Digitale Analyse der Immunostainierung von ZW10 Interacting Protein in menschlichen Lungengeweben

Zusammenfassung

ZW10 Interacting Protein (ZWINT) beteiligt sich am mitotischen Spindel-Checkpoint und der Pathogenese des Karzinoms. Hier stellen wir eine Methodik zur Immunostainierung von ZWINT in menschlichen Lungenkrebsgeweben vor, gefolgt vom digitalen Scannen ganzer Dias und Bildanalyse. Diese Methode kann qualitativ hochwertige digitale Bilder und zuverlässige Ergebnisse liefern.

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie ist es, eine Methodik zur Immunfärbung menschlichen Lungengewebes einzuführen, gefolgt von einem digitalen Volldia-Scanning und einer Bildanalyse. Digitales Scannen ist eine schnelle Möglichkeit, einen Stapel von Dias zu scannen und digitale Bilder mit hoher Qualität zu erzeugen. Es kann konkordante Ergebnisse mit konventioneller Lichtmikroskopie (CLM) von Pathologen produzieren. Darüber hinaus ermöglicht die Verfügbarkeit digitaler Bilder, dass dieselbe Folie gleichzeitig von mehreren Personen beobachtet werden kann. Darüber hinaus können digitale Bilder von Dias in einer Datenbank gespeichert werden, was eine langfristige Verschlechterung von Glasdias vermeidet. Die Grenzen dieser Technik sind wie folgt. Zunächst benötigt es hochwertiges vorbereitetes Gewebe und die ursprüngliche Immunhistochemie (IHC) gleitet ohne Beschädigung oder überschüssige Dichtstoffrückstände. Zweitens sollten Tumor- oder Nichttumorbereiche von erfahrenen Pathologen vor der Analyse mit Software angegeben werden, um Verwirrung über den Tumor oder Nichttumorbereiche während der Bewertung zu vermeiden. Drittens muss der Bediener die Farbwiedergabe während des gesamten Digitalisierungsprozesses in der Ganzschiebebildgebung steuern.

Einleitung

ZW10 interagierendes Protein (ZWINT) ist ein notwendiger Bestandteil des Kinetochore-Komplexes, der am mitotischen Spindel-Checkpoint^1,2,3beteiligt ist. Es wurde berichtet, dass die Erschöpfung von ZWINT zu einer abnormen vorzeitigen Chromosomentrennung^1,2,3führt. Jüngste Studien haben ergeben, dass ZWINT an der Pathogenese mehrerer Tumoren beteiligt ist, indem die Proliferation von Tumorzellen gefördert wird^4,5. Wir berichteten zuvor über die Überexpression von ZWINT bei Lungenkrebs⁵. Es ist allgemein anerkannt, dass die Analyse von Dias durch Pathologen mit CLM zeitaufwändig und nicht quantitativ^{ist 6,7,8}_. Darüber hinaus könnte die Verschlechterung der gelagerten Glasgweise es unmöglich machen, zuvor erstellte Dias zurückzuziehen. Die neue Methode der computerbasierten, digitalen Ganzdia-Bildgebung (WSI) kann diese Einschränkungen überwinden^6,7,8.

Zu diesem Zweck beschreiben wir eine Methodik der Immunostainierung von ZWINT in menschlichen Lungenkrebsgeweben, gekoppelt mit ganzdia-digitalem Scannen und softwarebasierter Bildanalyse. Der Hauptvorteil dieser Methodik ist die Erstellung von konkordanten Ergebnissen mit CLM. Diese Technologie kann weit verbreitet in den Bereichen der pathologischen Bewertung von Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H&E) und IHC, Fluoreszenz-in-Situ-Hybridisierung (FISH), Gewebemikroarrays (TMA) und Arzneimittelentdeckung und -entwicklung eingesetzt werden.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Ethikkomitee des Zhongnan Hospital der Wuhan University und des Renmin Hospital der Wuhan University genehmigt.

1. Vorbereitung von IHC-Folien

1. Fixieren Sie die Lungengewebeprobe, indem Sie das menschliche Lungengewebefragment (ca. 3 x 3 cm) in 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Saline (PBS) für 24 h bei Raumtemperatur (RT) eintauchen.
2. Dehydrieren Sie das Gewebe in 80%, 95% und 100% Ethanol für 15 min, 20 min, bzw. 20 min, bei Raumtemperatur. Schließlich tauchen Sie das Gewebe in 100% Xylol 3x für jeweils 20 min bei Raumtemperatur ein.
3. Zum Einbetten das Gewebe 30 min in Paraffin (63 °C) eintauchen. Paraffin wechseln und das Gewebe für weitere 45 min wieder eintauchen. Schließlich das Paraffin noch einmal wechseln und das Gewebe für weitere 1 h hineintauchen.
4. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Drehmikrotom in 5 m dicke Abschnitte und legen Sie es auf 20 g/ml poly-L-Lysin-beschichtete Dias.
5. Zum Entwachsen die Dias 2 h in einen 65 °C-Ofen geben und dann die Abschnitte 15 min in Dimethylbenzol eintauchen, gefolgt von einem Einweichen in 100% Xylol für 15 min.
6. Hydratisieren Sie die Dias mit den Gewebeabschnitten 2x für 5 min in 100% Ethanol, gefolgt von einer Behandlung mit seriell verdünntem Ethanol von 5 min in 95% Ethanol, 5 min in 80% Ethanol, 5 min in 70% Ethanol und 5 min in 50% Ethanol.
7. Führen Sie Antigen-Reparatur.
   1. Zitronensäure-Reparaturflüssigkeit (20x) auf 1x mit doppeldestilliertem H₂O (ddH₂O) verdünnen.
   2. Legen Sie die Dias mit den Gewebeteilen und der 1x Zitronensäure-Reparaturflüssigkeit (300 ml) in eine Antigen-Reparaturbox und erhitzen Sie sie dann in der Mikrowelle mit hoher Leistung für 2 min, gefolgt von einer Erwärmung bei geringer Leistung, um das Kochen für 6 min aufrecht zu erhalten.
   3. Lassen Sie die Abschnitte auf natürliche Weise auf Raumtemperatur abkühlen.
   4. Ersetzen Sie die Zitronensäure-Reparaturflüssigkeit mit 0,01 M PBS, waschen Sie die Abschnitte jeweils 5 min im Rotationsshaker bei Raumtemperatur 3x.
8. Beseitigen Sie die endogene Peroxidase.
   1. 30% von H₂O₂ bis 3% mit ddH₂O verdünnen, den Dias hinzufügen (sicherstellen, dass es alle Gewebe abdeckt), und die Dias in einer nassen Box bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren.
      Hinweis: Die Nassbox ist eine Kunststoffbox von 10 x 15 cm und kann Wasser enthalten.
   2. Waschen Sie die Schlitten 3x, jeweils für 5 min, mit 0,01 M PBS im Drehschüttler bei Raumtemperatur.
9. Blockieren Sie das unspezifische Antigen.
   1. Verdünnen Sie das konzentrierte normale Ziegenserum auf 10% Ziegenserum mit PBS mit 0,1% Tween 20 (PBST).
   2. 10% Ziegenserum zu den Dias geben und 30 min in der Nassbox bei 37 °C bebrüten.
      Hinweis: Das Ziegenserum sollte alle Gewebe in den Dias abdecken.
10. Färben Sie das Gewebe.
    1. Inkubieren Sie die Dias mit Kaninchen anti-human Anti-ZWINT Antikörper (1:50) bei 4 °C über Nacht.
    2. Waschen Sie die Dias 3x, jeweils für 5 min, mit 0,01 M PBST (1 ml von 0,1% Tween 20 in 1.000 ml PBS) im Drehschüttler bei Raumtemperatur.
    3. Inkubieren Sie die Dias mit Sekundärantikörpern (Anti-Kaninchen-Erkennungssystem, 1:200) 30 min bei 37 °C.
    4. Waschen Sie die Schlitten 3x, jeweils für 5 min, mit 0,01 M PBST im Drehschüttler.
11. Um die Immunfärbung zu visualisieren, fügen Sie die Dias auf 300 l frisches 3,3-Diaminobenzidin ein und waschen Sie die Dias dann bei Raumtemperatur mit Leitungswasser.
    Hinweis: Der Färbegrad wird unter dem Mikroskop überwacht (Vergrößerung 10X - 40X).
12. Gegenstain das Gewebe. Die Dias mit Hämatoxylin-Färbungslösung für 2 min bei Raumtemperatur färben und dann die Dias mit Leitungswasser 15 min waschen.
    Hinweis: Der Kern erscheint blau unter dem Mikroskop (Vergrößerung 10X - 40X). Wenn der Grad der blauen Färbung stärker ist, kann salzchlorische Alkoholdifferenzierung für 3 - 5 s verwendet werden, gefolgt von der Spülung des Gewebes zurück zu blau mit Leitungswasser für 15 min, um die prominente Färbung des Gewebes zu erleichtern.
13. Dehydrieren Sie die Rutschen für 5 min in 50% Ethanol, 5 min in 70% Ethanol, 2x in 80% Ethanol für 5 min, 5 min in 95% Ethanol und schließlich 2x für 5 min jeweils in 100% Ethanol bei Raumtemperatur.
14. Zur Transparenz tauchen Sie die Gewebeabschnitte 15 min lang in einen Tank mit 100% Xylol ein und übertragen Sie die Abschnitte 15 min bei Raumtemperatur in einen anderen Tank, der 100 % Xylol enthält.
15. Zum Abdichten nehmen Sie 50 - 100 l neutrales Kaugummi und fügen Sie 5% Xylol in das Gemisch ein (Vermischung in Blasen vermeiden). Fügen Sie 15 l der oben genannten Mischung zu den Lungengewebeabschnitten hinzu. Versiegeln Sie die Folie mit Bezugsglas und drücken Sie die Blasen vorsichtig heraus.

2. Automatisches Volldia-Scannen von IHC-Dias

1. Lassen Sie die versiegelten Dias 12 h bei Raumtemperatur trocknen, um sie zu trocknen.
2. Wählen Sie die Option Helles Feld manuell aus, und geben Sie die manuelle Scanschnittstelle ein.
3. Überarbeiten Sie den Namen der Folien, und wählen Sie einen Speicherpfad für die Bilder aus.
4. Legen Sie den Scanbereich fest, und wählen Sie die Option Stichproben mithilfe von vom Benutzer festgelegten Schwellenwertenscannen . Der Schwellenwert liegt bei etwa 50, wobei ein Scanbereichserweiterungswert von 200 m erreicht ist.
5. Legen Sie den Scanfokuswert fest, wählen Sie den Fokus automatisch aus – er reicht von 1050 bis 2650 – und wählen Sie schließlich den Einschichtmodusaus.
6. Laden Sie die IHC-Folien auf die Workstation, und starten Sie den automatischen Scan.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Folien nicht beschädigt sind. Halten Sie die Rutschen sauber und durchscheinend und vermeiden Sie Staub, Konfetti und überschüssige Dichtstoffrückstände auf den Dias. Die Glasrutsche und der Deckelschlupf sollten ohne Markierungen sein. Reinigen Sie die Dias nicht mit Xylol. Die Größe der Folien ist in Tabelle 1angegeben.
7. Scannen Sie automatisch den gesamten Gewebeabschnitt auf einem Dia mit 20X, 40X oder 100X Vergrößerung.
8. Sammeln und speichern Sie die Bilder am Ende des gesamten Dia-Scans.

3. Analyse der Dias durch Imaging Software

1. Starten Sie die histopathologische Bildanalysesoftware, und wählen Sie Lokaler Computeraus.
2. Öffnen Sie die Datei, in der die Scandaten gespeichert sind.
3. Wählen Sie die entsprechende Zoomstufe zwischen 2X und 40X aus.
4. Passen Sie die Farbe an, um den optimalen Kontrast über Toggle color adjusteinzustellen.
5. Kreisen Sie manuell und benennen Sie die Teile, die für jedes Bild von Interesse sind.
   Hinweis: Sie können z. B. einen Bereich umkreisen und als Tumorbereichbenennen.
6. Wählen Sie Plugins und QC. Zu diesem Zeitpunkt wird der Szenario-Generator angezeigt.
7. Wählen Sie Dichte-Quant und passen Sie die Erkennungsleiste an.
   Hinweis: Dieser Vorgang sollte sorgfältig durchgeführt werden. Der Balken der blauen Toleranz wird verwendet, um die Farbe des Zellkerns anzupassen. Der Balken der braunen Toleranz wird verwendet, um die Sättigung der Füllfarbe im Bild anzupassen. Die Ergebnisse der Bilder nach Anpassungen sollten mit den ursprünglichen Gegenstücken übereinstimmen.
8. Passen Sie die Score-Ebenen an, um die Färbeintensität der eingekreisten Bereiche denen der Originalbilder zu ähneln.
   Hinweis: Dunkelbraun zeigt starkes Positiv, bräunliches Gelb ist mäßig positiv, hellgelb ist schwach positiv und Weiß ist negativ.
9. Speichern und benennen Sie das Modell als Datei. Wenden Sie das Modell auf andere Folien an, und wählen Sie Ausgewählte Anmerkungenaus.
10. Lassen Sie die Software automatisch den H-Score für die eingekreisten Bereiche im Bild berechnen.

4. Quantifizierung der Partituren mit dem H-Scoring System^9,10

1. Berechnen Sie den Prozentsatz der Immunfärbung und die Färbungsintensität (0: negativ, 1+: schwach, 2+: moderat, 3+: stark).
2. Verwenden Sie ein Bewertungssystem (H-Score), um die pathologische Bewertung des Tumors und der angrenzenden Nichttumorbereiche zu berechnen.
   Hinweis: H-Score = (% der Zellen mit schwacher Intensität x 1) + (% der Zellen mit moderater Intensität x 2) + (% der Zellen mit starker Intensität x 3). Daher ist der maximale H-Score 300, wenn 100% der Zellen mit starker Intensität quantifiziert werden.

Ergebnisse

Wir haben die Expressionskonzentrationen von ZWINT in 28 Paaren von nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC)-Proben (Tumor und angrenzendes Nichttumorgewebe) gemessen, darunter 14 Plattenepithelkarzinome (SCCs) und 14 Adenokarzinome (ADCs) durch IHC. Das ganzdiale digitale Scannen der Dias lieferte digitale Bilder von hoher Qualität (Abbildung 1A). Die Ergebnisse zeigten, dass der H-Wert des Lungenkrebses signifikant höher war als der von angrenzenden nicht-...

Diskussion

Ganzdia-Scanning wird zu einem heißen Thema für sein robustes Scannen und die Produktion von qualitativ hochwertigen Bildern für klinische und Forschungszwecke^11,12,13. Bilder können mit Dia-Scanning-Mikroskopen innerhalb von Minuten erstellt werden^11,12,13. Mit dieser Methode erhielten wir hochwertige Bilder für ZWINT IHC-Dias und...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pannoramic MIDI	3D HISTECH	Cat: PMIDI-040709	An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more.
QuantCenter	3D HISTECH	Downloaded from the official website of the company	The framework for 3DHISTCH's image analysis applications.
LEICA RM2235	Leica Microsystems	Cat: 14050038604	The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation.
Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody	Abcam	Cat: ab197794	Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue.
Anti-rabbit secondary antibody	Wuhan Goodbio Technology	Cat:GB23303-1	Secondary antibody for IHC staining.
Phosphate-buffered saline	Wuhan Goodbio Technology	Cat:G0002	A solution containing a phosphate buffer.
OLYMPUS CX23	OLYMPUS	Cat:6M87620	Microscope for detection of H&E or IHC slides.
Dimethylbenzene	Shanghai Lingfeng Chemical Reagent	Cat:1330-20-7	A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study.
Hematoxylin Staining Solution	Wuhan Servicebio technology	Cat:G1039	It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue.
Tween 20	Baitg	Cat:2005-64-5	It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications.
Citric acid repair liquid	Wuhan Servicebio technology	Cat:G1202	Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure.
LEICA ASP200s	Leica	Cat: 14048043626	It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes.
LEICA Arcadia H	Leica	Cat: 14039354103	It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability.
LEICA Arcadia C	Leica	Cat: 14039354102	It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C.
CaseViewer Software	3DHISTECH