JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف العام لهذه المادة توحيد البروتوكول لعزل وتوصيف، وتمايز الخلايا الجذعية القلبية (CSCs) من قلب الماوس الكبار. هنا، يمكننا وصف أسلوب الطرد المركزي تدرج كثافة لعزل CSCs موريني ووضع أساليب لديوان الخدمة المدنية الثقافة وانتشارها، والتمايز في cardiomyocytes.

Abstract

احتشاء عضلة القلب (ميتشيغن) سبب الرئيسي للاعتلال والوفيات العالم. أحد الأهداف رئيسية للطب التجديدي لتغذية عضلة القلب الميت بعد مي. وقد استخدمت عدة استراتيجيات لتجديد عضلة القلب، العلاج بالخلايا الجذعية لا تزال نهجاً رئيسيا لتغذية عضلة القلب الميت قلب مي. تتراكم الأدلة تشير إلى وجود الخلايا الجذعية القلب المقيم (CSCs) في قلب الكبار وآثارها الغدد الصماء و/أو باراكريني على تجديد القلب. ومع ذلك، CSC عزل وتوصيف والتمايز تجاه الخلايا احتشاء عضلة القلب، ولا سيما كارديوميوسيتيس، لا يزال يشكل تحديا تقنية. في هذه الدراسة، قدمنا طريقة بسيطة لعزل وتوصيف، والتفريق بين CSCs من قلب الماوس الكبار. هنا، يمكننا وصف أسلوب تدرج كثافة لعزل CSCs، حيث يهضم القلب بحل الثاني كولاجيناز 0.2%. تميز CSCs معزولة، يمكننا تقييم التعبير عن علامات CSCs/القلب Sca-1، NKX2-5، و GATA4، وعلامات بلوريبوتينسي/ستيمنيس OCT4، SOX2، ونانج. كما عقدنا العزم إمكانات الانتشار CSCs معزولة باستزراع لهم في طبق بتري وتقييم التعبير عن علامة الانتشار كي-67. لتقييم إمكانيات التمايز CSCs، اخترنا CSCs بين سبع وعشر أيام مثقف. نحن نقلتهم إلى لوحة جديدة مع وسيلة تمايز كارديوميوسيتي. أنها هي المحتضنة في حاضنة ثقافة خلية لمدة 12 يوما، بينما متوسطة التمايز يتم تغييره كل ثلاثة أيام. CSCs المتباينة التعبير عن علامات محددة كارديوميوسيتي: أكتينين وتروبونين أنا. وهكذا، CSCs معزولة مع هذا البروتوكول ستيمنيس وعلامات القلب، ولديهم إمكانيات للانتشار والتفرقة تجاه النسب كارديوميوسيتي.

Introduction

مرض القلب الاقفاري، بما في ذلك احتشاء عضلة القلب (ميتشيغن)، سبب رئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم1. ويظل العلاج بالخلايا الجذعية لتجديد عضلة القلب الميت نهجاً رئيسيا لتحسين وظيفة القلب مي2،القلب3،،من45. استخدمت أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية لتجديد عضلة القلب الميت وتحسين وظيفة القلب قلب مي. يمكن تصنيفها على نطاق واسع في الخلايا الجذعية6 وبالغ في الخلايا الجذعية الجنينية. استخدمت في الخلايا الجذعية البالغة، أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية، مثل الخلايا وحيدات النوى المشتقة من نخاع العظام7،8، الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام9،10، الأنسجة الدهنية 11،12، والحبل السري13و14،CSCs15. الخلايا الجذعية يمكن تعزيز إنعاش القلب عن طريق الغدد الصماء و/أو paracrine الإجراءات16،17،18،،من1920. ومع ذلك، قيداً رئيسيا للعلاج بالخلايا الجذعية هو الحصول على عدد كاف من الخلايا الجذعية التي يمكن أن تتكاثر و/أو التفريق نحو21،محددة نسب القلب22. زرع الخلايا الجذعية الذاتي و allogenic يشكل تحديا هاما في العلاج بالخلايا الجذعية9. ويمكن CSCs نهج أفضل لإنعاش القلب نظراً لأنها مشتقة من القلب، وأنها يمكن أن تكون أكثر سهولة متباينة في الأنساب القلب من الخلايا الجذعية غير القلب. وهكذا، فإنه يقلل من خطر تيراتوما. وبالإضافة إلى ذلك، آثار CSCs، والغدد الصماء وباراكريني مثل اكسوسوميس وميرناس المستمدة من CSCs، يمكن أن يكون أكثر فعالية من أنواع أخرى من الخلايا الجذعية. وهكذا، CSCs يبقى خيار أفضل لإنعاش القلب23،24.

على الرغم من أن CSCs أفضل مرشح لتجديد القلب في قلب مي سبب أصلهم القلب، قيداً رئيسيا مع CSCs هو أقل العائد نظراً لعدم وجود طريقة العزل الفعال. قيد آخر يمكن التفريق بين CSCs البصر نحو cardiomyocytes النسب2،25،،من2627. للالتفاف على هذه القيود، من المهم وضع بروتوكول فعال لعزل وتوصيف التمايز تجاه النسب القلب ديوان الخدمة المدنية. هناك لا علامة مقبولة واحدة ل CSCs وعزله محددة سطح الخلية المستندة إلى علامة من CSCs غلة أقل CSCs. هنا، علينا توحيد نهج الطرد المركزي تدرج بسيطة لعزل CSCs من قلب الماوس التي هي فعالة من حيث التكلفة ويؤدي زيادة غلة CSCs. يمكن تحديد هذه CSCs معزولة لعلامات سطح الخلية المحددة بخلية تنشيط fluorescence المكشوف. بالإضافة إلى العزلة CSCs، قدمنا بروتوكولا للثقافة ديوان الخدمة المدنية، وتوصيف والتمايز تجاه النسب كارديوميوسيتي. وهكذا، فإننا نعرض طريقة أنيقة لعزل وتوصيف، الثقافة، والتفريق بين CSCs من قلوب الماوس الكبار (الشكل 5).

Protocol

الإسكان، والتخدير، والتضحية بالفئران أجريت بعد البروتوكول IACUC المعتمدة من المركز الطبي في جامعة نبراسكا.

1-المواد

  1. 10-12 أسبوع استخدام C57BL/6J الأسود يمكن أيضا أن الفئران الذكور، أبقى داخلية في منشأة الحيوان المؤسسية، لعزل CSCs. CSCs تكون معزولة من الفئران الإناث غير الحوامل.
  2. تعقيم كل الأدوات الجراحية اللازمة، بما في ذلك المقص الجراحي والمقصات الجراحية الدقيقة وعرقوب منحنى ملقط وشفرة جراحية، بالتعقيم لهم قبل القتل الرحيم للماوس.
  3. تجهيز المخازن المؤقتة لعزل ديوان الخدمة المدنية في حالة معقمة وتخزينها في 4 درجات مئوية على الجليد. وتشمل هذه المخازن المؤقتة بوليسوكروسي وحل دياتريزواتي صوديوم تعدل بكثافة 1.077 غ/مل، ناقصة دولبيكو تعديل المتوسطة النسر، 1 x لحم الخنزير متوازنة الحل الملح (هبس)، والخلية الثقافة-الصف 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). إعداد 1% كولاجيناز الثاني أسهم حلاً (التي تمت تصفيتها وتعقيمها) وإيجاد حل عملي 0.2% في حبس.
  4. الحفاظ على هذه المواد زراعة الأنسجة في حالة معقمة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، بما في ذلك طبق بيتري 10 ملم ولوحة 6-جيدا وصفيحة 24-جيدا، و T-25 و T-75 قوارير الثقافة، أنابيب مخروطية الشكل 15 مل و 50 مل والمتاح الممصات المصلية مع 40 ميكرومتر و 100 --مصافي خلية ميكرومتر مع المرشحات 0.22 ميكرومتر.
  5. تعقيم 10 ميليلتر، 200-ميليلتر، ونصائح ماصة 1,000 ميليلتر من اﻷوتوكﻻف.
  6. استخدام القفازات خالية من مسحوق النتريل والايثانول 70% للحفاظ على شرط عقيمة طوال التجربة.
  7. استخدام التبييض 10% كمطهر.
  8. استخدام ديوان الخدمة المدنية المتاحة تجارياً الصيانة المتوسطة والمتوسطة التمايز كارديوميوسيتيس للثقافة والتفريق بين CSCs، على التوالي.

2-الأسلوب عزل الخلايا الجذعية القلب

  1. Euthanize أربع أو خمس الذكور البالغين (أو الإناث غير الحوامل) الفئران باستخدام دائرة2 CO. إصلاح الأسلحة الماوس كل على الورق المقوى تشريح مستقل مع دبابيس أو الأشرطة اللاصقة.
  2. رش الإيثانول 70% على الماوس للتخلص من الجراثيم خارج والحفاظ على شرط معقمة أثناء الحصاد للقلب. شق بالمقص في منتصف البطن وقطع الجلد من البطن يصل إلى الصدر في خط مستقيم. إزالة الجلد من كلا الجانبين من قطع الأوسط لمسح منطقة البطن من الجلد والشعر. باستخدام مقص وملاقط، قطع الحجاب الحاجز أدناه القفص الصدري.
  3. فتح تجويف الصدر من الماوس بالقص في القفص الصدري داخل غطاء محرك السيارة. كشف القلب وإزالة الدم القرب من القلب. تغسل المنطقة المحيطة للقلب مع برنامج تلفزيوني المثلج للتخلص من أي دم محيط القلب.
  4. تشريح القلب باستخدام المقص الجراحي وملاقط. مكان القلب في طبق بتري 100 ملم التي تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني المثلج.
  5. بالبيتاتي القلب باستخدام الملقط عرقوب المنحنية وإزالة بقايا الدم داخل القلب.
  6. استخدام القلب كله لعزل CSCs.
  7. نقل جميع قلوب كل أربعة أو خمسة إلى أنبوب 50 مل مخروطية التي تحتوي على 10 مل هبس المثلج. إبقاء الأنبوب على الجليد حتى مزيد من المعالجة.
  8. يمسح داخل وخارج السلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع الإيثانول 70% لخلق بيئة معقمة. تعقيم الأنبوب الذي يحتوي على قلب وغيرها من المواد المطلوبة مع الإيثانول 70%. ضع الأنبوبة المحتوية على القلب في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء لمزيد من المعالجة.
  9. نقل القلوب إلى طبق بتري 100 ملم التي تحتوي على 10 مل هبس المثلج. أغسل القلوب مرة أخرى قبل بالباتينج لإزالة أي بقايا الدم داخل القلب. تغيير الحل حبس بعد كل غسل لضمان الإزالة الكاملة للدم.
  10. قطع القلوب إلى قطع صغيرة باستخدام مقص جراحي غرامة أو شفرة جراحية في طبق بتري 100 ملم يحتوي على 5-7 مل من محلول حبس. يعقد كل قلب مع زوج من الملقط واستخدام زوج من مقص غرامة الجراحية أو شفرة جراحية لقطع القلب إلى قطع 2-4 مم. تغيير الحل حبس كثيرا لضمان حبس خالية من الدم. فرم القلوب في حل هبس.
  11. الطرد المركزي الأنسجة مفروم في 500 x g عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية وإبقاء بيليه.
  12. ريسوسبيند بيليه في 5-6 مل من 0.2% كولاجيناز الحل الثاني في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. كولاجيناز الحل ينبغي أن يكون الحجم تقريبا 1.5-إلى 2-إضعاف حجم بيليه.
    ملاحظة: لهضم الأنسجة، 0.2% كولاجيناز أنا والحل ديسباسي U/mL 2.5 يمكن الاستعاضة عن 0.2% كولاجيناز الثاني. استخدام وحدة تخزين متساوية تقريبا لحل ديسباسي كولاجيناز أنا الحل.
  13. مزيج دقيق بيليه مع 0.2% كولاجيناز الحل الثاني بالتحريض الأنبوب أو بواسطة هزاز الأنبوب على شاكر في س 75 ز لمدة 45-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اهتز الأنبوب بقوة باليد بعد كل 20-30 دقيقة لتعزيز تحلل.
  14. تريتوراتي ميكس تفكيك النسيج باستخدام ماصة مصلية 5 مل وتلميح ماصة 1 مل أن تنأى المقطوع الأنسجة في تعليق خلية واحدة.
    ملاحظة: للحصول على استرداد الحد الأقصى CSCs، تريتوراتي تحلل المزيج لمدة 5 دقائق على الأقل. إذا كانت كتل الأنسجة الكبيرة نسبيا، قص غيض من تلميح ماصة 1 مل مع مقص أو شفرة جراحية واستخدامها تريتوريشن.
  15. إيقاف تحلل الانزيمية الأنسجة بإضافة ديوان الخدمة المدنية المتاحة تجارياً الصيانة المتوسطة. أضف تقريبا 2-3 × قدر متوسط صيانة كحجم الأنسجة ليسيد في الخطوة 2، 14.
  16. يمر بتعليق خلية هضمها مصفاة خلية 100 ميكرون لإزالة أي قطع الأنسجة عسر الهضم.
  17. كرر الخطوة 2.16 استخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
  18. فصل الخلايا عن طريق الكثافة المتدرجة الطرد المركزي. لفصل الخلايا، تراكب بلطف بحجم متساوية فيلتراتي على حل دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم. على سبيل المثال، أولاً، إضافة 20 مل حل دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم في أنبوب 50 مل مخروطية وثم إضافة 20 مل فيلتراتي من الخطوة 2.17 على الحل دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم.
    ملاحظة: بريوارم بوليسوكروسي، ومحلول دياتريزواتي الصوديوم عند 37 درجة مئوية قبل استخدام مع الخلايا. إضافة فيلتراتي من الخطوة 2.17 على الحل دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم جداً بعناية وببطء لتجنب أي خلط الحلول اثنين. وهذا يعتبر خطوة حاسمة.
  19. الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على كل الحلول في 500 x ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام أجهزة الطرد مركزي في دلو سوينغ. تعيين أجهزة الطرد المركزي سرعة التسارع والتباطؤ أقل لتجنب الخلط بين الحلين والفصل السليم بين CSCs. هذا خطوة هامة في معزل عن ديوان الخدمة المدنية. وضع الأنبوب الذي يحتوي على خليط التدرج ببطء شديد دون اضطراب داخل أجهزة الطرد المركزي وإعداده للطرد المركزي.
  20. إخراج معطف بافي جنبا إلى جنب مع حل إضافي من الطبقة العليا باستخدام ماصة 1 مل أو من بلاستيك ماصة باستور في أنبوب معقم 15 مل. ستحتوي هذه الطبقة بافي CSCs.
    ملاحظة: اتخاذ الاحتياطات الإضافية أثناء بيبيتينج معطف بافي لا لإخراج الطبقة الحل دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم لأنها سامة ل CSCs.
  21. إضافة وحدة تخزين متساوية من ديوان الخدمة المدنية الصيانة المتوسطة إلى تعليق خلية من الخطوة 2.20 ومزجها بشكل صحيح لتحييد بوليسوكروسي المتبقية والحل دياتريزواتي الصوديوم، إذا كانت موجودة.
  22. الطرد المركزي من تعليق خلية أعلاه في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  23. ريسوسبيند بيليه في 7-10 مل من غير مكتملة دميم المتوسطة والطرد المركزي أنه في 500 x ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية للتخلص من أي بقايا بوليسوكروسي والحل دياتريزواتي الصوديوم.
  24. جمع بيليه، الذي يحتوي على CSCs المنقي.
  25. ريسوسبيند بيليه في 1 مل من ديوان الخدمة المدنية الصيانة المتوسطة، عد ديوان الخدمة المدنية، واستخدام بيليه للثقافة. لعد CSC، استخدم تلطيخ تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير. مع أربعة ذكور الفئران القلوب، هو عائد CSCs ~1.8 مليون.
  26. المغلفة البذور CSCs في لوحة ثقافة 6-جيدا مع محلول جيلاتين 0.02% يحتوي على 0.5% فيبرونيكتين. استخدام 2 مل متوسطة صيانة كاملة للبذر. احتضان لوحة الثقافة في حاضنة في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  27. استبدال وسيلة للثقافة CSCs مع ديوان الخدمة المدنية كاملة الصيانة المتوسطة كل يوم حتى اليوم الثالث. بعد ذلك، قم بتغيير المتوسطة الأيام بديل.
  28. تحديد نمو CSCs بمراقبة لهم تحت مجهر.

3-ثقافة الصيانة ومرور القلب من الخلايا الجذعية

  1. الثقافة CSCs معزولة في متوسط صيانة متوفرة تجارياً. استبدال المتوسطة الثقافة المتوسطة صيانة جديدة في أيام بديلة. عندما وصلت الثقافة ديوان الخدمة المدنية كونفلوينسي، نقل CSCs إلى لوحة جديدة مغلفة بالجيلاتين وفيبرونيكتين، كما هو مذكور في الخطوة 2.26. فصل CSCs مثقف بخلية الانزيمية الانفصال من المخزن المؤقت. يتبع البروتوكول القياسي من تفكك خلية من لوحة الثقافة. وفي هذه المرحلة، تعتبر CSCs في المرور 0 (P0) المرحلة.
  2. الثقافة P0 CSCs في الجيلاتين جديد ولوحة فيبرونيكتين المغلفة في ديوان الخدمة المدنية كاملة الصيانة المتوسطة عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة، تسمح لهم بأن تكون متموجة، وثم اتبع الخطوة 3.1 للحصول على ممر 1 (P1) CSCs. مخزن P1 CSCs في النتروجين السائل أو استخدامها اكسبيري الإدلاء بالبيانات.
  3. بذور الخلايا 0.5 مليون في لوحة 6-جيدا أو الخلايا 1 مليون في T-25 للحفاظ على ثقافة CSC في مرحلته الأولى.
  4. مرور CSCs عندما تصبح روافد 85% إلى 90%. يمكن أن يكون مثقف CSCs في الأجلين المتوسط وصيانة ما يصل إلى أربعة إلى ستة أسابيع.
    ملاحظة: الاحتفاظ كثافة البذر الأولية CSCs عالية نسبيا (40-50%) لأنه، في أقل كثافة بذر، قد تتغير CSCs بهم مورفولوجيا مسطحة وممدود.

4-وصف للقلب من الخلايا الجذعية

  1. وصف CSCs مثقف، مراقبة لهم تحت بالعاثية-على النقيض أو مجهر الحقل مشرق. ضع اللوحة التي تحتوي على ديوان الخدمة المدنية على الهدف من مجهر فلوري. تعيين منخفضة إلى حد ما التكبير (10 X) للتركيز الخلايا. استخدام الفتحة المرحلة عالي التباين لمراقبة الخلايا. زيادة التكبير إلى 20 X بتغيير العدسة الهدف والصورة CSCs. زيادة الهدف إلى 40 س والصورة CSCs. في اليومين الماضيين، CSCs تظهر جولة تقريبا في الشكل، ولكن حجم هذه الزيادات الخلية مع مرور الوقت، وفي غضون سبعة أيام، تظهر CSCs أسطواني تقريبا في الشكل (الشكل 1A - ج 1).
  2. أداء إيمونوستينينج CSCs مع علامات بلوريبوتينسي/ستيمنيس (OCT4، SOX2، أو نانج)، انتشار (كي-67) (الشكل 2 ألف - 2D)، وخلايا القلب المنشأ/السلف (Sca-1 أو NKX2-5 GATA4) (الشكل 3 ألف - 3 ج).
    1. إيمونوستينينج CSCs، البذور CSCs 10,000 في لوحة ثقافة 24-جيدا.
    2. في اليوم التالي (بعد 18-24 ساعة)، إصلاح CSCs في 300 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% لمدة 10 دقائق.
    3. أغسل CSCs مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج، x 3 مع فترات 5-دقيقة.
    4. بيرميبيليزي CSCs مع 300 ميليلتر من 0.2% X-100 تريتون المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
    5. أغسل CSCs مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج، x 3 مع فترات 5-دقيقة.
    6. القيام بحظر CSCs مع 300 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 1% المخفف في ببست (برنامج تلفزيوني + 0.1% 20 توين) أو 300 ميليلتر من الدجاج العادي 10% مصل مخفف في ببست ح 1.
    7. احتضان CSCs في 200 ميليلتر من جسم الابتدائي المخفف في عرقلة الحل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تضعف جسم الأولية حسبما أوصت به ورقة البيانات من الأجسام المضادة أو وفقا للتوحيد القياسي.
    8. أغسل CSCs مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج، x 3 مع فترات 5-دقيقة.
    9. احتضان CSCs في 200 ميليلتر من جسم الثانوي المخفف في عرقلة الحل (راجع الخطوة 4.2.6) ح 1 في درجة حرارة الغرفة. تضعف جسم الثانوي حسبما أوصت به ورقة البيانات من الأجسام المضادة أو وفقا للتوحيد القياسي.
    10. أغسل CSCs مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج، x 3 مع فترات 5-دقيقة.
    11. كونتيرستين CSCs مع 200 ميليلتر من DAPI المخفف (1 ميكروغرام/مل) في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    12. أغسل CSCs 1 x مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج. ثم إضافة 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج في كل بئر.
    13. إجراء التصوير باستخدام مجهر الأسفار. اتبع تعليمات الفلورسنت التصوير، مثل تجنب الضوء المباشر على اللوحة. تبقى لوحة الثقافة تحت المجهر. وتركز الخلايا في تكبير مختلفة. مراقبة الخلايا ضمن مرحلة التباين و/أو عوامل الإثارة المختلفة وحفظ الصور.
    14. تخزين اللوحة في الظلام في 4 درجات مئوية.

5-التفريق في القلب من الخلايا الجذعية في كارديوميوسيتي

  1. للتفريق بين CSCs، البذور CSCs 500,000 في لوحة 6-جيدا مع 2 مل من ديوان الخدمة المدنية المتاحة تجارياً بريوارم (37 درجة مئوية) الصيانة المتوسطة.
  2. احتضان لوحة تتضمن CSCs في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية. السماح CSCs بإرفاق وتتكاثر حتى النمو دون المتلاقية. إذا كان المتوسط يتحول إلى اللون الأصفر، يستبدل المتوسطة الثقافة المتوسطة صيانة جديدة.
  3. في كونفلوينسي 85% إلى 90%، يحل محل المتوسطة الصيانة مع 2 مل كارديوميوسيتيس بريوارم (37 درجة مئوية) متوسطة التمايز. احتضان اللوحة في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية لتصل إلى 2-3 أسابيع.
  4. تغيير متوسطة التمايز كل دال 2-3 مراقبة مورفولوجيا CSCs تحت مجهر كل مرة أثناء المتوسطة تغيير لضمان شروط ثقافة جيدة.
  5. بعد 12 د الثقافة ديوان الخدمة المدنية في متوسطة التمايز، بروتوكول الصورة CSCs لعلامات التمايز بعد إيمونوستينينج قياسية (انظر الخطوات 4.2.1-4.2.14). حفظ الصور الفلورية للتعبير عن علامات كارديوميوسيتيس (الشكل 4A - 4B).

النتائج

في هذه الدراسة، ونحن عزل CSCs من 10 إلى 12 أسبوع-عمرها C57BL/6J قلوب الفئران الذكور. هنا، وقد قدمنا طريقة بسيطة لعزل ديوان الخدمة المدنية، وتوصيف استخدام علامات بلوريبوتينسي. كما قدمنا طريقة أنيقة للتمايز CSC وتوصيف CSCs متباينة تجاه النسب كارديوميوسيتيس. لاحظنا مورفولوجية شكل مغز?...

Discussion

فيما يلي الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول العزلة ديوان الخدمة المدنية. 1) يجب المحافظة على شرط معقمة لاستخراج القلوب من الفئران. وقد خرق أي تلوث أثناء استخراج قلب نوعية CSCs. 2) يجب إزالة الدم تماما قبل تنميق القلب، والتي تتم بواسطة عدة يغسل القلب كله والقلب القطع مع الحل هبس. 3) يجب أن يكون تفك?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل تدعمه، في أجزاء، منح "المعاهد الوطنية للصحة" HL-113281 و HL116205 إلى الفقرات كومار ميشرا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MiceThe Jackson laboratory, USAStock no. 000664
Antibodies:
OCT4-Abcamab18976 (rabbit polyclonal)OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
SOX2Abcamab97959 (rabbit polyclonal)SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NanogAbcamab80892 (rabbit polyclonal)Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Ki67Abcamab16667 (rabbit polyclonal)Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Sca IMilliporeAB4336 (rabbit polyclonal)Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NKX2-5Santa Cruzsc-8697 (goat polyclonal)NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
GATA4Abcamab84593 (rabbit polyclonal)GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
MEF2CSanta Cruzsc-13268 (goat polyclonal)MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Troponin IMilliporeMAB1691 (mouse monoclonal)Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ActininMilliporeMAB1682 (mouse monoclonal)Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ANPMilliporeAB5490 (mouse polyclonal)ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Alex Fluor-488 checken anti-rabbitLife technologyRef no. A21441
Alex Fluor-594 goat anti-rabbitLife technologyRef no. A11012
Alex Fluor-594 rabbit anti-goatLife technologyRef no. A11078
Alex Fluor-488 checken anti-mouseLife technologyRef no. A21200
Alex Fluor-594 checken anti-goatLife technologyRef no. A21468
NameCompanyCatalog NumberComments
Culture medium:
CSC maintenance mediumMilliporeSCM101Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells
cardiomyocytes differentiation mediumMilliporeSCM102
DMEMSigma-AldrichD5546
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Isolation buffer:
polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077)Sigma10771
HBSSGibco2018-03
Collagenase ISigmaC0130
Dispase solutionSTEMCELL Technologies7913
PBSLONZAS1226
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermoscientificA1110501
Other reagents:
BSASigmaA7030
Normal checken serumVector laboratoryS3000
DAPI solutionApplichemA100,0010Dapi, working concentration-1 µg/mL
Trypan blueBiorad145-0013
TrypsinSigmaT4049
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermo Fisher ScientificA1110501
FormaldehydeSigma158127
Triton X-100ACROSCas No. 900-293-1
Tween 20Fisher SceintificLot No. 160170
EthanolThermo Scientific
NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue culture materials:
100 mm petri dishThermo Scientific
6-well plateThermo Scientific
24-well plateThermo Scientific
T-25 flaskThermo Scientific
T-75 flaskThermo Scientific
15 ml conical tubeThermo Scientific
50 mL conical tubeThermo Scientific
40 µm cell stainerFisher Scientific22363547
100 µm cell stainerFisher Scientific22363549
0.22 µm filterFisher Scientific09-719C
10 mL syringBDRef no. 309604
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tipsFisher Scientific
5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipetteThermo Scientific
NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments
Centrufuge machineThermo ScientificLEGEND X1R centrifuge
EVOS microscopeLife technology
Automated cell counterBiorad
Cell counting slideBiorad145-0011
Pippte aidThermo ScientificS1 pipet filler
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical Instruments:
Surgical scissorsFine Scientific Tool
Fine surgical scissorsFine Scientific Tool
Curve shank forcepsFine Scientific Tool
Surgical bladeFine Scientific Tool

References

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
  2. Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
  3. Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
  4. Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
  5. Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
  6. Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
  7. Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
  8. Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
  9. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
  10. Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
  11. Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
  12. Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
  13. Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
  14. Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
  15. Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
  16. Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
  17. Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
  18. Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
  19. Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
  20. Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
  21. Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
  22. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
  23. Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
  24. Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
  25. Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet?. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
  26. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
  27. Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
  28. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
  29. Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
  30. Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
  31. Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
  32. Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
  33. Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
  34. Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
  35. Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
  36. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 Sca 1 OCT4 67 NKX2 5 GATA4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved