استهلاك الأكسجين في إمكانات غشاء 165 mV.
    ملاحظة: المعايرة في سلسلة نقل الإلكترون مع مالوناتي (0.1 إلى 2.5 ملم) يظهر الاستجابة الحركية لتسرب بروتون لنظام التمثيل التناسبي المختلط. ثم، التآمر MMP ضد استهلاك الأوكسجين يحدد البروتون تسرب حركية. يتحدد تحلان بحساب استهلاك الأكسجين في غشاء مشتركة محتملة (165 mV).
  13. في نهاية الشوط الأخير من العينة، إضافة فككب (الحجم الإجمالي 0.2 ميكرومتر) للحث على التنفس القصوى وإطلاق سراح تبمب + لتصحيح خط الأساس.
  14. نضح كافة الحلول خارج قاعة التنفس. شطف الدائرة عدة مرات مع المياه مزدوجة. في نهاية اليوم، الدائرة ينبغي أيضا أن تشطف عدة مرات مع الإيثانول.

النتائج

وترد نتائج إيجابية تظهر حركية تسرب آر وبروتون في الجدول 1 و الشكل 15، على التوالي. في تسرب7وار والبروتين في هذه الدراسة تم قياس حركية في هولشتاين الأبقار الحلوب في 70 يوما في الحليب بعد قد تم تغذية الأبقار 1 5 مستويات مختلفة من النحاس وال...

Discussion

معظم النقطة الحرجة في البروتوكول هو الحصول على عينة تمثيلية من أنسجة كبد وبداية عزلة الميتوكوندريا، في أقرب وقت ممكن بعد خزعة. التباين في قياسات التنفس المنخفض (الجدول 1) بسبب وقت نقل قصيرة من البقرة إلى مختبر. لتقليل وقت النقل، أنشئ مختبر صغير في المكتب لمنتجات الألبان، وطردوا كب...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيد هذا البحث الأموال اللتيتش وتظليل وزارة الزراعة من خلال المركز "الصحة الحيوانية الأغذية" في جامعة كاليفورنيا ديفيس مدرسة الطب البيطري.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrumentSontec Instruments Englewood CO1103-904
SutureFisher Scientific19-037-516
Suture needlesNANAIncluded with Suture
ScalpelsSigma - AldrichS2896 / S2646# for handle and blades
Surgery towelsFisher Scientific50-129-6667
Falcon tubes 50 mLFisher Scientific14-432-22
TweezersSigma - AldrichZ168750
50 mL syringesFisher Scientific22-314387
Injection needles (22, 2 1/2)VWRMJ8881-200342
Cow halterTractor Supply Co.101966599
Cotton swabbingFisher Scientific14-959-102
cotton gauze squares (4x4)Fisher Scientific22-246069
Medical scissorsSigma - AldrichZ265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cowProvided by Veterinarian
Clostridia VaccineProvided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 daysProvided by Veterinarian
Providone ScrubAspen Veteterinary Resources21260221
Ethanol 70%Sigma - Aldrich793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweightProvided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL)Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumineProvided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearanceFisher Scientific02-911-527
Homogenizer MotorCole ParmerEW-04369-10
Homogenizer ProbeCole ParmerEW-04468-22
Auto Pipette (10 mL)Cole ParmerSK-21600-74
Beaker (500 mL) with iceFisher ScientificFB100600
Refrigerated microfugeFisher Scientific75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL)Fisher ScientificAM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)abcamab102536
SucroseSigma - AldrichS7903-1KG
Tris-HClSigma - AldrichT1503-1KG
EDTASigma - AldrichEDS-1KG
BSA (fatty acid free)Sigma - AldrichA7030-50G
MannitolSigma - AldrichM4125-1KG
Deionized waterSigma - Aldrich38796
HepesSigma - AldrichH3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrodeHansatech (PP Systems)OXY1
Thermoregulated Water PumpADInstrumentsMLE2001
Clark type Oxygen electrodeNANA
Autopipette (1 mL)Cole ParmerSK-21600-70Included with Oxy1
Small magnetic stir barFisher Scientific14-513-95
Micropipette (10 μL)Cole ParmerSK-21600-60
pH meterVWR
Chemicals
KClSigma - AldrichP9333-1KG
HepesSigma - AldrichH3375-500G
KH2PO4Sigma - AldrichP5655-1KG
MgCl2Sigma - AldrichM1028-100ML
EGTASigma - AldrichE3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution)Sigma - AldrichR8875-5G
Succinate (1 M solution)Sigma - AldrichS3674-250G
ADP (100 mM solution)Sigma - AldrichA5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol)Sigma - Aldrich75351
FCCPSigma - AldrichC2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrodeWorld Precision Instruments.DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution)Sigma - AldrichM1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezerSigma - Aldrich75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezerSigma - AldrichN7143
FCCPSigma - AldrichC3920
TPMPSigma - AldrichT200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA

References

  1. Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
  2. Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
  3. Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
  4. Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
  5. Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
  6. Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
  7. Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
  8. Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
  9. Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
  10. Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
  11. Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
  12. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).
  13. National Research Council. . Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).
  14. Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
  15. Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
  16. Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
  17. Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
  18. Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
  19. Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
  20. Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
  21. Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141 Mitochondrial 3 4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved