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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di standardizzare il protocollo per l'isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache (CSCs) dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo di centrifugazione su gradiente di densità per isolare murino CSCs e metodi elaborati per la cultura, la proliferazione e la differenziazione in cardiomiociti di CSC.

Abstract

Infarto miocardico (MI) è delle cause principali di morbilità e mortalità nel mondo. Degli obiettivi principali della medicina rigenerativa è per ricostituire il miocardio morto dopo MI. Anche se diverse strategie sono state utilizzate per rigenerare il miocardio, terapia con cellule staminali rimane un approccio importante per ricostituire il miocardio morto di un cuore MI. Raccogliendo la prova suggerisce la presenza di cellule staminali residenti cardiache (CSCs) nel cuore adulto e loro effetti endocrini o paracrino sulla rigenerazione cardiaca. Tuttavia, CSC isolamento e loro caratterizzazione e differenziazione verso le cellule del miocardio, soprattutto cardiomiociti, rimane una sfida tecnica. Nello studio presente, abbiamo fornito un metodo semplice per l'isolamento, caratterizzazione e differenziamento di CSCs dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo del gradiente di densità per l'isolamento delle CSCs, dove il cuore è digerito da una soluzione di 0,2% collagenosi II. Per caratterizzare le CSCs isolate, abbiamo valutato l'espressione di marcatori di CSCs/cardiaco Sca-1, NKX2-5 e GATA4 e marcatori di pluripotenza/staminalità OCT4, SOX2 e Nanog. Inoltre abbiamo determinato il potenziale di proliferazione di CSCs isolato messa in coltura in una capsula di Petri e valutando l'espressione del marker di proliferazione Ki-67. Per valutare il potenziale di differenziazione delle CSCs, abbiamo selezionato sette - dieci - giorni coltivate CSCs. Li abbiamo trasferito in una nuova piastra con un mezzo di differenziazione dei cardiomiociti. Essi vengono incubati in un'incubatrice di coltura cellulare per 12 giorni, mentre il mezzo di differenziazione viene cambiato ogni tre giorni. Le CSCs differenziate esprimono marcatori del cardiomyocyte specifiche: actinina e troponina I. Così, CSCs isolato con questo protocollo dispone di staminalità e marcatori cardiaci, e hanno un potenziale di proliferazione e differenziazione verso cardiomyocyte lignaggio.

Introduzione

Cardiopatia ischemica, tra cui l'infarto miocardico (MI), è delle principali cause di morte intorno al mondo1. Terapia con cellule staminali per la rigenerazione del miocardio morto rimane un approccio importante per migliorare la funzione cardiaca di un MI cuore2,3,4,5. Diversi tipi di cellule staminali sono stati utilizzati per ricostituire il miocardio morto e migliorare la funzione cardiaca di un cuore MI. Essi possono essere categorizzati largamente in cellule staminali embrionali di6 e adulto di cellule staminali. In cellule staminali adulte, sono stati utilizzati vari tipi di cellule staminali, ad esempio cellule mononucleari derivate da midollo osseo7,8, cellule staminali mesenchimali derivate da midollo osseo9,10, tessuto adiposo 11,12e del cordone ombelicale13e CSCs14,15. Le cellule staminali possono promuovere rigenerazione cardiaca attraverso endocrine e/o paracrino azioni16,17,18,19,20. Tuttavia, una limitazione importante della terapia con cellule staminali è l'ottenimento di un adeguato numero di cellule staminali che possono proliferare e differenziarsi verso una specifica linea cardiaca21,22. Trapianto autologo e allogenico di cellule staminali è una sfida importante in cellule staminali terapia9. CSCs potrebbe essere un approccio migliore per la rigenerazione cardiaca perché sono derivati dal cuore e possono essere più facilmente differenziati in cardiaci lignaggi di cellule staminali non-cardiaca. Quindi, riduce il rischio di teratoma. Inoltre, gli effetti endocrino e paracrino delle CSCs, quali esosomi e Mirna derivati da CSCs, potrebbero essere più efficaci rispetto ad altri tipi di cellule staminali. Così, CSCs rimane un'opzione migliore per la rigenerazione cardiaca23,24.

Anche se CSC sono un candidato migliore per la rigenerazione cardiaca in un cuore MI dovuto la loro origine cardiaca, una limitazione importante con CSC è meno resa a causa della mancanza di un metodo efficiente isolamento. Un'altra limitazione potrebbe essere alterata differenziazione delle CSCs verso cardiomyocytes lineage2,25,26,27. Per ovviare a queste limitazioni, è importante sviluppare un efficiente protocollo per isolamento, caratterizzazione e differenziamento verso la linea cardiaca CSC. Non c'è nessun singolo indicatore accettabile per CSCs e un isolamento specifico di basati su marcatore cellula-superficie di CSCs produce meno CSCs. Qui, abbiamo standardizzare un approccio semplice centrifugazione su gradiente per isolare CSCs dal cuore del mouse che è conveniente e si traduce in un maggiore rendimento di CSCs. Questi CSCs isolato è selezionabile per specifici marcatori di superficie cellulare di corto circuito di fluorescenza-attivato delle cellule. Oltre all'isolamento di CSCs, abbiamo fornito un protocollo per cultura CSC, caratterizzazione e differenziamento verso cardiomyocyte lignaggio. Così, vi presentiamo un metodo elegante per isolare, caratterizzare, cultura e differenziare CSCs da cuori di topo adulto (Figura 5).

Protocollo

L'alloggiamento, l'anestesia e sacrificio dei topi sono stati effettuati seguendo il protocollo approvato IACUC dell'University of Nebraska Medical Center.

1. materiali

  1. Uso 10 a 12-week-old C57BL/6J nero topi maschi, mantenuti in-House presso l'impianto istituzionale degli animali, per l'isolamento delle CSCs. CSCs possono anche essere isolate da topi femmine non gravide.
  2. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici necessari, tra cui forbici chirurgiche, bene forbici chirurgiche, gambo curvo forcipe e una lama chirurgica, in autoclave prima l'eutanasia del mouse.
  3. Preparare il buffer di isolamento di CSC in una condizione sterilizzata e conservarli a 4 ° C sul ghiaccio. Questi tamponi includere polysucrose e una soluzione di sodio diatrizoate regolato ad una densità di 1,077 g/mL, incompleta Dulbecco modificato Medium di Eagle, di 1 x prosciutto soluzione salina (HBSS) equilibrata e delle cellule di cultura-grado 1 x tampone fosfato salino (PBS). Preparare una soluzione 1% collagenosi II stock (filtrata e sterilizzata) e una soluzione di lavoro 0,2% in HBSS.
  4. Conservare il materiale di coltura del tessuto nella condizione sterilizzata nella biosicurezza mobile, tra cui una capsula di Petri 10mm, una piastra a 6 pozzetti, una piastra a 24 pozzetti, T-25 e T-75 matracci di cultura, 15 mL e 50 mL provette coniche e pipette sierologiche monouso con 40-µm e 100 -filtri cella µm con filtri da 0,22 µm.
  5. Sterilizzare il 10-µ l, 200-µ l e puntali di 1.000-µ l in autoclave.
  6. Utilizzare guanti in nitrile senza polvere ed etanolo al 70% per mantenere una condizione sterile in tutto l'esperimento.
  7. Utilizzare candeggina al 10% come disinfettante.
  8. Utilizzare commercialmente disponibile mezzo di manutenzione di CSC e cardiomiociti mezzo di differenziazione per la cultura e la differenziazione delle CSCs, rispettivamente.

2. metodo di isolamento di cellule staminali cardiache

  1. Eutanasia di quattro o cinque adulto uomo (o donna non gravida) topi utilizzando una camera di CO2 . Fissare i bracci di ogni topo su un cartone di dissezione separata con perni o nastri appiccicosi.
  2. Spruzzare etanolo al 70% sul mouse per sbarazzarsi di germi esterni e mantenere la condizione sterilizzata durante la raccolta del cuore. Fare un'incisione con le forbici al centro dell'addome e tagliare la pelle dall'addome fino al torace in linea retta. Togliere la pelle da entrambi i lati del taglio centrale per cancellare l'area addominale di pelle e peli. Tagliare con forbici e pinzette, il diaframma sotto la gabbia toracica.
  3. Aprire la cavità toracica del mouse tagliando la gabbia toracica all'interno della cappa. Esporre il cuore e rimuovere il sangue vicino al cuore. Lavare la zona circostante del cuore con PBS ghiacciata per sbarazzarsi di qualsiasi sangue nelle vicinanze del cuore.
  4. Sezionare il cuore utilizzando pinzette e forbici chirurgiche. Mettere il cuore in una capsula Petri 100 mm contenente 10 mL di PBS ghiacciata.
  5. Palpitare il cuore mezzo gambo curvo forcipe e rimuovere i residui di sangue all'interno del cuore.
  6. Utilizzare tutto il cuore per l'isolamento delle CSCs.
  7. Trasferire tutti i quattro o cinque cuori interi a una provetta conica da 50 mL contenente 10 mL di HBSS ghiacciata. Tenere il tubo sul ghiaccio fino al procedimento successivo.
  8. Strofinare all'interno e all'esterno di una biosicurezza armadietto con etanolo al 70% per creare un ambiente sterilizzato. Sterilizzare il tubo contenente cuore e gli altri materiali necessari con etanolo al 70%. Inserire il tubo contenente cuore nella biosicurezza armadietto per l'ulteriore elaborazione.
  9. Trasferire i cuori in una capsula Petri 100 mm contenente 10 mL di HBSS ghiacciata. Lavare nuovamente i cuori di palpazione per rimuovere eventuali residui di sangue all'interno del cuore. Cambiare la soluzione HBSS dopo ogni lavaggio per garantire la completa rimozione del sangue.
  10. Tagliare i cuori a pezzetti utilizzando forbici chirurgiche bene o una lama chirurgica in una capsula Petri 100 mm contenente 5-7 mL di soluzione HBSS. Tenere ogni cuore con un paio di pinze e utilizzare un paio di forbici chirurgiche bene o una lama chirurgica per tagliare il cuore in pezzi di 2 - 4 mm. Cambiare la soluzione HBSS frequentemente per assicurarsi HBSS privo di sangue. Tritare i cuori nella soluzione di HBSS.
  11. Centrifugare il tessuto macinato a 500 x g a 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante e tenere il pellet.
  12. Risospendere il pellet in 5-6 mL di soluzione di 0,2% della collagenosi II in una provetta conica da 50 mL. Il volume di soluzione della collagenosi dovrebbe essere quasi 1,5 - per 2 volte al volume del pellet.
    Nota: per la digestione del tessuto, 0,2% collagenosi io e 2,5 U/mL di soluzione di dispase possiamo sostituire collagenosi 0,2% II. Utilizzare un volume quasi uguale di soluzione dispase la collagenosi ho soluzione.
  13. Mescolare bene il pellet con soluzione di 0,2% della collagenosi II agitando il tubo o da dondolo il tubo su un agitatore a 75 x g per 45-60 min a 37 ° C. Agitare vigorosamente il tubo a mano dopo ogni 20-30 min per migliorare la lisi.
  14. Triturare il mix di tessuto lisato utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL e una punta di pipetta 1 mL per dissociare il grumo di tessuto nella sospensione unicellulare.
    Nota: Per ottenere il massimo recupero delle CSCs, triturare il mix di lisi per almeno 5 min. Se i grumi di tessuto sono relativamente grandi, tagliare la punta di una pipetta 1 mL con forbici o una lama chirurgica e utilizzarlo per triturazione.
  15. Fermare la lisi enzimatica del tessuto aggiungendo mezzo di manutenzione CSC commercialmente disponibile. Aggiungere quasi 2-3 volte tanto mezzo di manutenzione come il volume del tessuto lisato nel passaggio 2.14.
  16. Passare la sospensione cellulare digerito attraverso un colino di cella da 100 µm per rimuovere eventuali pezzi di tessuto non digerito.
  17. Ripetere il passaggio 2.16 utilizzando un colino di cella da 40 µm.
  18. Separare le cellule mediante centrifugazione in gradiente di densità. Per la separazione delle cellule, polysucrose e sodio soluzione diatrizoate delicatamente sovrapporre un uguale volume del filtrato. Ad esempio, in primo luogo, aggiungere 20 mL della soluzione di diatrizoate polysucrose e sodio in una provetta conica da 50 mL e poi, aggiungere 20 mL di filtrato dal passaggio 2.17 sopra la soluzione diatrizoate polysucrose e sodio.
    Nota: Prewarm la polysucrose e la soluzione di sodio diatrizoate a 37 ° C prima di utilizzare con le cellule. Aggiungere il filtrato dal passaggio 2.17 sopra la soluzione diatrizoate polysucrose e sodio molto lentamente e con cautela per evitare qualsiasi miscelazione delle due soluzioni. Questo è considerato un passo cruciale.
  19. Centrifugare la provetta contenente entrambe le soluzioni a 500 x g per 20 min a temperatura ambiente utilizzando una centrifuga di secchio di oscillazione. Impostare la centrifuga ad una velocità di accelerazione e decelerazione inferiore per evitare di mescolare le due soluzioni e per la corretta separazione delle CSCs. Si tratta di un passo importante nell'isolamento di CSC. Mettere la provetta contenente la miscela gradiente molto lentamente senza disturbo all'interno della centrifuga e impostarlo per centrifugazione.
  20. Estrarre il buffy-coat insieme soluzione extra dallo strato superiore utilizzando una pipetta 1 mL o una pipetta di Pasteur plastica in una provetta sterilizzata 15 mL. Questo strato Bum conterrà le CSCs.
    Nota: Prendere la precauzione supplementare durante il pipettaggio del cappotto buffy di non togliere lo strato di soluzione polysucrose e sodium diatrizoate perché è tossico al CSCs.
  21. Aggiungere un volume uguale di mezzo di manutenzione CSC alla sospensione di cellule dal passaggio 2.20 e mescolare correttamente per neutralizzare il residuo polysucrose e sodio diatrizoate soluzione, se presente.
  22. Centrifugare la sospensione cellulare sopra a 500 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
  23. Risospendere il pellet in 7-10 mL di medium DMEM incompleta ed e centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 ° C per eliminare qualsiasi residuo polysucrose e sodium diatrizoate soluzione.
  24. Raccogliere la pallina, che contiene le CSCs purificate.
  25. Risospendere il pellet in 1 mL di mezzo di manutenzione di CSC, contare il numero di CSC e utilizzare il pellet per la cultura. Per contare il numero di CSC, utilizzare colorazione blu di Trypan e un emocitometro. Con quattro cuori di topo maschio, il rendimento delle CSCs è ~1.8 milioni.
  26. Seme CSCs in una piastra di coltura 6 pozzetti rivestiti con una soluzione di gelatina 0,02% contenente 0.5% fibronectina. Utilizzare 2 mL di mezzo di manutenzione completa per il seeding. Incubare la piastra di coltura in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
  27. Sostituire il mezzo di coltura CSCs con mezzo di manutenzione completo CSC ogni giorno fino al terzo giorno. Dopo di che, è necessario modificare il mezzo a giorni alterni.
  28. Determinare la crescita delle CSCs osservandoli al microscopio.

3. cultura manutenzione e passaggio di cellule staminali cardiache

  1. Cultura il CSCs isolata in un mezzo di manutenzione disponibili in commercio. Sostituire il terreno di coltura con mezzo di manutenzione fresco a giorni alterni. Quando la cultura di CSC ha raggiunto la confluenza, trasferire le CSCs una nuova piastra ricoperta di gelatina e fibronectina, come indicato nel passaggio 2.26. Staccare le CSCs coltivate dal buffer di dissociazione enzimatica delle cellule. Seguire il protocollo standard di dissociazione delle cellule dalla piastra di coltura. In questa fase, CSCs sono considerati al passaggio 0 (P0) fase.
  2. Cultura P0 CSCs in una gelatina nuova e rivestite di fibronectina piastra in mezzo di manutenzione completo CSC a 37 ° C in un incubatore a CO2 5%, permettono loro di essere confluenti e quindi seguire passo 3.1 per ottenere il passaggio 1 (P1) CSCs. Store P1 CSCs in azoto liquido o utilizzarli per Experia menti.
  3. Cellule di 0,5 milioni di semi in una piastra a 6 pozzetti o 1 milione cellule in T-25 a mantenere la cultura di CSC nella sua fase iniziale.
  4. Passaggio CSCs quando diventano 85% - 90% confluenti. I CSC possono essere coltivati in mezzo di manutenzione fino a quattro a sei settimane.
    Nota: Mantenere la densità di semina iniziale delle CSCs relativamente alta (40% - 50%) perché, a una minore densità di semina, CSCs possono cambiare la loro morfologia piatta e allungata.

4. caratterizzazione delle cellule staminali cardiache

  1. Per caratterizzare le CSCs coltivate, osservarli sotto un fago-contrasto o un microscopio a campo chiaro. Posizionare la piastra contenente CSC sull'obiettivo di un microscopio a fluorescenza. Impostare l'ingrandimento abbastanza basso (10 X) per concentrare le cellule. Utilizzare aperture di contrasto di fase per osservare le cellule. Aumentare l'ingrandimento 20x modificando la lente dell'obiettivo e l'aumento di CSCs. l'obiettivo di 40 X di immagine e immagine CSCs. In due giorni, il CSCs appaiono quasi rotonda in forma, ma la dimensione della cella aumenta con il tempo e in sette giorni, CSCs appaiono quasi cilindriche in forma (Figura 1A - 1C).
  2. Eseguire immunostaining delle CSCs con marcatori di pluripotenza/staminalità (OCT4, SOX2 o Nanog), proliferazione (Ki-67) (Figura 2A - 2D) e cellule di origine cardiaca/progenitrici (Sca-1, NKX2-5 o GATA4) (Figura 3A - 3C).
    1. Immunostaining delle CSCs, seme 10.000 CSCs in una piastra di coltura 24 pozzetti.
    2. Il giorno successivo (dopo 18-24 h), fissare le CSCs in 300 µ l di paraformaldeide al 4% per 10 min.
    3. Lavare le CSCs con 500 µ l di PBS ghiacciata, 3 volte con intervalli di 5 min.
    4. Permeabilize le CSCs con 300 µ l di 0,2% Triton X-100 diluito in PBS per 10 min.
    5. Lavare le CSCs con 500 µ l di PBS ghiacciata, 3 volte con intervalli di 5 min.
    6. Eseguire il blocco delle CSCs con 300 µ l di BSA 1% diluito in PBST (PBS + 0.1% Tween 20) o 300 µ l di siero di pollo normale 10% diluito in PBST per 1 h.
    7. Incubare le CSCs in 200 µ l di anticorpo primario diluito in blocco soluzione durante la notte a 4 ° C. Diluire l'anticorpo primario come consigliato dal datasheet di anticorpi o secondo la standardizzazione.
    8. Lavare le CSCs con 500 µ l di PBS ghiacciata, 3 volte con intervalli di 5 min.
    9. Incubare le CSCs in 200 µ l di anticorpo secondario diluito in soluzione di blocco (Vedi punto 4.2.6) per 1 h a temperatura ambiente. Diluire l'anticorpo secondario come consigliato dal datasheet di anticorpi o secondo la standardizzazione.
    10. Lavare le CSCs con 500 µ l di PBS ghiacciata, 3 volte con intervalli di 5 min.
    11. Colorante di contrasto le CSCs con 200 µ l di DAPI (1 µ g/mL) diluito in PBS per 5 min.
    12. Lavare le CSCs 1 x con 500 µ l di PBS ghiacciata. Quindi, aggiungere 300 µ l di PBS ghiacciata in ciascun pozzetto.
    13. Eseguire imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza. Seguire le istruzioni di fluorescente di imaging, tali da evitare la luce diretta sulla piastra. Tenere la piastra di coltura sotto il microscopio. Concentrare le cellule a diversi ingrandimenti. Osservare le cellule in contrasto di fase e/o filtri di eccitazione differente e salvare le immagini.
    14. Conservare la piastra al buio a 4 ° C.

5. differenziazione delle cellule staminali cardiache in cardiomiociti

  1. Per la differenziazione delle CSCs, seme 500.000 CSCs in una piastra a 6 pozzetti con 2 mL di mezzo di manutenzione disponibile in commercio CSC prewarm (37 ° C).
  2. Incubare la piastra che contiene le CSCs in incubatore a CO2 a 37 ° C. Consentire le CSCs di allegare e proliferare fino a crescita Sub-confluente. Se il mezzo diventa giallo, è possibile sostituire il terreno di coltura con mezzo di manutenzione fresco.
  3. Al confluency di 85% - 90%, sostituire il mezzo di manutenzione con 2 mL di prewarm (37 ° C) cardiomiociti mezzo di differenziazione. Incubare la piastra in un incubatore a CO2 a 37 ° C per 2-3 settimane.
  4. Cambiare il mezzo di differenziazione d. ogni 2-3 osservare la morfologia degli CSCs sotto un microscopio ogni volta durante il mezzo cambia per garantire le condizioni di buona cultura.
  5. Dopo 12 d della cultura di CSC in mezzo di differenziazione, immagine CSCs per marcatori di differenziazione seguendo un immunostaining standard protocollo (Vedi punti 4.2.1 - 4.2.14). Salvare le immagini fluorescenti per l'espressione di marcatori di cardiomiociti (fig. 4A - 4B).

Risultati

Nello studio presente, abbiamo isolato il CSCs da cuori di topo maschio di 10 a 12-week-old C57BL/6J. Qui, abbiamo presentato un metodo semplice per CSC isolamento e caratterizzazione mediante marcatori di pluripotenza. Abbiamo anche presentato un metodo elegante per il differenziamento di CSC e la caratterizzazione delle CSCs che differenziati verso cardiomyocytes lignaggio. Abbiamo osservato una morfologia di forma dell'alberino di CSCs 2 - a 3-giorni-coltivati sotto un microscopio a co...

Discussione

I punti critici di questo protocollo di isolamento del CSC sono come segue. 1) una condizione sterilizzata deve essere mantenuta per l'estrazione dei cuori dai topi. Qualsiasi contaminazione durante l'estrazione del cuore può compromettere la qualità della CSC. 2) il sangue deve essere completamente rimosso prima di tritare il cuore, che è fatto da diversi lavaggi di tutto il cuore e il cuore a pezzi con soluzione HBSS. 3) i pezzi di cuore devono essere completamente lisati in sospensione unicellulare con soluzione de...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è supportato, in parti, dalle sovvenzioni National Institutes of Health HL-113281 e HL116205 a. punti Kumar Mishra.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
MiceThe Jackson laboratory, USAStock no. 000664
Antibodies:
OCT4-Abcamab18976 (rabbit polyclonal)OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
SOX2Abcamab97959 (rabbit polyclonal)SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NanogAbcamab80892 (rabbit polyclonal)Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Ki67Abcamab16667 (rabbit polyclonal)Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Sca IMilliporeAB4336 (rabbit polyclonal)Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NKX2-5Santa Cruzsc-8697 (goat polyclonal)NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
GATA4Abcamab84593 (rabbit polyclonal)GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
MEF2CSanta Cruzsc-13268 (goat polyclonal)MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Troponin IMilliporeMAB1691 (mouse monoclonal)Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ActininMilliporeMAB1682 (mouse monoclonal)Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ANPMilliporeAB5490 (mouse polyclonal)ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Alex Fluor-488 checken anti-rabbitLife technologyRef no. A21441
Alex Fluor-594 goat anti-rabbitLife technologyRef no. A11012
Alex Fluor-594 rabbit anti-goatLife technologyRef no. A11078
Alex Fluor-488 checken anti-mouseLife technologyRef no. A21200
Alex Fluor-594 checken anti-goatLife technologyRef no. A21468
NameCompanyCatalog NumberComments
Culture medium:
CSC maintenance mediumMilliporeSCM101Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells
cardiomyocytes differentiation mediumMilliporeSCM102
DMEMSigma-AldrichD5546
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Isolation buffer:
polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077)Sigma10771
HBSSGibco2018-03
Collagenase ISigmaC0130
Dispase solutionSTEMCELL Technologies7913
PBSLONZAS1226
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermoscientificA1110501
Other reagents:
BSASigmaA7030
Normal checken serumVector laboratoryS3000
DAPI solutionApplichemA100,0010Dapi, working concentration-1 µg/mL
Trypan blueBiorad145-0013
TrypsinSigmaT4049
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermo Fisher ScientificA1110501
FormaldehydeSigma158127
Triton X-100ACROSCas No. 900-293-1
Tween 20Fisher SceintificLot No. 160170
EthanolThermo Scientific
NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue culture materials:
100 mm petri dishThermo Scientific
6-well plateThermo Scientific
24-well plateThermo Scientific
T-25 flaskThermo Scientific
T-75 flaskThermo Scientific
15 ml conical tubeThermo Scientific
50 mL conical tubeThermo Scientific
40 µm cell stainerFisher Scientific22363547
100 µm cell stainerFisher Scientific22363549
0.22 µm filterFisher Scientific09-719C
10 mL syringBDRef no. 309604
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tipsFisher Scientific
5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipetteThermo Scientific
NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments
Centrufuge machineThermo ScientificLEGEND X1R centrifuge
EVOS microscopeLife technology
Automated cell counterBiorad
Cell counting slideBiorad145-0011
Pippte aidThermo ScientificS1 pipet filler
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical Instruments:
Surgical scissorsFine Scientific Tool
Fine surgical scissorsFine Scientific Tool
Curve shank forcepsFine Scientific Tool
Surgical bladeFine Scientific Tool

Riferimenti

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