التحليل الرقمي للتلطيخ المناعي للبروتين المتفاعل ZW10 في أنسجة الرئة البشرية

Summary

يشارك البروتين المتفاعل ZW10 (ZWINT) في نقطة التفتيش المغزل الميتوميووووووومرض السرطاني. هنا، نقدم منهجية لتلطيخ المناعة من ZWINT في أنسجة سرطان الرئة البشرية، تليها المسح الرقمي للشرائح بأكملها وتحليل الصور. ويمكن لهذه المنهجية أن توفر صورا رقمية عالية الجودة ونتائج موثوقة.

Abstract

الغرض من هذه الدراسة هو إدخال منهجية لتلطيخ المناعة من أنسجة الرئة البشرية، تليها المسح الرقمي الكامل الشريحة وتحليل الصور. المسح الرقمي هو وسيلة سريعة لمسح كومة من الشرائح وإنتاج الصور الرقمية ذات جودة عالية. يمكن أن تنتج نتائج متوافقة مع الفحص المجهري الضوء التقليدية (CLM) من قبل علماء الأمراض. وعلاوة على ذلك، فإن توافر الصور الرقمية يجعل من الممكن أن نفس الشريحة يمكن ملاحظتها في وقت واحد من قبل عدة أشخاص. وعلاوة على ذلك، يمكن تخزين الصور الرقمية للشرائح في قاعدة بيانات، مما يعني تجنب التدهور الطويل الأجل للشرائح الزجاجية. القيود المفروضة على هذه التقنية هي كما يلي. أولا، فإنه يحتاج إلى الأنسجة عالية الجودة المعدة والكيمياء المناعية الأصلية (IHC) الشرائح دون أي ضرر أو بقايا تسرب الزائدة. ثانيا، يجب تحديد مناطق الورم أو غير الأورام من قبل علماء الأمراض ذوي الخبرة قبل التحليل باستخدام البرمجيات، من أجل تجنب أي التباس حول مناطق الورم أو غير الورم أثناء التسجيل. ثالثاً، يحتاج المشغل إلى التحكم في استنساخ الألوان خلال عملية الرقمنة في تصوير الشريحة الكاملة.

Introduction

ZW10 تفاعل البروتين (ZWINT) هو عنصر ضروري من مجمع kinetochore الذي يشارك في نقطة التفتيش المغزل الميتوميك^1،2،3. وقد أفيد أن استنفاد ZWINT يؤدي إلى فصل الكروموسوم المبكر الشاذ^1،2،3. وقد أشارت الدراسات الحديثة إلى أن ZWINT تشارك في مسببات الأمراض من الأورام المتعددة من خلال تعزيز انتشار الخلايا السرطانية^4،5. أبلغنا سابقا الإفراط في التعبير عن ZWINT في سرطان الرئة⁵. وقد كان من المقبول على نطاق واسع أن تحليل الشرائح من قبلعلماء الأمراض باستخدام CLM هو مضيعة للوقت وليس كميا 6،^7،8. وعلاوة على ذلك، فإن تدهور الشرائح الزجاجية المخزنة قد يجعل من المستحيل سحب الشرائح التي تم إنشاؤها مسبقًا. قد تتغلب الطريقة الناشئة للتصوير الرقمي الكامل للشرائح المستندة إلى الكمبيوتر (WSI) على هذه القيود^6و7و8 .

ولهذا الغرض، نقوم بوصف منهجية لوصم ة مناعية من ZWINT في أنسجة سرطان الرئة البشرية، إلى جانب المسح الرقمي الكامل الشريحة وتحليل الصور المستندة إلى البرامج. والميزة الرئيسية لهذه المنهجية هي إنتاج نتائج متوافقة مع CLM. ويمكن استخدام هذه التكنولوجيا على نطاق واسع في مجالات التهديف المرضية من تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوسين (H&E) وIHC، الفلورة في موقع التهجين (FISH)، microarrays الأنسجة (TMA)، واكتشاف المخدرات وتطويرها.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل اللجنة الأخلاقية لمستشفى تشونغنان بجامعة ووهان ومستشفى رينمين بجامعة ووهان.

1. إعداد الشرائح IHC

1. إصلاح عينة أنسجة الرئة عن طريق غمر جزء أنسجة الرئة البشرية (حوالي 3 × 3 سم) في 4٪ paraformaldehyde في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. تجفيف الأنسجة في 80٪، 95٪، و 100٪ الإيثانول لمدة 15 دقيقة، 20 دقيقة، و 20 دقيقة، على التوالي، في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، تزج الأنسجة في 100٪ إكسيلين 3X لمدة 20 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
3. للدمج، تزج الأنسجة في البارافين (63 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة. وأخيرا، تغيير البارافين مرة أخرى وتزج الأنسجة في ذلك لمدة 1 ساعة إضافية.
4. استخدام microtome دوارة لقطع الأنسجة إلى 5 أقسام ميكرومتر سميكة ووضعها على 20 ميكروغرام / مل بولي-L-يسين المغلفة الشرائح.
5. لإزالة الصبح، ضع الشرائح في فرن 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، ثم اغمر المقاطع في ثنائي ميثيل البنزين لمدة 15 دقيقة، تليها نقع في 100٪ إكسيلين لمدة 15 دقيقة.
6. ترطيب الشرائح مع أقسام الأنسجة 2X لمدة 5 دقائق في 100٪ الإيثانول، تليها علاج مع الإيثانول المخفف تسلسليا من 5 دقائق في الإيثانول 95٪، 5 دقيقة في الإيثانول 80٪، 5 دقيقة في 70٪ الإيثانول، و 5 دقيقة في الإيثانول 50٪.
7. إجراء إصلاح مستضد.
   1. تمييع حامض الستريك إصلاح السائل (20X) إلى 1X مع مزدوج المقطر H₂O (ddH₂O).
   2. ضع الشرائح مع أقسام الأنسجة و1X حامض الستريك إصلاح السائل (300 مل) في مربع إصلاح مستضد، ومن ثم، تسخينها في فرن الميكروويف في قوة عالية لمدة 2 دقيقة، تليها التدفئة في الطاقة المنخفضة للحفاظ على الغليان لمدة 6 دقائق.
   3. السماح للأقسام لتبرد بشكل طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة.
   4. استبدال السائل إصلاح حامض الستريك مع 0.01 M PBS، وغسل أقسام 3X، في كل مرة لمدة 5 دقائق، في شاكر الدوارة في درجة حرارة الغرفة.
8. القضاء على بيروكسيداز الذاتية.
   1. تخفيف 30٪ من H₂O₂ إلى 3٪ مع ddH₂O، إضافته إلى الشرائح (تأكد من أنه يغطي جميع الأنسجة)، واحتضان الشرائح في مربع الرطب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: الصندوق الرطب هو مربع من البلاستيك من 10 × 15 سم ويمكن أن تحتوي على الماء.
   2. غسل الشرائح 3X، في كل مرة لمدة 5 دقائق، مع 0.01 M PBS في شاكر دوارة في درجة حرارة الغرفة.
9. حظر مستضد غير محدد.
   1. تمييع مصل الماعز الطبيعي المركز إلى 10٪ مصل الماعز مع PBS مع 0.1٪ توين 20 (PBST).
   2. أضف 10% من مصل الماعز إلى الشرائح واحتضنها في المربع الرطب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يغطي مصل الماعز جميع الأنسجة في الشرائح.
10. وصمة عار الأنسجة.
    1. احتضان الشرائح مع الأرنب المضادة للإنسان المضادة للجسم المضاد ZWINT (1:50) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    2. غسل الشرائح 3X، في كل مرة لمدة 5 دقائق، مع 0.01 M PBST (1 مل من 0.1٪ توين 20 في 1000 مل PBS) في شاكر الدوارة في درجة حرارة الغرفة.
    3. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الثانوية (نظام الكشف عن الأرانب، 1:200) لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    4. غسل الشرائح 3X، في كل مرة لمدة 5 دقائق، مع 0.01 M PBST في شاكر الدوارة.
11. لتصور تلطيخ المناعة، أضف الشرائح إلى 300 ميكرولتر من 3,3-diaminobenzidine الطازجة، وبعد ذلك، غسل الشرائح مع مياه الصنبور في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يتم رصد درجة الصباغة تحت المجهر (التكبير 10X - 40X).
12. وصمة عار مضادة للأنسجة. وصمة عار الشرائح مع محلول تلطيخ الهيماتوإكسلين لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وبعد ذلك، وغسل الشرائح مع مياه الصنبور لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: تظهر النواة باللون الأزرق تحت المجهر (التكبير 10X - 40X). إذا كانت درجة تلطيخ الأزرق هو أكثر فعالية، يمكن استخدام التمايز الكحول الهيدروكلوريك لمدة 3- 5 ثانية، تليها الرينة الأنسجة مرة أخرى إلى اللون الأزرق مع مياه الصنبور لمدة 15 دقيقة لتسهيل تلطيخ بارز من الأنسجة.
13. تجفيف الشرائح لمدة 5 دقائق في 50٪ الإيثانول، 5 دقيقة في 70٪ الإيثانول، 2X في 80٪ الإيثانول لمدة 5 دقائق، 5 دقيقة في 95٪ الإيثانول، وأخيرا، 2X لمدة 5 دقائق لكل في 100٪ الإيثانول في درجة حرارة الغرفة.
14. للشفافية، تزج أقسام الأنسجة في خزان يحتوي على 100٪ إكسيلين لمدة 15 دقيقة ونقل المقاطع إلى خزان آخر يحتوي على 100٪ إكسيلين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
15. لختم، واتخاذ 50 - 100 درجة مئوية من اللثة محايدة وإضافة 5٪ إكسيلين إلى الخليط (تجنب الخلط في فقاعات). إضافة 15 درجة مئوية من الخليط المذكور أعلاه إلى أقسام أنسجة الرئة. ختم الفيلم مع الزجاج غطاء واضغط بلطف فقاعات بها.

2. التلقائي كامل الشريحة المسح الضوئي من الشرائح IHC

1. السماح للشرائح مختومة لتجف لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة لdesiccate لهم.
2. حدد الخيار حقل مشرق يدويًا وأدخل واجهة المسح اليدوي.
3. قم بمراجعة اسم الشرائح وحدد مسار تخزين للصور.
4. قم بتعيين منطقة المسح واختيار نماذج المسح الضوئي الخيار باستخدام عتبات مجموعة المستخدم. العتبة حوالي 50 مع مساحة المسح الضوئي توسيع قيمة 200 ميكرومتر.
5. قم بتعيين قيمة تركيز التركيز المسحي، وحدد التركيز تلقائيًا — حيث يتراوح من 1050 إلى 2650 — وأخيراً، حدد وضع طبقة واحدة.
6. قم بتحميل شرائح IHC على محطة العمل وابدأ المسح الضوئي التلقائي.
   ملاحظة: تأكد من عدم تلف الشرائح. الحفاظ على الشرائح نظيفة وشفافة وتجنب الغبار، حلويات، وبقايا مانع التسرب الزائد على الشرائح. يجب أن تكون الشريحة الزجاجية وغطاء الغلاف خالية من العلامات. لا تقم بتنظيف الشرائح باستخدام الزيلين. يتم إعطاء حجم الشرائح في الجدول 1.
7. قم بالمسح الضوئي تلقائيًا إلى مقطع الأنسجة بأكمله على شريحة بتكبير 20X أو 40X أو 100X.
8. جمع وتخزين الصور في نهاية المسح الضوئي الشريحة كاملة.

3. تحليل الشرائح عن طريق برامج التصوير

1. بدء تشغيل برنامج تحليل الصور الأنسجة المرضية وحدد الكمبيوتر المحلي.
2. افتح الملف الذي يقوم بتخزين بيانات المسح الضوئي.
3. حدد مستوى التكبير/التصغير المناسب من النطاق 2X إلى 40X.
4. ضبط اللون لتعيين التباين الأمثل عن طريق تبديل ضبطاللون.
5. دائرة يدويا وتسمية أجزاء من الاهتمام على كل صورة.
   ملاحظة: على سبيل المثال، يمكنك دائرة منطقة واحدة وتسميتها منطقة الورم.
6. حدد الإضافات ومراقبة الجودة. في هذا الوقت، منشئ السيناريو للملوثات العضوية الثابتة.
7. حدد كمية الكثافة وقم بضبط شريط الكشف.
   ملاحظة: ينبغي تنفيذ هذه العملية بعناية. يتم استخدام شريط التسامح الأزرق لضبط لون النواة الخلوية. يتم استخدام شريط التسامح براون لضبط تشبع لون التعبئة في الصورة. وينبغي أن تكون نتائج الصور بعد التعديلات متسقة مع النظراء الأصليين.
8. ضبط مستويات نقاط لجعل كثافة تلطيخ المناطق الدائرة مماثلة لتلك التي من الصور الأصلية.
   ملاحظة: البني الداكن يشير إلى إيجابية قوية، أصفر بني إيجابي معتدل، أصفر فاتح إيجابي ضعيف، والأبيض سلبي.
9. تخزين وتسمية الطراز كملف. تطبيق النموذج على شرائح أخرى وحدد التعليق التوضيحي المحدد".
10. دع البرنامج يقوم بحساب درجة H تلقائيًا للمناطق الدائرية في الصورة.

4. القياس الكمي للدرجات باستخدام نظامH-التهديف 9،¹⁰

1. حساب النسبة المئوية للتلطيخ المناعي وكثافة تلطيخ (0: سلبي، 1 +: ضعيف، 2 +: معتدل، 3+: قوي).
2. استخدام نظام التهديف (H-درجة) لحساب التهديف المرضية للورم والمناطق غير الورم المجاورة.
   ملاحظة: H-درجة = (٪ من الخلايا مع ضعف كثافة × 1) + (٪ من الخلايا مع كثافة معتدلة × 2) + (٪ من الخلايا مع كثافة قوية × 3). لذلك، الحد الأقصى H-درجة هو 300 إذا تم كمي 100٪ من الخلايا مع كثافة قوية.

النتائج

قمنا بقياس مستويات التعبير من ZWINT في 28 زوجا من سرطان الرئة غير الخلايا الصغيرة (NSCLC) عينات (الورم والأنسجة غير الورم المجاورة)، بما في ذلك 14 سرطان الخلايا الحرشفية (SCCs) و 14 سرطان الغدة الدرقية (ADCs)، من قبل IHC. المسح الرقمي الكامل للشرائح يوفر صور رقمية ذات جودة عالية (الشكل

Discussion

مسح كامل الشريحة أصبح موضوعا ساخنا لمسحها قوية وإنتاج صور عالية الجودة لأغراض السريرية والبحث^11،12،13. يمكن إنتاج الصور بواسطة المجاهر المسح الضوئي الشريحة في غضون دقائق^11،12،13. من خلال تطب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pannoramic MIDI	3D HISTECH	Cat: PMIDI-040709	An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more.
QuantCenter	3D HISTECH	Downloaded from the official website of the company	The framework for 3DHISTCH's image analysis applications.
LEICA RM2235	Leica Microsystems	Cat: 14050038604	The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation.
Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody	Abcam	Cat: ab197794	Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue.
Anti-rabbit secondary antibody	Wuhan Goodbio Technology	Cat:GB23303-1	Secondary antibody for IHC staining.
Phosphate-buffered saline	Wuhan Goodbio Technology	Cat:G0002	A solution containing a phosphate buffer.
OLYMPUS CX23	OLYMPUS	Cat:6M87620	Microscope for detection of H&E or IHC slides.
Dimethylbenzene	Shanghai Lingfeng Chemical Reagent	Cat:1330-20-7	A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study.
Hematoxylin Staining Solution	Wuhan Servicebio technology	Cat:G1039	It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue.
Tween 20	Baitg	Cat:2005-64-5	It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications.
Citric acid repair liquid	Wuhan Servicebio technology	Cat:G1202	Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure.
LEICA ASP200s	Leica	Cat: 14048043626	It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes.
LEICA Arcadia H	Leica	Cat: 14039354103	It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability.
LEICA Arcadia C	Leica	Cat: 14039354102	It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C.
CaseViewer Software	3DHISTECH