成人小鼠心脏干细胞的分离、鉴定及分化

摘要

本文的总体目标是规范心脏干细胞 (csc) 与成年小鼠心脏分离、表征和分化的协议。在这里, 我们描述了一种密度梯度离心方法, 以分离小鼠 csc 和详细的方法, csc 培养, 增殖, 并分化为心肌细胞。

摘要

心肌梗塞 (mi) 是全球发病率和死亡率的主要原因。再生医学的一个主要目标是补充心肌梗死后的死亡心肌。虽然有几种策略已被用于再生心肌, 干细胞治疗仍然是补充心肌梗死心脏的死亡心肌的主要方法。越来越多的证据表明, 成人心脏中存在常驻心脏干细胞 (csc), 其内分泌和 (或旁分泌) 对心脏再生有影响。然而, csc 分离及其对心肌细胞, 特别是心肌细胞的表征和分化, 仍然是一个技术挑战。在本研究中, 我们提供了一个简单的方法, 分离, 表征和分化 csc 从成年小鼠心脏。在这里, 我们描述了一种密度梯度方法隔离 csc, 其中心脏被消化0.2% 胶原酶 ii 溶液。为了表征分离的 csc, 我们评估了 cscs1、nkx2-5 和 gat4 和多能/干细胞的表达。我们还通过在培养培养培养皿和评估扩散标记 ki-67 的表达来确定孤立的 csc 的增殖潜力。为了评估 csc 的分化潜力, 我们选择了七到十天培养的 csc。我们把它们转移到一个有心肌细胞分化培养基的新盘子里。它们在细胞培养孵化器中孵育 12天, 而分化培养基每三天改变一次。分化的 csc 表达心肌细胞特异性标记: 放线素和肌钙蛋白 i。因此, 使用该协议分离的 csc 具有干细胞和心脏标记物, 它们有向心肌细胞谱系增殖和分化的潜力。

引言

缺血性心脏病, 包括心肌梗死 (mi), 是全世界死亡的主要原因¹。干细胞治疗再生死亡心肌仍然是改善心肌梗死^{心脏 2,3,4, 5 的}主要途径。不同类型的干细胞被用来补充死亡心肌和改善心肌梗死的心功能。它们大致可分为胚胎干细胞6和成人干细胞^.在成人干细胞中, 使用了各种类型的干细胞, 如骨髓源的单个核细胞^7,8, 骨髓间充质干细胞 9^,10, 脂肪组织^11、12和脐带¹³和 csc¹⁴、¹⁵。干细胞可以通过内分泌和/或辅助作用^促进心脏再生^{16,17,18, 19},^20.然而, 干细胞治疗的一个主要局限性是获得足够数量的干细胞, 这些干细胞能够增殖和/或分化到特定的心脏谱系²¹,²²。干细胞自体同种异体移植是干细胞治疗中^的一个重要挑战。csc 可能是心脏再生的更好方法, 因为它们来自心脏, 它们比非心脏干细胞更容易分化为心脏谱系。因此, 它降低了畸胎瘤的风险。此外, csc 的内分泌和副分泌效应, 如来自 csc 的外显子和 mirna, 可能比其他类型的干细胞更有效。因此, csc 仍然是心脏再生^{23,24 的}更好选择。

尽管 csc 由于其心脏源, 是心肌心脏再生的较好候选, 但 csc 的一个主要限制是由于缺乏有效的隔离方法而导致的产量较低。另一个限制因素可能是 csc 向心肌细胞^{谱系 2、25、26、27 的}分化受损。为了避免这些限制, 重要的是要为 csc 的分离、表征和向心脏谱系的分化制定一个有效的协议。csc 没有单一的可接受标记, 基于细胞表面标记的 csc 隔离可产生较少的 csc。在这里, 我们标准化了一种简单的梯度离心方法, 将 csc 从鼠标心脏中分离出来, 该方法具有成本效益, 并提高了 csc 的产量。这些孤立的 csc 可以选择特定的细胞表面标记通过荧光激活细胞短路。除了 csc 分离外, 我们还提供了 csc 培养、表征和向心肌细胞谱系分化的协议。因此, 我们提出了一种很好的方法来隔离、表征、培养和区分 csc 和成人鼠标心脏 (图 5)。

研究方案

小鼠的住房、麻醉和牺牲是按照内布拉斯加州大学医学中心批准的 iacuc 协议进行的。

1. 材料

1. 使用在机构动物设施内部饲养的10至12周的 c57bl/6j 黑雄性小鼠, 对 csc 进行隔离, 还可以从非怀孕的雌性小鼠中分离。
2. 消毒所有必要的手术器械, 包括手术剪刀, 精细的手术剪刀, 弯曲的小腿钳, 和手术刀片, 通过高压灭菌他们之前, 鼠标安乐死的小鼠。
3. 在灭菌条件下准备 csc 隔离缓冲, 并将其存储在4°c 的冰上。这些缓冲液包括聚蔗糖和经 1.077 g/ml 密度调整的硅酸钠溶液、不完全的 dulbecco 改性的鹰的培养基、1x ham 的平衡盐溶液 (hbss) 和细胞培养级的1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs)。在 hbss 中制备1% 的胶原酶 ii 库存溶液 (过滤和灭菌) 和0.2% 的工作溶液。
4. 将组织培养材料保存在生物安全柜中的消毒状态中, 包括10毫米培养皿、6孔板、24孔板、t-25 和 t-75 培养瓶、15-ml 和50毫升锥形管, 以及40微米和100的一次性血清学移液器-带有0.22μm 过滤器的微米电池过滤器。
5. 用高压灭菌器对10μl、200μl 和 1, 000μl 移液器吸头进行灭菌。
6. 在整个实验过程中, 使用无粉丁腈手套和70% 乙醇保持无菌状态。
7. 使用10% 漂白剂作为消毒剂。
8. 分别使用市售 csc 维持培养基和心肌细胞分化培养基进行 csc 的培养和分化。

2. 心脏干细胞的分离方法

1. 使用 co2 室对4至5只成年雄性 (或非怀孕雌性) 小鼠进行安乐死。用别针或胶带固定在单独的解剖纸板上, 将每只老鼠的手臂固定起来。
2. 在小鼠身上喷洒70% 的乙醇, 以去除外界细菌, 并在心脏收获过程中保持消毒状态。用剪刀在腹部中央做一个切口, 将皮肤从腹部切割到胸部, 以直线的距离。从中间切口两侧取出皮肤, 清除腹部皮肤和头发区域。用剪刀和推子, 把胸腔下面的横隔膜剪下来。
3. 通过切割引擎盖内的胸腔来打开鼠标的胸腔。暴露心脏, 取出心脏附近的血液。用冰凉的 pbs 清洗心脏周围的区域, 以清除心脏附近的任何血液。
4. 用手术剪刀和推子解剖心脏。将心脏放入一个100毫米的培养皿中, 其中包含10毫升的冰凉 pbs。
5. 用弯曲的小腿钳将心脏具壳, 取出心脏内残留的血液。
6. 使用整个心脏的 csc 的隔离。
7. 将所有的四到五个全心转移到一个50毫升的锥形管, 其中含有10毫升的冰凉 hbss。将管子放在冰上, 直到进一步加工。
8. 用70% 的乙醇擦拭生物安全柜内外, 营造消毒环境。用70% 乙醇消毒含心管和其他所需材料。将含有心脏的管放入生物安全柜进行进一步处理。
9. 将心脏转移到含有10毫升冰凉 hbss 的100毫米培养皿中。通过触诊再次洗洗心脏, 以消除心脏内的任何残留血液。每次清洗后更换 hbss 溶液, 以确保完全去除血液。
10. 使用精细的手术剪刀或100毫米培养皿中的手术刀片将心脏切成小块, 其中含有5-7 毫升的 hbss 溶液。用一双钳子固定每个心脏, 用一把手术精细的剪刀或手术刀片将心脏切割成2至4毫米的碎片。经常改变 hbss 溶液, 以确保无血液的 hbss。在 hbss 溶液中挖出心脏。
11. 在4°c 条件下, 以 500 x克的速度离心碎组织 5分钟, 丢弃上清液并保留颗粒。
12. 在50-ml 锥形管中, 将颗粒在0.2% 胶原酶 ii 溶液的 5-6 ml 中重新使用。胶原酶溶液的体积应几乎为颗粒体积的1.5 至2倍。
    注: 对于组织的消化, 0.2% 胶原酶 i 和 2.5 uml 消解酶溶液可取代0.2% 胶原酶 ii。对胶原酶 i 溶液使用几乎相等的贴合溶液。
13. 在37°c 下, 将颗粒与0.2% 胶原酶 ii 溶液充分混合, 搅拌管或在振动台上摇摇振动台上的振动台上, 在37°c 下 , 以 45分钟-60分钟的速度。每20-30分钟用手用力摇晃管, 以增强裂解。
14. 使用5毫升血清学移液器和1毫升移液尖端将裂解的组织混合物, 将组织肿块分解成单细胞悬浮液。
    注意: 要获得最大的恢复的 csc, 三酸裂解混合物至少5分钟。如果组织肿块相对较大, 用剪刀或手术刀片切割1毫升移液器尖端, 并将其用于过度。
15. 通过添加市售的 csc 维持介质来停止组织的酶裂解。在步骤2.14 中加入几乎2-3 倍于裂解组织体积的维持介质。
16. 通过100μm 的细胞过滤器通过消化过的细胞悬浮液, 去除任何未消化的组织块。
17. 使用40μm 电池过滤器重复步骤2.16。
18. 通过密度梯度离心分离细胞。对于细胞的分离, 轻轻地覆盖在聚蔗糖和硅酸钠溶液中的滤液的相等体积。例如, 首先, 在50毫升锥形管中加入20毫升的聚蔗糖和二甲酸钠溶液, 然后在多蔗糖和二甲酸钠溶液中加入 2.2 17 步中的滤液20毫升。
    注: 在与细胞一起使用之前, 在37°c 条件下对聚蔗糖和二甲酸钠溶液进行预热。在多蔗糖和硅酸钠溶液上加入第2.17 步中的滤液, 非常小心和缓慢, 以避免这两种溶液的任何混合。这被认为是关键的一步。
19. 使用摆动桶离心机, 在室温下以 500 x g的速度离心含有两种溶液的管20分钟。将离心机设置为较低的加速和减速速度, 以避免混合这两种溶液并正确分离 csc。这是 csc 隔离中的一个重要步骤。将含有梯度混合物的管非常缓慢地放置在离心机内, 不受干扰, 并将其设置为离心。
20. 使用1毫升移液器或15毫升灭菌管中的塑料巴斯德移液器, 从上层取出蓬松的外套和多余的溶液。此缓冲图层将包含 csc。
    注意: 在蓬松涂层的移液过程中, 应格外小心, 不要取出聚蔗糖和硅酸钠溶液层, 因为它对 csc 有毒。
21. 从步骤2.20 向细胞悬浮液中添加相同体积的 csc 维持介质, 并将其适当混合, 以中和残留的聚蔗糖和硅酸钠溶液 (如果存在)。
22. 在4°c 条件下, 以 500 x g离心上述细胞悬浮液5分钟。放弃上清液。
23. 在不完全 dmem 介质的 7-10 ml 中重新选择颗粒, 并在4°c 时以 500 x g 离心 5分钟, 以去除任何残留的多蔗糖和二甲酸钠溶液。
24. 收集颗粒, 其中包含纯化的 csc。
25. 在 csc 维护介质的1毫升中重新选择颗粒, 计算 csc 数量, 并使用颗粒进行培养。要计算 csc 的数量, 请使用色氨酸蓝染色和血细胞计。四颗雄性小鼠心脏, csc 的产量约为180万只。
26. 在6井培养板上播种 csc, 涂上0.02% 的明胶溶液, 其中含有0.5% 的纤维连接蛋白。使用2毫升的完整的维护介质进行播种。用5% 的 co2 在37°c 的孵化器中孵育培养板.
27. 每天用完整的 csc 维护介质取代培养 csc 的媒介, 直到第三天。之后, 隔天更改介质。
28. 通过显微镜观察 csc 的生长来确定它们的生长。

3. 心脏干细胞的培养和传道

1. 在商业上可获得的维护介质中培养孤立的 csc。隔天用新鲜的维护介质取代培养基。当 csc 培养达到融合时, 将 csc 转移到涂有明胶和纤维连接蛋白的新板上, 如步骤2.26 中所述。酶细胞离解缓冲液分离培养的 csc。遵循细胞与培养板分离的标准协议。在这一阶段, csc 被考虑在第0段 (p0) 阶段。
2. 在 5% co2 孵化器的 37°c csc 维持介质中, 在一个新的明胶和纤维涂覆介质中培养 p0 csc, 使它们融合在一起, 然后按照步骤3.1 获得通道 1 (p1) csc. 将 p1 csc 储存在液氮中或用于专家理。
3. 种子50万细胞在一个6孔板或100万细胞在 t-25, 以保持 csc 培养在最初阶段。
4. 当 csc 成为 85%-90% 融合时通过。csc 可在维持介质中培养至四到六个星期。
   注意: 保持 csc 的初始播种密度相对较高 (40%-50%), 因为在较低的播种密度下, csc 可能会将其形态变为扁平和拉长。

4. 心脏干细胞的鉴定

1. 为了表征培养的 csc, 用噬体对比度或明亮场显微镜观察它们。将含有 cscc 的板放在荧光显微镜的目标上。将放大倍率设置得相当低 (10倍), 以聚焦单元格。使用相位对比孔观察细胞。通过改变目标镜头和图像的 csc, 将放大倍率提高到 20x. 将目标增加到 40x, 并将 csc 图像增加到40x。在两天内, csc 的形状几乎是圆形的, 但细胞的大小会随着时间的推移而增加, 在七天内, csc 的形状几乎呈圆柱形(图 1a-1c )。
2. 用多能性干细胞标记物进行 csc 免疫染色 (oct4, sox2, 或 nanog)、增殖 (kia-2d ) 和心脏原祖细胞 (sca-1、 nkx2-5 或 gata4) (图3a-3c).
   1. 对于 csc 的免疫染色, 种子 10, 000 csc 在一个24孔培养板。
   2. 第二天 (18-24小时后), 将 csc 固定在300μl 的4% 甲醛中10分钟。
   3. 用500μl 的冰凉 pbs 清洗 csc, 3倍, 间隔5分钟。
   4. 用 300μl 0.2% triton x-100 在 pbs 中稀释10分钟的 csc。
   5. 用500μl 的冰凉 pbs 清洗 csc, 3倍, 间隔5分钟。
   6. 用 pbst (pbs + 0.1% tween 20) 稀释的 300μl 1% bsa 或在 pbst 中稀释1小时的10% 正常鸡血清300μl 对 csc 进行阻断。
   7. 在4°c 条件下, 将 csc 培养成200μl 的原代抗体, 在阻断溶液中稀释过夜。按照抗体数据表的建议或标准化稀释主要抗体。
   8. 用500μl 的冰凉 pbs 清洗 csc, 3倍, 间隔5分钟。
   9. 在室温下将 csc 在200μl 的二级二级二级二级抗体中稀释在阻断溶液中 (见步骤 4.2.6) 1小时。按照抗体数据表的建议或标准化稀释二级抗体。
   10. 用500μl 的冰凉 pbs 清洗 csc, 3倍, 间隔5分钟。
   11. 用 200μl dapi (1μg/ml) 在 pbs 中稀释5分钟的 csc 进行反色。
   12. 用500μl 的冰凉 pbs 清洗 csc 1x。然后, 在每口井中加入300μl 的冰凉 pbs。
   13. 使用荧光显微镜进行成像。按照荧光成像的说明操作, 例如避免板上的直射光线。将培养板放在显微镜下。将细胞集中在不同的放大倍率上。观察相对比和/或不同激励滤光片下的细胞, 保存图像。
   14. 将盘子存放在4°c 的黑暗中。

5. 心肌干细胞分化为心肌细胞

1. 对于 csc 的分化, 种子 500, 000 csc 在一个6孔板与2毫升的预热 (37°c) 的商业上可用的 csc 维护介质。
2. 在37°c 的二氧化碳孵化器中孵育含有 csc 的板.允许 csc 附着和增殖, 直到亚融合生长。如果培养基变黄, 则用新鲜的维护介质代替培养基。
3. 在 85%-90% 的融合下, 用2毫升的预热 (37°c) 心肌细胞分化培养基代替维持培养基。在37°c 的二氧化碳孵化器中孵育板 2-3周.
4. 每次在培养基改变过程中, 每 2-3 d. 观察显微镜下的 csc 形态, 以确保良好的培养条件。
5. 在分化培养基中进行 12 d csc 培养后, 按照标准免疫染色方案 (参见步骤 4.2.1-4.2.14) 对分化标记的 csc 进行成像。保存荧光图像以表达心肌细胞标记物 (图 4a-4b ).

结果

在本研究中, 我们分离 csc 从10至12周的 c57bl/6j 雄性小鼠心脏。在这里, 我们提出了一个简单的方法, csc 隔离和表征使用标记的多能性。我们还提出了一个优雅的方法 csc 分化和描述的 csc 分化为心肌细胞谱系。我们在相对照显微镜下观察到2至3天培养的 csc 的纺锤形形态 (图 1 a 和1 b)。我们发现在维持培养基中培养7天的时候, csc 的形态发生?...

讨论

此 csc 隔离协议的关键步骤如下所示。1) 从小鼠身上提取心脏时, 必须保持灭菌状态。心脏提取过程中的任何污染都可能损害 csc 的质量. 2) 在切碎心脏之前, 必须完全切除血液, 这是通过用 hbss 溶液对整个心脏和心脏碎片进行几次清洗来完成的。3) 心脏碎片必须完全裂解成单细胞悬浮液与胶原酶溶液。4) 用于分离细胞的多蔗糖和二甲酸钠梯度溶液必须预热。5) csc 培养的介质必须预热。6) 在培养皿中...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	The Jackson laboratory, USA	Stock no. 000664
Antibodies:
OCT4-	Abcam	ab18976 (rabbit polyclonal)	OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
SOX2	Abcam	ab97959 (rabbit polyclonal)	SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Nanog	Abcam	ab80892 (rabbit polyclonal)	Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Ki67	Abcam	ab16667 (rabbit polyclonal)	Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Sca I	Millipore	AB4336 (rabbit polyclonal)	Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NKX2-5	Santa Cruz	sc-8697 (goat polyclonal)	NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
GATA4	Abcam	ab84593 (rabbit polyclonal)	GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
MEF2C	Santa Cruz	sc-13268 (goat polyclonal)	MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Troponin I	Millipore	MAB1691 (mouse monoclonal)	Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Actinin	Millipore	MAB1682 (mouse monoclonal)	Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ANP	Millipore	AB5490 (mouse polyclonal)	ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Alex Fluor-488 checken anti-rabbit	Life technology	Ref no. A21441
Alex Fluor-594 goat anti-rabbit	Life technology	Ref no. A11012
Alex Fluor-594 rabbit anti-goat	Life technology	Ref no. A11078
Alex Fluor-488 checken anti-mouse	Life technology	Ref no. A21200
Alex Fluor-594 checken anti-goat	Life technology	Ref no. A21468
Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture medium:
CSC maintenance medium	Millipore	SCM101	Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells
cardiomyocytes differentiation medium	Millipore	SCM102
DMEM	Sigma-Aldrich	D5546
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Isolation buffer:
polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077)	Sigma	10771
HBSS	Gibco	2018-03
Collagenase I	Sigma	C0130
Dispase solution	STEMCELL Technologies	7913
PBS	LONZA	S1226
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermoscientific	A1110501
Other reagents:
BSA	Sigma	A7030
Normal checken serum	Vector laboratory	S3000
DAPI solution	Applichem	A100,0010	Dapi, working concentration-1 µg/mL
Trypan blue	Biorad	145-0013
Trypsin	Sigma	T4049
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher Scientific	A1110501
Formaldehyde	Sigma	158127
Triton X-100	ACROS	Cas No. 900-293-1
Tween 20	Fisher Sceintific	Lot No. 160170
Ethanol	Thermo Scientific
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue culture materials:
100 mm petri dish	Thermo Scientific
6-well plate	Thermo Scientific
24-well plate	Thermo Scientific
T-25 flask	Thermo Scientific
T-75 flask	Thermo Scientific
15 ml conical tube	Thermo Scientific
50 mL conical tube	Thermo Scientific
40 µm cell stainer	Fisher Scientific	22363547
100 µm cell stainer	Fisher Scientific	22363549
0.22 µm filter	Fisher Scientific	09-719C
10 mL syring	BD	Ref no. 309604
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips	Fisher Scientific
5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette	Thermo Scientific
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
Centrufuge machine	Thermo Scientific	LEGEND X1R centrifuge
EVOS microscope	Life technology
Automated cell counter	Biorad
Cell counting slide	Biorad	145-0011
Pippte aid	Thermo Scientific	S1 pipet filler
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical Instruments:
Surgical scissors	Fine Scientific Tool
Fine surgical scissors	Fine Scientific Tool
Curve shank forceps	Fine Scientific Tool
Surgical blade	Fine Scientific Tool