荷尔斯坦奶牛肝线粒体耗氧量和质子泄漏动力学评价线粒体呼吸

摘要

在这里, 我们分享测量线粒体耗氧量的方法, 营养能量学的一个决定性概念, 和质子泄漏, 这是线粒体产生 atp 效率低下的主要原因。这些结果可以占营养利用损失能量的 30%, 以帮助评估线粒体功能。

摘要

耗氧量、质子动力 (pmf) 和质子泄漏是线粒体呼吸的测量, 或线粒体能够将 nadh 和 fadh 转化为 atp 的程度。由于线粒体也是氧气使用和营养氧化的主要场所, 二氧化碳和水, 他们如何有效地使用氧气和产生 atp 直接关系到营养代谢的效率, 动物的营养需求,动物的健康。该方法的目的是检查线粒体呼吸, 可用于检查不同药物、饮食和环境对线粒体代谢的影响。结果包括作为质子依赖性呼吸 (状态 3) 测量的耗氧量和质子泄漏依赖性呼吸 (状态 4)。国家 3/状态4呼吸的比例被定义为呼吸控制比 (rcr), 可以表示线粒体的能量效率。线粒体质子泄漏是通过从 adp 中分离氧化磷酸化来消除线粒体膜电位 (mmp) 的过程, 从而降低了 atp 合成的效率。氧和 trmp + 敏感电极与线粒体底物和电子传输链抑制剂被用来测量状态3和状态4呼吸, 线粒体膜 pmf (或产生 atp 的潜力) 和质子泄漏。这种方法的局限性是肝脏组织必须尽可能新鲜, 所有活检和检测必须在不到10小时内进行。这将一个人一天可以收集和处理的样本数量限制在大约5个。然而, 只需要1克的肝脏组织, 所以在大型动物, 如奶牛, 所需的样本量是小的相对于肝脏大小, 几乎不需要恢复时间。

引言

线粒体对压力非常敏感, 它们的细胞环境会导致多种代谢疾病。线粒体中的耗氧量和质子泄漏是线粒体健康的指标。本文所描述的基于有质子泄漏和无质子泄漏的耗氧量的 rcr 估计线粒体能量效率的方法。这些结果可以占营养利用1所损失能量的 30%.氧气消耗和质子泄漏的变化可以识别线粒体功能障碍, 从而导致代谢疾病, 并导致能源效率下降。这些方法也可用于检查不同治疗方法对线粒体呼吸的影响。测量线粒体耗氧量和质子泄漏动力学的总体目标是评估线粒体功能和能量效率。

肝线粒体功能障碍与奶牛的几种疾病有关。早期泌乳时, 当面对能量不足时, 细胞代谢在碳水化合物和脂类燃料之间切换的能力受到细胞2中线粒体数量和功能的影响.线粒体适应能量需求增加和β氧化增加的能力存在缺陷, 可导致与胰岛素抵抗相关的细胞内脂质积累, 并可能导致早期哺乳奶牛脂肪肝的形成。线粒体作为酮体生产和使用的场所, 在奶牛³中的酮症中发挥着关键作用。线粒体或线粒体功能障碍的缺乏将影响外围燃料的供应, 并反映在氧气消耗或 rcr 的变化上。

线粒体耗氧量随炎症而变化。7天龄的肉鸡随机分为感染 eimeria 最大值的组和^{对照组 4}。没有经历过球虫病挑战的肉鸡由于质子泄漏而耗氧量较低, rcr 较高表明肝脏线粒体通过增加质子泄漏来应对免疫挑战。虽然质子泄漏和活性氧的产生曾经被认为是线粒体膜功能障碍的表现, 对能量效率不利, 但现在大家都知道, 将蛋白质和钙导入线粒体^很重要。, 并为热^的产生1。

从呼吸链的电子泄漏使线粒体容易产生活性氧, 并对线粒体膜蛋白、脂质和线粒体 dna 造成氧化损伤。随着线粒体年龄的增加, 损伤尤其会积累到 mtdna 中, 导致线粒体代谢的进一步功能障碍, 并使奶牛对疾病的易感性更强。实际上, 许多牲畜动物被喂养高水平的补充剂, 如铜, 锌和锰, 以提高抗氧化功能。然而, 由于质子泄漏 (状态4呼吸), 摄入高水平的铜、锌和锰会减少牛奶产量, 增加耗氧量.

此前关于线粒体功能在牛能量效率中的作用的研究主要集中在线粒体耗氧量和质子泄漏的变化上。在奶牛中发表的研究很少, 大多数论文将剩余饲料摄入量 (rfi) 的生产效率与肉牛的线粒体功能进行了比较。通过测定哺乳期荷斯坦奶牛和哺乳牛牛 (安格斯、布拉古斯和赫里福德) 肝脏中的3、4和 rcr 状态, 检测线粒体呼吸速率的变异性.研究人员没有发现肉牛线粒体呼吸与生长或挤奶性状有任何相关性, 但确实报告了线粒体呼吸与霍尔斯坦挤奶性状之间的相关性。在两项研究中, 将牛牛的 rfi 与肌肉线粒体 9^、10的线粒体呼吸速率 (状态3、状态4和 rcr) 进行了比较。线粒体呼吸率随着 dmi 的变化而变化, 低呼吸率与效率较低的牛肉转向有关。在另一项研究中, 将高或低 rfi 公牛的蒸手的 rfi 与两组后代11之间的线粒体呼吸速率和质子泄漏动力学进行了比较.差异的原因是证实了增益不影响肉牛线粒体呼吸的结论。

本文通过一项实验, 对奶牛饲养3种抗氧化矿物质的肝脏 rcr 进行了研究, 阐述了用方法测量4号和3号州呼吸和 pmf 期间的耗氧量。

研究方案

这里描述的所有方法、协议和研究都得到了加州大学戴维斯分校动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。

1. 从荷斯坦奶牛获得肝脏活检

注: 肝脏活检应由有执照的兽医进行。肝脏活检可以在奶牛所在的乳品现场进行。哺乳奶牛可以继续正常挤奶, 牛奶不需要在手术前或手术后从食物供应中提取。建议至少需要4人在奶牛上进行肝脏活检: 一名兽医进行活检, 一名动物处理员站在奶牛的臀部保护活检区和兽医, 一名实验室技术人员在笔外进行转运和技术人员在车辆后部 (图 1) 和技术人员检索肝脏样本并开始线粒体隔离时, 可以在车辆后部保持清洁区域。

1. 在肝脏活检前一个月, 给奶牛接种梭菌疫苗。通过高压灭菌手术毛巾、活检仪器、手术刀架和手术设备创建手术包。
2. 在肝活检前一天, 给奶牛注射盐酸头孢菌在颈部皮下的重量 0.044 mL/kg。监测奶牛的体温、摄入量和粪便得分, 作为正常功能的基线。
3. 创建线粒体分离介质 (mM), 其中包含 220 mm 甘露醇、70 mm 蔗糖、20 mm hepes、1 mm edta 和 0.1% (w/v) 不含脂肪酸的 bsa, 在4°c 下 ph 7.4。每个样品大约需要30毫升。
4. 根据需要, 在物理上使用带吊环的头锁, 以身体上的方式约束奶牛 (图 2)。用吊环, 把她的头绑在支架的左侧。如有必要, 可使用化学约束 (盐酸 Xylazine 100 mgm/ml iv 在0.010-0.015 毫克/千克体重)。
5. 活检区域位于正确的10-11 肋间空间 (图 3)。画一条直线, 从右块茎到右肩点。活检部位是这条线与10-11th 跨海岸空间相交的地方。通过剃须10厘米见方的面积, 对牛的生物化面积进行消毒 (图 4)。用圆周运动用10% 的规定擦洗清洗区域 (图 5)。用70% 乙醇溶液喷洒区域 (图 6)。重复提供和乙醇清洗。
   注: 与肉牛相比, 荷斯坦奶牛的肝脏处于稍有不同的位置。
6. 在局部注射2% 利多卡因 hcl (10-15 ml), 以提供皮肤和底层肌肉及结缔组织的麻醉 (图 7)。重复提供和70% 乙醇清洗。
   注意: 神经末梢在皮肤和肌肉, 但不是内脏, 所以只需要局部麻醉。在活检过程中, 牛最多只能感觉到一些压力, 没有疼痛。
7. 在10-11th 肋间空间的皮肤上做一个1-2 厘米的刺伤切口 (图 8)。通过皮肤通过沙克福德-孔特尼牛肝脏活检仪器, 并将活检仪器定向到轻微的颅骨方向, 同时继续通过横隔膜进入肝脏 (图 9,图 10)。获取1克肝脏样本并取出仪器 (图 11)。用缝合位置缝合皮肤 (图 12)。
8. 将肝脏样本放置在有足够 mim 覆盖样本的锥形管中, 放在冰上立即分离线粒体
9. 在活检24小时内检查切口是否有红肿、发热或疼痛, 并在接下来的3天内每天一次在颈部注射盐酸头孢菌 (ceftiofurmL/kg)。在肝活检后1周内, 每天监测奶牛的体温、摄入量和粪便得分。如果出现发烧, 请由兽医酌情使用抗生素。
   注: 如果奶牛在肝脏活检后1小时内出现疼痛症状, 如踢切口部位、呕吐、发红、发热或反应接触, 可用于注射 1 mg* kg 体重 iv 注射氟尼辛素, 以减轻疼痛和炎症。如有必要, 可进行第二次注射。
10. 活检后7天取出缝合线。

2. 从奶牛肝脏中分离线粒体

1. 在将肝脏样本从奶牛中取出后, 尽快在 mim (步骤 1.3) 中清洗肝脏样本, 去除红细胞, 并用剪刀将样本切碎。肝脏应在含有足够隔离介质的冷冻烧杯中碎, 以保持组织湿润。
2. 将碎肝放入一个30毫升的玻璃瓶中, 在冰中孵育0.16 毫米的小管, 并含有 mL (1:4 wv)。
3. 在500转/分的时候将肝脏样本同质化, 用 4 strokesk/min 进行一分钟。
   注: 在整个过程中, 肝脏均质保存在 mim 的冰包装烧杯中, 并在4°c 下完成以下所有离心步骤
4. 以 500 x 克离心均质 10分钟, 丢弃颗粒, 将上清液转移到冷却的离心管中, 然后以 10, 000 x 克离心产生的上清液 10分钟, 以获得线粒体颗粒。
5. 用无脂肪酸 bsa 和离心机在 8100 x g 下回收和清洗 mL 10 毫升中的颗粒10分钟。
6. 在没有脂肪酸 bsa 的情况下, 在 mL 10 毫升中回收和清洗颗粒, 在 8100 x 克的情况下, 在 8100 x g 处溶解上清液10分钟。
7. 将颗粒悬浮在200μl 的隔离介质中, 放在冰上, 直到用于耗氧和质子泄漏动力学检测。
8. 根据制造商的协议, 以 bsa 为标准, 使用双氯苯酸 (bca) 试剂盒确定颗粒悬浮液 (半稀释) 的蛋白质浓度。所有蛋白质都被认为是线粒体蛋白。

3. 测量线粒体耗氧量 (第3个州和4号州)

1. 从 120 mm kcl、5 mm kh 2 po 4、5 mm mgcl₂、5 mm 肝和 1 mm egta 创建耗氧介质 (ocm), ph 值7.4 在30°c 下, 脱脂 bsa 为 0.3%.每个样品大约需要3毫升。还在乙醇中制备了8μgml 寡霉素溶液。
2. 在30°c 下培养 ocm。根据制造商的发展方向 (氧图系统) 设置呼吸室、泵和氧电极。应已在计算机上安装了氧图软件。
3. 将 ocm 的1毫升放入呼吸室, 用力搅拌。这将有助于确保溶液中充满空气。
4. 将0.35 毫克的线粒体蛋白添加到呼吸室, 并将温度保持在30°c。
5. 记录耗氧量约5分钟。氧图系统记录氧浓度, 随着呼吸的增加, 氧浓度降低。当耗氧量变为恒定 (一条下降的直线) 时, 记录耗氧量 (线的斜率 = 氧气浓度)。这是基准耗氧量。
6. 加入1.25μl 的 4 mm 鱼烯酮溶液来抑制复合 i, 然后加入5μl 的 1 m 琥珀酸溶液, 在琥珀酸 5 mm 的呼吸室中达到最终浓度。这是状态4呼吸。
7. 加入1μl 的 100 mm adp 溶液, 在100μm 的呼吸室中达到最终浓度。氧气浓度将减少 (增加的呼吸), 然后在大约5分钟以后成为一条直线。记录耗氧量 (线的斜率 = 氧气浓度/时间)。这是状态3呼吸。
8. 可选: 在运行结束时, 添加 fccp (0.2μm 总体积) 以诱导最大呼吸。记录呼吸约 5分钟 (约)。当耗氧量变为不变时, 记录耗氧量。这是最大耗氧量。
9. 使用方程计算呼吸控制比 (rcr) 3 耗氧量/状态4耗氧量。
10. 将所有的溶液从呼吸室中取出。用双去离子水冲洗几次室。

4. 线粒体膜电位 (mmp) 和质子作用力 (pmf) 的测量

1. 在乙醇中制备 80 ngml nigericin 溶液。
   注: 这些化学物质溶解在乙醇中, 应尽一切努力将添加的乙醇用量限制在低于1μl 的范围内, 因为乙醇会使电子输运系统解联并导致 mitch病症功能障碍。
2. 用双去离子水彻底冲洗腔后, 将 ocm 的1毫升放入呼吸室, 用磁搅拌杆大力搅拌。这将有助于确保溶液中充满空气。在室内设置中加入甲基三苯基磷 (tpmp +) 敏感电极。tpmp + 电极应连接到 ph 计, 并从 ph 计读取值。
3. 在呼吸室加入0.35 毫克的线粒体蛋白。
4. 加入1.25μl 的 4 mm 鱼藤酮溶液, 以抑制复杂 i. 记录呼吸 2-5 (约)。当耗氧量变为不变时, 记录耗氧量。
5. 加入0.56 微克/升寡霉素溶液, 最终浓度为2.8 微克寡霉素/0.56 毫克的线粒体蛋白, 以抑制 adp 的利用。记录呼吸 2-5 (约)。当耗氧量变为不变时, 记录耗氧量。
6. 加入 0.1μl 80ng/ml nigericin 溶液, 废除线粒体内膜的 ph 梯度。记录呼吸 2-5 (约)。当耗氧量变为不变时, 记录耗氧量。
   注: 罗氏酮和寡霉素分别用于阻断复杂 i 和 atp 合酶的电子传输链。添加尼日利亚蛋白是为了将跨膜 h + 梯度转换为 k + 梯度, 可以用电极测量。
7. 在线粒体培养中加入5μl 的 10mm tmp + 溶液, 为 tpmp + 准备一个标准曲线。再重复这一步四次, 直到添加了2.5 微米 tmp + 的总浓度。
8. 在腔内加入5μl 的1m。
9. 记录呼吸, 直到你达到了一个稳定的跟踪, 然后滴定系统通过添加丙二酸。丙二酸盐的添加应为0.5μl、1μl、1.5μl、3.0μl、9.0μl, 然后为 0.1 mm 丙二酸溶液的12.5 μl, 以实现在0.1、0.2、0.3、0.6、1.2、1.8、1.8 和 2.5 mm 的培养室中连续添加丙二酸盐浓度。
10. 收集两个电极 (氧气和 tpmp⁺) 的数据。氧图系统的数据采集软件可用于收集线粒体耗氧量和线粒体膜电位的同步测量, 并实时观察耗氧量的变化。图 14显示了随着实验的进展, 氧谱系统是如何记录耗氧量的。
11. 根据 nernst 方程计算 mv 中的 mmp:
    mmp = 61.5 日志 ([tpmp +] 添加–外部 [tpmp +]) x tpmp + 结合校正/(0.001 x 蛋白醇 x [tpmp +])
    采用 tpmp + 线粒体蛋白^-1 0.4μlmg 的结合校正方法。
    基于协议中浓度的示例计算:
    mmp = 61.5 x 日志 (5μm–2μm) x 0.4/(0.001 x 0.001 毫克线粒体蛋白/毫升 x 2μm)
    mmp = 198.9 mv
12. 通过绘制 mmp与耗氧量的图来估计 pmf (图 15)。据报道, 在膜电位为 165 mv 的情况下, pmf 为耗氧量。
    注: 用丙二酸 (0.1 至 2.5 mm) 滴定电子传输链显示质子泄漏对 mmp 的动力学响应。然后, 针对耗氧量绘制 mmp, 确定质子泄漏动力学。pmf 是通过计算普通膜电位 (165 mv) 的耗氧量来确定的。
13. 在样品的最后一次运行结束时, 加入 fccp (0.2μm 总体积) 以诱导最大呼吸, 并释放 tmp + 进行基线校正。
14. 将所有的溶液从呼吸室中取出。用双去离子水冲洗几次室。在一天结束时, 腔内也应用乙醇冲洗几次。

结果

表 1和图 15分别显示了 rcr 和质子泄漏动力学的阳性结果。本研究⁷在牛奶中喂养了5个不同水平的铜、锌和锰中的1种, 并在牛奶中测定了荷斯坦奶牛的 rcr 和蛋白质泄漏动力学。状态 4, 最大质子泄漏依赖呼吸, 有倾向于受矿物摄入铜, 锰和锌 (p & lt; 0.1)。状态 3 (最大 atp 刺激呼吸) 和 rcr = 状态 3/状态 4 (呼吸控制率) ?...

讨论

该协议中最关键的一点是获得具有代表性的肝脏组织样本, 并在活检后尽快开始分离线粒体。呼吸测量的变化很低 (表 1), 原因是从奶牛到实验室的运输时间很短。为了减少运输时间, 在奶牛场办公室设立了一个小型实验室, 并在收集每个样本时将肝脏样本送到办公室实验室, 以便在活检10分钟内分离线粒体。用 ph 计设置和测试呼吸室和电极 (氧气, tpmp +), 在采集和处理样品的前一天记录?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument	Sontec Instruments Englewood CO	1103-904
Suture	Fisher Scientific	19-037-516
Suture needles	NA	NA	Included with Suture
Scalpels	Sigma - Aldrich	S2896 / S2646	# for handle and blades
Surgery towels	Fisher Scientific	50-129-6667
Falcon tubes 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Tweezers	Sigma - Aldrich	Z168750
50 mL syringes	Fisher Scientific	22-314387
Injection needles (22, 2 1/2)	VWR	MJ8881-200342
Cow halter	Tractor Supply Co.	101966599
Cotton swabbing	Fisher Scientific	14-959-102
cotton gauze squares (4x4)	Fisher Scientific	22-246069
Medical scissors	Sigma - Aldrich	Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow			Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine			Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days			Provided by Veterinarian
Providone Scrub	Aspen Veteterinary Resources	21260221
Ethanol 70%	Sigma - Aldrich	793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight			Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL)			Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine			Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance	Fisher Scientific	02-911-527
Homogenizer Motor	Cole Parmer	EW-04369-10
Homogenizer Probe	Cole Parmer	EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL)	Cole Parmer	SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice	Fisher Scientific	FB100600
Refrigerated microfuge	Fisher Scientific	75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)	abcam	ab102536
Sucrose	Sigma - Aldrich	S7903-1KG
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T1503-1KG
EDTA	Sigma - Aldrich	EDS-1KG
BSA (fatty acid free)	Sigma - Aldrich	A7030-50G
Mannitol	Sigma - Aldrich	M4125-1KG
Deionized water	Sigma - Aldrich	38796
Hepes	Sigma - Aldrich	H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode	Hansatech (PP Systems)	OXY1
Thermoregulated Water Pump	ADInstruments	MLE2001
Clark type Oxygen electrode	NA	NA
Autopipette (1 mL)	Cole Parmer	SK-21600-70	Included with Oxy1
Small magnetic stir bar	Fisher Scientific	14-513-95
Micropipette (10 μL)	Cole Parmer	SK-21600-60
pH meter	VWR
Chemicals
KCl	Sigma - Aldrich	P9333-1KG
Hepes	Sigma - Aldrich	H3375-500G
KH2PO4	Sigma - Aldrich	P5655-1KG
MgCl2	Sigma - Aldrich	M1028-100ML
EGTA	Sigma - Aldrich	E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution)	Sigma - Aldrich	R8875-5G
Succinate (1 M solution)	Sigma - Aldrich	S3674-250G
ADP (100 mM solution)	Sigma - Aldrich	A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol)	Sigma - Aldrich	75351
FCCP	Sigma - Aldrich	C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode	World Precision Instruments.	DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution)	Sigma - Aldrich	M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma - Aldrich	75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma - Aldrich	N7143
FCCP	Sigma - Aldrich	C3920
TPMP	Sigma - Aldrich	T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA