Análisis digital de inmunomanchado de ZW10 Interacción de proteínas en tejidos pulmonares humanos

Resumen

La proteína interactuable ZW10 (ZWINT) participa en el punto de control del husillo mitético y en la patogénesis del carcinoma. Aquí, introducimos una metodología de inmunomanchades de ZWINT en tejidos de cáncer de pulmón humano, seguida de la exploración digital de diapositivas enteras y análisis de imágenes. Esta metodología puede proporcionar imágenes digitales de alta calidad y resultados fiables.

Resumen

El propósito de este estudio es introducir una metodología de inmunomancha de los tejidos pulmonares humanos, seguida de un escaneo digital completo y análisis de imágenes. El escaneo digital es una forma rápida de escanear una pila de diapositivas y producir imágenes digitales con alta calidad. Puede producir resultados concordantes con la microscopía de luz convencional (CLM) por patólogos. Además, la disponibilidad de imágenes digitales hace posible que varias personas puedan observar simultáneamente la misma diapositiva. Además, las imágenes digitales de diapositivas se pueden almacenar en una base de datos, lo que significa que se evita el deterioro a largo plazo de las diapositivas de vidrio. Las limitaciones de esta técnica son las siguientes. En primer lugar, necesita tejido preparado de alta calidad y los toboganes originales de inmunohistoquímica (IHC) sin ningún daño o exceso de residuos de sellador. En segundo lugar, las áreas tumorales o no tumorales deben ser especificadas por patólogos experimentados antes del análisis utilizando software, con el fin de evitar cualquier confusión sobre el tumor o áreas no tumorales durante la puntuación. En tercer lugar, el operador necesita controlar la reproducción del color durante todo el proceso de digitalización en imágenes de diapositivas enteras.

Introducción

La proteína interactuable ZW10 (ZWINT) es un componente necesario del complejo kinetochore que participa en el punto de control del husillo mitotico^1,2,3. Se ha informado de que el agotamiento de ZWINT conduce a una segregación prematura de cromosomas aberrante^1,2,3. Estudios recientes han sugerido que ZWINT participa en la patogénesis de múltiples tumores promoviendo la proliferación de células tumorales^4,5. Hemos informado previamente de la sobreexpresión de ZWINT en el cáncer de pulmón⁵. Ha sido ampliamente aceptado que el análisis de diapositivas por patólogos que utilizan CLM es lento y no cuantitativo^6,7,8_. Además, el deterioro de las diapositivas de vidrio almacenadas podría hacer imposible retraer las diapositivas creadas anteriormente. El método emergente de imágenes digitales basadas en computadoras (WSI) puede superar estas limitaciones^6,7,8.

Con este fin, describimos una metodología de inmunomanchadeing de ZWINT en tejidos de cáncer de pulmón humano, junto con el escaneo digital de diapositivas enteras y el análisis de imágenes basado en software. La principal ventaja de esta metodología es la producción de resultados concordantes con CLM. Esta tecnología puede ser ampliamente utilizada en las áreas de puntuación patológica de la tinción de hematoxilina-eosina (H&E) e IHC, hibridación in situ de fluorescencia (FISH), microarrays de tejido (TMA), y descubrimiento y desarrollo de fármacos.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Ético del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan y el Hospital Renmin de la Universidad de Wuhan.

1. Preparación de diapositivas IHC

1. Fijar la muestra de tejido pulmonar sumergiendo el fragmento de tejido pulmonar humano (alrededor de 3 x 3 cm) en 4% de paraformaldehído en solución salina con fosfato (PBS) durante 24 horas a temperatura ambiente (RT).
2. Deshidratar el tejido en 80%, 95% y 100% etanol durante 15 min, 20 min y 20 min, respectivamente, a temperatura ambiente. Finalmente, sumerja el tejido en 100% xileno 3x durante 20 min cada uno a temperatura ambiente.
3. Para la incrustación, sumerja el tejido en parafina (63 oC) durante 30 min. Cambie la parafina y vuelva a sumergir el tejido durante otros 45 minutos. Finalmente, cambie la parafina de nuevo y sumerja el tejido en él durante 1 h adicional.
4. Utilice un microtomo rotatorio para cortar el tejido en secciones de 5 m de espesor y colóquelos en diapositivas recubiertas de poli-L-lisina de 20 g/ml.
5. Para la desparasitación, coloque los portaobjetos en un horno de 65 oC durante 2 h y, a continuación, sumerja las secciones en dimetilbenceno durante 15 minutos, seguido de remojar en 100% xileno durante 15 min.
6. Hidratar los portaobjetos con las secciones de tejido 2x durante 5 min en 100% etanol, seguido de un tratamiento con etanol diluido en serie de 5 min en 95% etanol, 5 min en 80% etanol, 5 min en 70% etanol, y 5 min en 50% etanol.
7. Realice la reparación del antígeno.
   1. Líquido de reparación de ácido cítrico diluido (20x) a 1x con Doble destilado H₂O (ddH₂O).
   2. Coloque los portaobjetos con las secciones de tejido y el líquido de reparación de ácido cítrico 1x (300 ml) en una caja de reparación de antígenos y, a continuación, calentarlos en el horno microondas a alta potencia durante 2 minutos, seguido de calentamiento a baja potencia para mantener la ebullición durante 6 minutos.
   3. Deje que las secciones se enfríen naturalmente a temperatura ambiente.
   4. Sustituya el líquido reparador de ácido cítrico por 0,01 M PBS, lave las secciones 3x, cada vez durante 5 min, en el agitador giratorio a temperatura ambiente.
8. Eliminar la peroxidasa endógena.
   1. Diluir 30% de H₂O₂ a 3% con ddH₂O, añadirlo a los portaobjetos (asegúrese de que cubre todos los tejidos), e incubar los portaobjetos en una caja húmeda a temperatura ambiente durante 30 min.
      Nota: La caja húmeda es una caja de plástico de 10 x 15 cm y puede contener agua.
   2. Lave los portaobjetos 3x, cada vez durante 5 min, con 0.01 M PBS en el agitador giratorio a temperatura ambiente.
9. Bloquee el antígeno inespecífico.
   1. Diluir el suero de cabra normal concentrado a 10% de suero de cabra con PBS con 0.1% Tween 20 (PBST).
   2. Añadir 10% de suero de cabra a los portaobjetos e incubarlos en la caja húmeda a 37 oC durante 30 min.
      Nota: El suero de cabra debe cubrir todos los tejidos de los portaobjetos.
10. Mancha los tejidos.
    1. Incubar los portaobjetos con anticuerpo anti-ZWINT conejo anti-humano (1:50) a 4oC durante la noche.
    2. Lavar los portaobjetos 3x, cada vez durante 5 min, con 0.01 M PBST (1 mL de 0.1% Tween 20 en 1,000 mL PBS) en el agitador giratorio a temperatura ambiente.
    3. Incubar los portaobjetos con anticuerpo secundario (sistema de detección anticonejo, 1:200) durante 30 min a 37oC.
    4. Lavar las correderas 3x, cada vez durante 5 min, con 0.01 M PBST en la coctelera rotativa.
11. Para visualizar el inmunostaining, agregue los portaobjetos a 300 ml de disaminobenzidina fresca y, a continuación, lave los portaobjetos con agua del grifo a temperatura ambiente.
    Nota: El grado de teñido se controla bajo un microscopio (magnificación 10X - 40X).
12. Contramancha el tejido. Mancha los portaobjetos con solución de tinción de hematoxilina durante 2 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, lava los portaobjetos con agua del grifo durante 15 minutos.
    Nota: El núcleo aparece azul bajo el microscopio (magnificación 10X - 40X). Si el grado de tinción azul es más potente, se puede utilizar la diferenciación de alcohol clorhídrico para 3 - 5 s, seguido de envolver el tejido de nuevo a azul con agua del grifo durante 15 minutos para facilitar la tinción prominente del tejido.
13. Deshidratar los portaobjetos durante 5 min en 50% etanol, 5 min en 70% etanol, 2x en 80% etanol para 5 min, 5 min en 95% etanol, y finalmente, 2x para 5 min cada uno en 100% etanol a temperatura ambiente.
14. Para mayor transparencia, sumerja las secciones de tejido en un tanque que contenga 100% de xileno durante 15 minutos y transfiera las secciones a otro tanque que contenga 100% de xileno durante 15 min a temperatura ambiente.
15. Para sellar, tomar 50 - 100 l de goma neutra y añadir un 5% de xileno a la mezcla (evitar mezclar en burbujas). Añadir 15 l de la mezcla antes mencionada a las secciones de tejido pulmonar. Selle la película con el cristal de la cubierta y presione suavemente las burbujas hacia fuera.

2. Escaneo automático de diapositivas enteras de diapositivas IHC

1. Deje que los portaobjetos sellados se sequen durante 12 h a temperatura ambiente para desecarlos.
2. Seleccione la opción Bright field manually (Campo brillante manualmente) e introduzca la interfaz de escaneado manual.
3. Revise el nombre de las diapositivas y seleccione una ruta de almacenamiento para las imágenes.
4. Establezca el área de escaneado y elija la opción Analizar muestras utilizando umbrales establecidos porel usuario. El umbral es de aproximadamente 50 con un valor de expansión del área de escaneo de 200 m.
5. Establezca el valor de enfoque de escaneado, seleccione el enfoque automáticamente (que oscila entre 1050 y 2650) y, por último, seleccione Modo de una sola capa.
6. Cargue las diapositivas IHC en la estación de trabajo e inicie el escaneo automático.
   Nota: Asegúrese de que las diapositivas no estén dañadas. Mantener los portaobjetos limpios y translúcidos y evitar el polvo, el confeti y el exceso de residuos de sellador en los portaobjetos. El portaobjetos de vidrio y el cubreobjetos deben estar desprovistos de marcas. No limpie los portaobjetos con xileno. El tamaño de las diapositivas se indica en la Tabla1.
7. Escanee automáticamente toda la sección de tejido en una diapositiva con aumento 20X, 40X o 100X.
8. Recopile y almacene las imágenes al final del escaneo de diapositivas completa.

3. Análisis de las diapositivas por software de imágenes

1. Inicie el software de análisis de imágenes histopatológicamente y seleccione Equipo local.
2. Abra el archivo que almacena los datos de análisis.
3. Seleccione el nivel de zoom adecuado entre el rango 2X y 40X.
4. Ajuste el color para establecer el contraste óptimo mediante Alternar ajustede color .
5. Circule manualmente y asigne un nombre a las partes de interés de cada imagen.
   Nota: Por ejemplo, puede rodear un área y nombrarla como área de tumor.
6. Seleccione Plugins y QC. En este momento, aparece el generador de escenarios.
7. Seleccione Cantidad de densidad y ajuste la barra de detección.
   Nota: Este proceso debe realizarse con cuidado. La barra de tolerancia azul se utiliza para ajustar el color del núcleo celular. La barra de tolerancia marrón se utiliza para ajustar la saturación del color de relleno en la imagen. Los resultados de las imágenes después de los ajustes deben ser coherentes con las contrapartes originales.
8. Ajuste los niveles de puntuación para que la intensidad de tinción de las áreas en círculos sea similar a la de las imágenes originales.
   Nota: El marrón oscuro indica fuerte positivo, el amarillo parduzco es moderadamente positivo, el amarillo claro es débilmente positivo y el blanco es negativo.
9. Almacene y asigne el nombre del modelo como un archivo. Aplique el modelo a otras diapositivas y seleccione Anotación seleccionada".
10. Deje que el software calcule automáticamente la puntuación H para las áreas en círculos de la imagen.

4. Cuantificación de las puntuaciones utilizando el sistema de puntuación H^9,10

1. Calcular el porcentaje de inmunomancha y la intensidad de la tinción (0: negativo, 1+: débil, 2+: moderado, 3+: fuerte).
2. Utilice un sistema de puntuación (puntuación H) para calcular la puntuación patológica del tumor y las áreas no tumorales adyacentes.
   Nota: Puntuación H (% de las células con intensidad débil x 1) + (% de las células con intensidad moderada x 2) + (% de las células con intensidad fuerte x 3). Por lo tanto, la puntuación H máxima es 300 si el 100% de las células se cuantifican con intensidad fuerte.

Resultados

Medimos los niveles de expresión de ZWINT en 28 pares de muestras de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (tejidos tumorales y no tumorales adyacentes), incluyendo 14 carcinomas de células escamosas (SCC) y 14 adenocarcinomas (ACC), de IHC. El escaneo digital de diapositivas de diapositivas proporcionó imágenes digitales de alta calidad (Figura1A). Los resultados mostraron que la puntuación H del cáncer de pulmón fue significativamente m...

Discusión

El escaneo de diapositivas enteras se está convirtiendo en un tema candente por su análisis robusto y la producción de imágenes de alta calidad con fines clínicos y de investigación^11,12,13. Las imágenes pueden ser producidas por microscopios de escaneo deslizante en minutos^11,12,13. Mediante la aplicación de esta metodología, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pannoramic MIDI	3D HISTECH	Cat: PMIDI-040709	An automated digital slide scanner with a remarkable feature set :12-slide capacity, fluorescence scanning, and many more.
QuantCenter	3D HISTECH	Downloaded from the official website of the company	The framework for 3DHISTCH's image analysis applications.
LEICA RM2235	Leica Microsystems	Cat: 14050038604	The enhanced precision of the new accessories will add convenience to block to knife approach as well as specimen orientation.
Rabbit anti-human Anti-ZWINT antibody	Abcam	Cat: ab197794	Immunohistochemical analysis of ZWINT in human lung tissue.
Anti-rabbit secondary antibody	Wuhan Goodbio Technology	Cat:GB23303-1	Secondary antibody for IHC staining.
Phosphate-buffered saline	Wuhan Goodbio Technology	Cat:G0002	A solution containing a phosphate buffer.
OLYMPUS CX23	OLYMPUS	Cat:6M87620	Microscope for detection of H&E or IHC slides.
Dimethylbenzene	Shanghai Lingfeng Chemical Reagent	Cat:1330-20-7	A colorless, flammable fluid used as a solvent and clarifying agent in the preparation of tissue sections for microscopic study.
Hematoxylin Staining Solution	Wuhan Servicebio technology	Cat:G1039	It is commonly used for histologic studies, oftern colors the nuclei of cells blue.
Tween 20	Baitg	Cat:2005-64-5	It is a polysorbate-type nonionic surfactant formed by the ethoxylation of sorbitan before the addition of lauric acid. It is used as a deterent and emulsifier in pharmacological applications.
Citric acid repair liquid	Wuhan Servicebio technology	Cat:G1202	Is is used to repair antigen after fixation during IHC procedure.
LEICA ASP200s	Leica	Cat: 14048043626	It was designed for routine and research histopathology of up to 200 cassettes.
LEICA Arcadia H	Leica	Cat: 14039354103	It is a heated paraffin embedding station and allows for simple operation and precise control, resulting in improved quality, a smooth workflow and reliability.
LEICA Arcadia C	Leica	Cat: 14039354102	It is a cold plate holding more than 60/65 cassettes on its large working surface. It was designed with an environment adaptive control module to make sure the operating temperature is always stabilized at -6°C.
CaseViewer Software	3DHISTECH