Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويرد وصف بروتوكول مفصل لفصل وتحديد، وتوصيف بروتيوفورمس في عينات البروتين باستخدام المنطقة الشعرية اليكتروسبراي الكهربي التأين-جنبا إلى جنب الكتلي (تشيكيا-ESI-MS/MS). يمكن استخدام البروتوكول لتوصيف الاستبانة بروتيوفورمس في عينات بسيطة البروتين وتحديد بروتيوفورمس في عينات البروتين معقدة واسعة النطاق.

Abstract

قد اعترفت المنطقة الشعرية اليكتروسبراي الكهربي التأين-جنبا إلى جنب الكتلي (تشيكيا-ESI-MS/MS) كأداة مفيدة للبروتينات من أعلى إلى أسفل التي تهدف إلى وصف بروتيوفورمس في بروتيوميس المعقدة. ومع ذلك، تطبيق تشيكيا-MS/MS لنطاق واسع من أعلى إلى أسفل البروتيوميات قد أعاق قدرة عينة-تحميل منخفض وتضييق إطار الانفصال لتشيكيا. هنا، هو وصف بروتوكول استخدام تشيكيا-MS/MS مع حجم عينة-تحميل ميكروليتير على نطاق وإطار فصل 90 دقيقة لنطاق واسع من أعلى إلى أسفل البروتيوميات. يستند منهاج تشيكيا-MS/MS خطي polyacrylamide ([لبا])-الشعرية مع تدفق اليكتروسموتيك منخفضة للغاية، وطريقة تركيز عينة على إنترنت ديناميكية الأس الهيدروجيني-المستندة إلى مفرق مع كفاءة عالية للبروتين التراص، المغلفة فصل غمد الكهربائية كينيتيكالي ضخ تدفق CE-مرض التصلب العصبي المتعدد واجهة مع حساسية عالية للغاية، وفخ أيون مطياف شامل مع ارتفاع كتلة القرار وسرعة المسح الضوئي. يمكن استخدام المنصة لتوصيف عينات بسيطة من البروتين سليمة ذات الدقة العالية ووصف بروتيوفورمس في بروتيوميس المعقدة المختلفة على نطاق واسع. ويتجلى على سبيل مثال، فصل خليط البروتين القياسية ذات كفاءة عالية وحساسة للغاية الكشف عن العديد من الشوائب باستخدام المنصة. وكمثال آخر، هذا المنهاج يمكن أن تنتج ما يزيد على 500 بروتيوفورم وتشغيل تعريفات البروتين 190 من البروتين القولونية الإشريكيّة في واحد تشيكيا-MS/MS.

Introduction

ويهدف البروتيوميات من أعلى إلى أسفل (ماساتشوستس) لوصف بروتيوفورمس داخل البروتين على نطاق واسع. TDP تعتمد على فصل السائل-المرحلة الفعالة من البروتينات سليمة قبل التحليل الكتلي التأين-جنبا إلى جنب (أي إس أي-MS/MS) اليكتروسبراي بسبب تعقيد عالية وتركيز كبير النطاق الديناميكي ل البروتين1،2 3، ،،من45. المنطقة الشعرية التفريد (تشيكيا) تقنية قوية لفصل الجزيئات الحيوية استناداً إلى نسب الحجم-إلى-المسؤول عن6. تشيكيا بسيط نسبيا، التي تتطلب فقط فتح أنبوبي تنصهر السيليكا شعرية، خلفية اﻻلكتروﻻيت (بجي)، وإمدادات طاقة. يمكن تحميل عينة بروتينات سليمة في شعري استخدام الضغط أو الجهد، والانفصال هو بدأها غمر طرفي شعري في بجي وتطبيق جهد العالي. تشيكيا يمكن النهج كفاءة فصل عالية جداً (> لوحات النظرية 1 مليون) لفصل الجزيئات الحيوية7. تشيكيا-مرض التصلب العصبي المتعدد لديه حساسية أعلى كثيرا مما تستخدم على نطاق واسع عكس المرحلة اللوني السائل (ربلك)-مرض التصلب العصبي المتعدد للتحليل البروتينات سليمة8. على الرغم من أن مرض التصلب العصبي المتعدد-تشيكيا إمكانات كبيرة لنطاق واسع من أعلى إلى أسفل البروتيوميات، قد أعاق تطبيقها على نطاق واسع في البروتيوميات العديد من القضايا، بما في ذلك انخفاض تحميل عينة القدرة ونافذة ضيقة الانفصال. العينة النموذجية تحميل وحدة التخزين في تشيكيا هو حوالي 1 في المائة من مجموع حجم الشعرية، الذي يقابل عادة إلى أقل من 100 nL9،10،11. فصل نافذة تشيكيا عادة أقل من 30 دقيقة بسبب9،اليكتروسموتيك قوي التدفق (EOF)10. تحد هذه القضايا تشيكيا-MS/MS للتعرف على عدد كبير من بروتيوفورمس ومنخفضة بروتيوفورمس وفيرة من البروتين معقدة.

بذلت الكثير من الجهد لتحسين نموذج تحميل وحدة التخزين تشيكيا عبر نموذج عبر الإنترنت تركز أساليب (مثلاً، ميكروكستراكشن المرحلة الصلبة [سبمي]12،13، المزودة بحقل نموذج التراص [FESS]9 , 11 , 14، والأس الهيدروجيني دينامية مفرق15،16،،من1718). FESS ومفرق الأس الهيدروجيني الديناميكية أبسط من سبمي، تتطلب فقط اختلاف كبير بين المخزن المؤقت الذي عينة وبج في الموصلية والأس الهيدروجيني. FESS يستخدم المخزن مؤقت عينة مع كثير موصلية أقل مما بجي، مما يؤدي التراص لتحليلها على الحدود بين منطقة العينة ومنطقة بجي في شعري. ملتقى الأس الهيدروجيني دينامية تستخدم المكونات عينة أساسية (مثلاً، بيكربونات الأمونيوم 50 ملم، ودرجة الحموضة 8) وبجي حمضية (مثلحامض الخليك 5% [v/v]، الرقم الهيدروجيني 2.4) على كلا الجانبين من المكونات العينة. بناء على طلب جهد العالي إيجابية في نهاية حقن شعري، يحدث المعايرة للمكونات العينة الأساسية، تركز تحليلها إلى سد ضيقة قبل أن يخضع فصل تشيكيا. في الآونة الأخيرة، مجموعة الشمس بانتظام مقابل FESS ومفرق الأس الهيدروجيني دينامية التراص على الإنترنت من البروتينات سليمة، مما يدل على أن تقاطع الأس الهيدروجيني دينامية يمكن أن تؤدي إلى أداء أفضل بكثير مما FESS لتركيز البروتينات سليمة على الإنترنت عندما وكان حجم العينة حقن 25 في المائة من إجمالي حجم الشعرية19.

فصل المغلفة بصورة محايدة الشعيرات الدموية (مثلاً، بولياكريلاميدي الخطية [[لبا]]) قد استخدمت لتقليل EOF في الشعرية، تباطؤ انفصال تشيكيا واتساع20،نافذة الفصل21. في الآونة الأخيرة، دوفيتشي وضعت المجموعة إجراءات بسيطة لإعداد طلاء بدل الوالد الوحيد المستقر في الجدار الداخلي الشعيرات الدموية، الاستفادة من فوق كبريتات الأمونيوم (الجزائرية) البادئ ودرجة الحرارة (50 درجة مئوية) لإنتاج الجذور الحرة والبلمره22 . مؤخرا جداً، يعمل فريق الشمس فصل الشعرية المغلفة ببدل الوالد الوحيد وأسلوب مفرق الأس الهيدروجيني دينامية لفصل البروتينات سليمة، وتشيكيا التوصل إلى عينة ميكروليتير-مقياس تحميل وحدة التخزين ومن نافذة فصل 90 دقيقة19. هذا نظام تشيكيا يفتح الباب أمام استخدام تشيكيا-MS/MS لنطاق واسع من أعلى إلى أسفل البروتيوميات.

تشيكيا-مرض التصلب العصبي المتعدد يتطلب واجهة قوية للغاية وحساسة للزوجين تشيكيا لمرض التصلب العصبي المتعدد. كانت ثلاثة CE-مرض التصلب العصبي المتعدد الواجهات نمواً جيدا وتسويقها تجارياً في تاريخ CE-مرض التصلب العصبي المتعدد، وهم غمد co-المحوري-تدفق واجهة23، واجهة شعثلس باستخدام تلميح مسامية ك باعث ESI24، والكهربائية-كينيتيكالي غمد ضخ تدفق واجهة25،26. وصلت غمد-واجهة-القائم على التدفق ضخ كينيتيكالي الكهربائية تشيكيا-MS/MS زيبتومولي منخفضة ببتيد الكشف عن الحد الأقصى9، 10,000 أكثر تعريفات الببتيد (IDs) من الحلة الخلية البروتين في واحد تشغيل14، وصف سريع 11من البروتينات سليمة، وتحليلات مستقرة للغاية واستنساخه من الجزيئات الحيوية26. في الآونة الأخيرة، استخدمت الشعرية المغلفة ببدل الوالد الوحيد الفاصل، وطريقة تقاطع الأس الهيدروجيني دينامية، وواجهة تدفق غمد ضخ كينيتيكالي الكهربائية البروتيوميات من أعلى إلى أسفل على نطاق واسع للبروتين الإشريكيّة القولونية (كولاي)19 ،27. منهاج تشيكيا-MS/MS اقترب أكثر من 500 بروتيوفورم المعرفات في واحد تشغيل19 وتقريبا 6,000 بروتيوفورم معرفات عبر اقتران مع حجم الاستبعاد اللوني (ثانية)-ربلك وجود27. تشير النتائج بوضوح قدرة تشيكيا-MS/MS لنطاق واسع من أعلى إلى أسفل البروتيوميات.

ويرد هنا، إجراء مفصل لاستخدام تشيكيا-MS/MS لنطاق واسع من أعلى إلى أسفل البروتيوميات. ويستخدم النظام تشيكيا-MS/MS الشعرية المغلفة ببدل الوالد الوحيد لتقليل الفولكلوري في الشعرية، أسلوب مفرق الأس الهيدروجيني دينامية لتركيز البروتينات، واجهة تدفق غمد ضخ كينيتيكالي الكهربائية لاقتران تشيكيا لمرض التصلب العصبي المتعدد، أوربيتراب الإنترنت الشامل مطياف لجمع أطياف مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد/MS للبروتينات، وبرمجيات توبيك (TOP-Down Mass Spectrometry-Based بروتيوفورم تحديد وتوصيف) لمعرف بروتيوفورم عن طريق قاعدة بيانات البحث.

Protocol

1-إعداد طلاء بدل الوالد الوحيد على الجدار الداخلي لشعري الانفصال

  1. المعالجة المسبقة شعري
    1. مسح شعري والسليكا فوسيد تباعا مع 500 ميليلتر هيدروكسيد الصوديوم 1 م والمياه، وحمض الهيدروكلوريك 1 م، المياه. و LC-MS الصف الميثانول باستخدام مضخة الحقن (120 سم في الطول، 50 ميكرومتر في القطر الداخلي [الهوية]، 360 ميكرومتر في القطر الخارجي [نقلت]).
    2. جاف شعري مع غاز النيتروجين (10 psi ≥ 12 h) وشغل شعري مع 50% (v/v) 3-(تريميثوكسيسيليل) ميثاكريلات روبيل في الميثانول باستخدام مضخة الحقن. ختم طرفي شعري مع المطاط والسيليكا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمالا يقل عن 24 ساعة.
      ملاحظة: أثناء هذه الخطوة، الجدار الداخلي لشعري هو فونكتيوناليزيد مع ج = جيم يعد حضانة النتائج في طلاء الشعرية أفضل بسبب رد فعل أكثر اكتمالا.
    3. قطع جزء صغير (~ 5 مم) شعري من كلا الطرفين بحجر كليافينج. أشطف شعري مع الميثانول (500 ميليلتر) باستخدام مضخة حقنه لتنظيف المواد الكاشفة الممتص. جاف شعري مع غاز النيتروجين (10 psi، ح إيه وان تو).
  2. إعداد طلاء بدل الوالد الوحيد
    ملاحظة: يستند هذا الإجراء إلى تشو et al. 22 مع تعديلات طفيفة.
    1. إعداد حل اكريلاميد (40 مغ من مادة اكريلاميد في 1 مل من الماء) والحل (الجزائرية) فوق كبريتات الأمونيوم (5% [w/v] في الماء).
    2. إضافة 2-3 ميليلتر من الحل وكالة الأنباء الجزائرية إلى 500 ميليلتر من الحل الاكريلاميد، دوامة الخليط، وديغا أنه مع غاز النيتروجين لمدة 5 دقائق لإزالة الأكسجين الموجود في الحل.
    3. تحميل المخلوط في شعري pretreated استخدام فراغ وختم كلا طرفي شعري مع المطاط والسيليكا واحتضان أنه في حمام مائي عند درجة 50 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    4. إزالة جزء صغير (~ 5 ملم) شعري من طرفي بحجر كليفينج. دفع الحل الممتص من شعري بالماء (200 ميليلتر)، باستخدام مضخة الحقن.
      ملاحظة: تأكد من البوليمر يطردون من الشعرية [اغروس] هلام مثل اتساق. خطوة حضانة أطول (ما يصل إلى ~ 45-50 دقيقة) يمكن أن ينتج طلاء شعرية أفضل. فترات أطول من رد فعل، قد تصبح حظر الشعرية والضغط العالي مطلوب لطرد البوليمر مع الماء. يمكن استخدام مضخة [هبلك] لهذا الغرض.

2-النقش شعري مع حمض الهيدروفلوريك

تحذير: استخدام إجراءات السلامة المناسبة أثناء التعامل مع حلول حمض الهيدروفلوريك (HF). جميع العمليات المتصلة بالتردد ضرورة أن يتم ذلك في غطاء كيميائية. قبل أي عملية تتعلق بالتردد، تأكد من أن جل غلوكونات الكالسيوم 2.5% متوفرة للاستخدام في حالة التعرض. قفازات مزدوجة مطلوبة, القفازات قفاز النتريل نموذجية داخل ومن النيوبرين ثقيلة خارج. ارتداء معطف مختبر ونظارات السلامة الكيميائية. بعد عمليات التردد، فصل النفايات الخطرة السائلة والصلبة. يجب تحييد النفايات السائلة التردد فورا بمحلول هيدروكسيد الصوديوم تركيزات عالية للتخزين المؤقت قبل استلام النفايات. HF النفايات الصلبة تحتاج إلى تخزينها مؤقتاً في وعاء من بلاستيك التي تصطف سميكة غالون واحد زيبلوك كيسين من البلاستيك وغطاء. يجب تمييز سواء بالنفايات الصلبة والسائلة بشكل صحيح.

  1. حرق جزء من شعري استخدام لهب لطيف (مثلاً، الجيب أخف) لإزالة بوليميد الخارجي-الطلاء (1 سم في الطول) حوالي 4 سم بعيداً عن نهاية واحدة شعري. بلطف بتنظيف الجزء المحروق شعري بالمسح لإزالة بوليميد طلاء تماما.
    ملاحظة: المضي قدما بحذر، كجزء شعري دون طلاء بوليميد سوف يكون قليلاً هشة.
  2. حفر حفرة صغيرة في نهاية أنبوب 200 ميليلتر حول نفس حجم القطر الخارجي الشعرية لعقد شعري بما فيه الكفاية في مكان مرة واحدة هي مترابطة من خلال هذا الثقب. مؤشر ترابط نهاية شعري الذي يقع بالقرب من الجزء المحروق من خلال الثقب حتى الجزء المحروق في الأنبوب.
    ملاحظة: من المستحسن لاختبار حجم الحفرة مع نهاية الشعرية بعيداً عن الجزء المحروق التأكد من الحجم الصحيح، كما الجزء المحروق شعري لا يزال هشا.
  3. إضافة ~ 150 ميليلتر من التردد (حل 48 إلى 51% في المياه) إلى أنبوب 200 ميليلتر حيث يكون الحل التردد حول في منتصف الطريق حتى الجزء المحروق على الشعرية. احتضان الشعرية في الحل التردد في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة 90-100.
    ملاحظة: من المستحسن أن يتم إنشاء ثقب آخر في غطاء الأنبوب ويستخدم بعض وجوه صغيرة (مثلاً، تلميح ماصة صغيرة) لتصمد الأنبوب بينما تجري الحضانة. يمكن استخدام تلميح ماصة للثقب رغوة أو بعض أخرى أرضية صلبة الذي شنق دائرة رد الفعل من خلق بيئة آمنة. وضع مناشف ورقية أدناه أنبوب يحتوي على التردد واتباع الإجراءات السليمة في حالة انسكاب.
  4. إزالة شعري من الأنبوب وتغسل من الخارج مع المياه لإزالة أي بقايا التردد.
    ملاحظة: تأكد من أن القطر الخارجي شعري في الجزء أضيق من الجزء المحروق الآن أصغر من 100 ميكرومتر، كما ينبغي أن يكون.
  5. قص الجزء المحفور شعري في منتصف الجزء أضيق باستخدام حجر كليفينج لإنتاج شعري انفصال مع أقل من 100 ميكرومتر في نقلت في نهاية واحدة. قطع النهاية غير محفوراً شعري للحصول على فصل 1-m الشعرية.
    ملاحظة: التخلص من النفايات ذات التردد العالي ووفقا لبروتوكول مؤسسياً المنصوص عليها.

3-إعداد العينات

  1. إعداد خليط البروتين القياسية
    1. إعداد خليط بروتين قياسية تحتوي على السيتوكروم ج (Cyto.c، 12 كاتشين، 0.1 مغ/مل)، ليسوزيمي (14.3 كاتشين، 0.1 مغ/مل)، β-الكازين (24 كاتشين، 0.4 ملغ/مل)، الميوجلوبين (16.9 كاتشين، 0.1 مغ/مل)، anhydrase الكربونية (كاليفورنيا، 29 كاتشين، 0.5 ملغ/مل) والبومين المصل البقري (جيش صرب البوسنة، كاتشين 66.5 ، 1.0 ملغ/مل) في مرض التصلب العصبي المتعدد-LC الصف المياه كحل أسهم.
      ملاحظة: يمكن أن يكون الحل الأسهم الكوتيد والمخزنة في-80 درجة مئوية للاستخدام.
    2. تمييع الحل الأسهم بمقدار 10 بمحلول بيكربونات الأمونيوم 50 مم (pH 8.0) في المياه الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد لتحليل تشيكيا-مرض التصلب العصبي المتعدد.
      ملاحظة: تصفية حل بيكربونات الأمونيوم قبل الاستخدام مع عامل تصفية الأغشية (مثلاً، 0.2 ميكرون غشاء نترات السيليلوز وقطرها 50 ملم).
  2. إعداد عينة كولاي
    1. ثقافة الخلايا كولاي (K-12 MG1655) في المتوسطة رطل في 37 درجة مئوية بينما تهز 225 لفة في الدقيقة حتى تقترب 0.7 من قيمة OD600. جمع كولاي الخلايا عن طريقالطرد المركزي (س 3,283 ز، 10 دقيقة) وغسلها عدة مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة المتوسطة.
    2. تعليق الخلايا كولاي في المخزن المؤقت لتحلل المحتوية على اليوريا ومثبطات البروتياز بيكربونات الأمونيوم 100 مم (pH 8.0) 8 أمتار، وأولتراسونيكاتي على الجليد لمدة 15 دقيقة باستخدام disruptor خلية بالموجات فوق الصوتية مع قرن كأس لتحلل الخلية كاملة.
      1. تعيين دورة الخدمة (%) إلى 50 وتعيين التحكم الإخراج إلى 7 ل disruptor الخلية بالموجات فوق الصوتية.
    3. الطرد المركزي في س 18,000 ز لأدنى 10 جمع المادة طافية وتجاهل بيليه. استخدام قاسمة صغيرة من المادة طافية لقياس تركيز البروتين مع مقايسة حمض (اتفاق التعاون الأساسي) بيسينتشونينيك.
      ملاحظة: احتياجات ليساتي إضعاف على الأقل بمقدار ثلاثة إلى خفض تركيز اليوريا أقل من 3 أمتار لتصبح متوافقة مع المقايسة اتفاق التعاون الأساسي. يتم إجراء الفحص اتفاق التعاون الأساسي استناداً إلى الإجراء الخاص بالشركة المصنعة.
    4. ميكس 1 ملغ من البروتينات كولاي مع الأسيتون البارد مع نسبة حجم 1:4 ونضع الخليط في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها التعجيل البروتينات.
      ملاحظة: إجراء جميع التجارب باستخدام الأسيتون في غطاء كيميائية.
    5. تدور أسفل البروتينات سرع (12,000 س ز، 5 دقيقة) وإزالة المادة طافية. أغسل بيليه مع الأسيتون البارد مرة أخرى (نفس الحجم كما في السابق) وتدور إلى أسفل مرة أخرى.
    6. إزالة المادة طافية والسماح لبيليه لتجف في هود الكيميائية لبضع دقائق.
      ملاحظة: لا أوفيردري بيليه البروتين.
    7. حل سرع كولاي البروتينات (1 ملغ) في 200 ميليلتر من اليوريا 8 أمتار في بيكربونات الأمونيوم 100 مم (pH 8.0).
    8. تؤذي والحد من الكيلات العينة.
      1. احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تجريدها من البروتينات.
      2. الحد مع ديثيوثريتول (DTT) بإضافة 2 ميليلتر لحل DTT 1 م (ببيكربونات الأمونيوم 100 ملم) في العينة وتفرخ العينة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      3. الكيلاتي البروتينات مع إيودواسيتاميدي (IAA) عن طريق إضافة ميليلتر 6 1 م حل الأكاديمية (في بيكربونات الأمونيوم 100 ملم) للعينة واحتضان العينة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
      4. إخماد الأكاديمية الزائدة مع DTT بإضافة 2 ميليلتر لحل DTT م 1 واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أسيديفي العينة مع حمض الفورميك (FA) للحصول على تركيز فا نهائي من 1% (v/v).
        ملاحظة: يتم تنفيذ الحد والالكله المعونة تتكشف من البروتينات لتجزئة المتلقين للمعلومات. تلك الخطوات سوف تفقد المعلومات ثنائي كبريتيد السندات. إذا كان الهدف دراسة سندات ثنائي كبريتيد على البروتينات، تجنب تلك الخطوات. تذكر أن التعامل مع جميع حلول حمض تتركز في غطاء كيميائية.
    9. تحلية العينة باستخدام عمود فخ C4 (مثلاً، 4 مم للهوية، 10 ملم في الطول، ومعبأة مع جزيئات 3 ميكرومتر بعد 300 المسام) مع نظام [هبلك]. استخدام جهاز لكشف الأشعة فوق البنفسجية في طول جه 254 نانومتر للكشف.
      1. تعيين معدل تدفق المرحلة المتنقلة إلى 1 مل/دقيقة تنشيط العمود بالمسح عليه مع 0.1% 80% (v/v) الاسيتو الانيتريل (ACN)، اتحاد كرة القدم في الماء لمدة 10 دقائق، وحجته بالتنظيف من 2% (v/v) تزاول، 0.1% اتحاد كرة القدم في الماء لمدة 10 دقائق.
      2. تحميل 500 ميكروغرام البروتينات على العمود وتحلية بالتنظيف لهم مع 2% (v/v) تزاول، 0.1% اتحاد كرة القدم في الماء لمدة 10 دقيقة بمعدل تدفق 1 مل/دقيقة.
      3. الوتي البروتينات مع 80% (v/v) تزاول، 0.1% اتحاد كرة القدم في الماء لمدة 3 دقيقة بمعدل تدفق 1 مل/دقيقة. جمع النذرة وليوفيليزي أنه مع مركز فراغ.
        ملاحظة: يمكن استخدام العمود فخ C4 تحلية كميات كبيرة من البروتينات ولكن ميكروغرام ليست منخفضة من البروتينات بسبب فقدان عينة ممكنة. لمواد البروتين محدودة، النظر في استخدام تلميحات ماصة مع الوسائط C4 للبروتين الملحي. احرص على عدم أوفيردري البروتينات عند ليوفيليزينج العينة.
    10. حل 500 ميكروغرام من البروتينات (على افتراض عدم فقدان عينة أثناء إعداد عينة) في 250 ميليلتر من بيكربونات الأمونيوم 50 مم (pH 8.0) لتجارب تشيكيا-مرض التصلب العصبي المتعدد.

4-إنشاء نظام تشيكيا-MS/MS وتحليل العينات

  1. إنشاء نظام CZE
    1. إعداد بجي التي تحتوي على 5% أو حمض الخليك 10% (v/v) (~2.4 درجة الحموضة أو ~ 2.2) في مرض التصلب العصبي المتعدد-LC الصف المياه. وضع مل ~1.5 بج بج قنينة تتوافق مع علبة المخزن المؤقت من أوتوسامبلير تشيكيا.
      ملاحظة: جعل بج جديدة كل أسبوع وتغيير الحل بج في القنينة كل يوم لتجنب أي تلوث.
    2. إضافة حل نموذج (5-200 ميليلتر) إلى أنبوب إدراج ووضع أنبوب إدراج موضع عينة قنينة ثاتماتشيس مع علبة عينة من أوتوسامبلير تشيكيا.
    3. تحميل العينة وبج وفصل الشعرية أوتوسامبلير تشيكيا.
      ملاحظة: اللغة المستخدمة في هذا البروتوكول الأكثر دقة يعكس استخدام أوتوسامبلير خاصة واحدة (انظر الجدول للمواد)، ولكن يمكن تطبيق المبادئ الأخرى أوتوسامبليرس.
      1. حدد تحميل نموذج في صفحة التحكم اليدوي في أوتوسامبلير تشيكيا. تحميل القنينة بجي داخل علبة المخزن المؤقت من أوتوسامبلير، مشيراً إلى موقفها في علبة المخزن المؤقت. تحميل القنينة نموذج إلى علبة عينة من أوتوسامبلير، مشيراً إلى موقفها في علبة عينة.
        ملاحظة: الأداة يمكن أن تعمل في التحكم اليدوي بالنقر على صورة الصك مراقبة الجهاز الأداة الرئيسية في الصفحة ثم تحديد دليل تحت السيطرة المباشرة.
      2. تحميل الشعرية فصل أوتوسامبلير تشيكيا، استخدام النهاية غير محفوراً شعري. وضع في أوتوسامبلير إلى موضع المحاذاة باستخدام التحكم اليدوي. مؤشر ترابط النهاية غير محفوراً شعري في حفرة يستخدم للاحتفاظ بالفصل الشعرية حتى لا تكون مترابطة ماديا كذلك.
        ملاحظة: في هذه الحالة، نهاية شعري تقريبا في نفس ارتفاع نهاية القطب، ومطلوب على الأقل 50 ميليلتر من العينة في القنينة عينة للتأكد من نهاية شعري هو مغمورة في العينة أثناء حقن. إذا كان حجم العينة منخفضة (أي، 5 ميليلتر)، وارتفاع نهاية حقن من الشعرية تحتاج إلى تعديلها كما هو موضح في الخطوة 4.1.3.2.1.
        1. ضبط ارتفاع نهاية حقن شعري إذا كان حجم العينة أقل من 50 ميليلتر (أي، 5 ميليلتر). قم بالتبديل أوتوسامبلير إلى وضع الاستعداد باستخدام التحكم اليدوي. اكتب الموضع عينة في النظام والانتقال الشعرية إلى العينة. دفع نهاية حقن شعري كذلك وصولاً إلى الوصول إلى الجزء السفلي من نموذج القنينة.
          ملاحظة: في هذه الحالة، حقن عينة يمكن تنفيذها مع عينة من فقط 5 ميليلتر في القنينة.
      3. الاستمرار في استخدام عنصر التحكم اليدوي، وتدفق شعري مع بجي لمدة 20 دقيقة، باستخدام ضغط 20 رطل/بوصة مربعة.
  2. إنشاء واجهة تشيكيا-مرض التصلب العصبي المتعدد
    1. سحب البورسليكات زجاج شعرية (1 مم نقلت، 0.75 ملم في الهوية، طولها 10 سم) في اثنين من بواعث اليكتروسبراي مع فوهة من 20-40 ميكرومتر في نقلت
      ملاحظة: الاحتفاظ بطول باعث اليكتروسبراي 4-5 سم وقطع عليه بحجر كليفينج إذا لزم الأمر. التخلص من الزجاج جميع النفايات في حاوية الأدوات الحادة. فيما يلي الإعدادات للحصول على نصائح 20 إلى 40 ميكرومتر. تعيين الحرارة إلى 498، السحب إلى 5، السرعة إلى 10، والتأخير إلى 150، والضغط إلى 200. التحقق من حجم الانبعاثات مع مجهر قبل الاستخدام. تعديل المعلمات قليلاً إذا لزم الأمر.
    2. جبل تدفقا غمد ضخ كينيتيكالي الكهربائية تجارية واجهة (انظر الجدول للمواد) على الجزء الأمامي مطياف كتلة. ملء الخزان الاحتياطي غمد مع عازلة التي تحتوي على الميثانول 10% (v/v) و 0.2% (v/v) اتحاد كرة القدم في المياه الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
    3. مسح تي في الواجهة مع غمد المخزن المؤقت عن طريق تطبيق الضغط يدوياً مع حقنه. الموضوع 1-مم-نقلت نهاية باعث اليكتروسبراي عن طريق أنابيب كم والاتصال الباعث مع منفذ واحد تيعبر مناسب. ببساطة مطاردة تي يدوياً مرة أخرى مع حقنه لملء الباعث مع غمد المخزن المؤقت.
    4. ضبط المسافة بين الفوهة للباعث ومدخل مطياف كتلة ~ 2 ملم مع مساعدة الكاميرا التي تأتي مع الواجهة. تطبيق جهد 2-2.2 كيلوفولت في القنينة غمد المخزن المؤقت اليكتروسبراي. ضبط الجهد رذاذ للوصول إلى اليكتروسبراي مستقرة.
      ملاحظة: إذا لوحظ لا اليكتروسبراي أو اليكتروسبراي غير مستقرة، تحقق من واجهة للتأكد من عدم وجود لا فقاعات كبيرة في باعث T، وفي الأنبوب الذي يستخدم لتوصيل القنينة المخزن المؤقت غمد و T. ويمكن تقدير المسافة بين الفوهة للباعث ومدخل مطياف كتلة تقريبا بمقارنته مع نقلت 1 ملم للباعث. الجهد رذاذ يعتمد على حجم الباعث. لبواعث 20 إلى 40 ميكرومتر، 2-2.2 كيلوفولت جيدة بما يكفي. تذكر دائماً أن تكون حذراً عند استخدام الفولتية العالية.
    5. إيقاف الجهد الرذاذ والخيط محفوراً نهاية فصل الشعرية من خلال تي إلى الباعث بلطف حتى لا يتم دفع المزيد. تطبيق ضغط منخفض (أي، 5 رطل/بوصة مربعة) في نهاية حقن شعري خلال هذه العملية للتأكد من أن هناك لا فقاعات في شعري.
      ملاحظة: شعري متصل تي عبر أنابيب كم ومناسب. ضبط موضع نهاية محفوراً شعري في الباعث بمساعدة الكاميرا إلى داخل 500 ميكرومتر. ويمكن تقدير المسافة تقريبا بمقارنته مع نقلت 1 ملم للباعث.
    6. وقف الضغط المنخفض في نهاية حقن شعري. دافق الباعث قليلاً مع غمد المخزن المؤقت. ومرة أخرى، تطبيق كيلوفولت 2-2.2 من الجهد الرش لاختبار الرذاذ.
  3. إنشاء أسلوب تشيكيا لحقن العينة والفصل، بيغ الشعرية وأحداث من مطياف الشامل للحصول على البيانات
    1. حدد أسلوب جديد تحت القائمة المنسدلة ملف على الشاشة أداة رئيسية للشروع في أسلوب جديد.
    2. حدد مدخل ك SV/EV، ضغط كهذه المبادرة 5 كيلوفولت ، درج كعينة 0، و المدة ك 95 s لحقن عينة.
      ملاحظة: يتم حقن العينة إلى الشعرية عن طريق الضغط. يمكن حساب حجم حقن عينة استناداً إلى الوقت الضغط والحقن باستخدام القانون بوازوي. على سبيل المثال، يناظر 5 رطل/بوصة مربعة لحقن عينة 95-s حوالي 500 nL من عينة-تحميل وحدة التخزين لطوله 1 م فصل شعرية (معرف 50 ميكرومتر).
    3. حدد المعلمات لانفصال تشيكيا وإعداد معلمات لتحريك الحصول على البيانات.
      1. تعيين مدخل كالاستثمارات، ضغط كهذه المبادرة 0 كيلوفولت ، درج كالمخزن المؤقت 30، و المدة ك 4,200 s لفصل العينة خليط البروتين القياسية. تعيين مدخل كالاستثمارات، ضغط كهذه المبادرة 0 كيلوفولت ، درج كالمخزن المؤقت 20، و المدة ك 6,600 s لفصل العينة البروتين القولونية هاء .
        ملاحظة: يطبق للفصل التيار الكهربائي يمكن تعديلها استناداً إلى تعقيد عينة. لعينات بسيطة البروتين، 30 كيلو فولت يمكن تطبيقها لتسريع التحليل. للحصول على نماذج معقدة، 20 كيلوفولت يتم تطبيقها على إبطاء الفصل واكتساب مزيد من الأطياف MS/MS بروتيوفورم معرفات.
      2. قم بإعداد المعلمات لتحريك الحصول على البيانات ضمن الأحداث في الوقت المناسب. تعيين الوقت (s) ك 0.0 و نوع وصفه التتابع 1 تنشيط في الخطوة 1؛ تعيين الوقت (s) 1.0 و نوع وصفه التتابع 1 التنشيط في الخطوة 2.
    4. حدد مدخل كالاستثمارات، ضغط كهذه المبادرة 10 كيلوفولت ، درج كالمخزن المؤقت 30، و مدة 600 s للتنظيف الشعرية.
    5. حفظ الملفات الأسلوب لتشيكيا-مرض التصلب العصبي المتعدد وتجارب MS/MS.
  4. إنشاء مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد/MS
    1. قم بإعداد المعلمات مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد/مرض التصلب العصبي المتعدد لتحليل البروتين سليمة باستخدام الرباعي أيون فخ مطياف كتلة (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: وضع أيون إيجابية وارتفاع الطاقة الاصطدامية الانفصال (HCD) لتجزئة يعملون.
      1. قم بضبط إعدادات ملف النغمة: تشغيل وضع البروتين سليمة واستخدام ضغط ملائمة من 0.2. تعيين نقل أيون الشعرية حتى 320 درجة مئوية درجة الحرارة ومستوى الترددات اللاسلكية s-العدسة إلى 55.
      2. بناء ملف طريقة مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد/مرض التصلب العصبي المتعدد.
        1. لكامل مرض التصلب العصبي المتعدد، تعيين العدد من ميكروسكانس إلى 3، القرار 240,000 (في ض م/ 200)، وقيمة الهدف التحكم (AGC) الكسب التلقائي إلى 1E6 والوقت حقن الحد الأقصى إلى 50 مللي، ونطاق المسح إلى 600-2000 m/z.
      3. ل MS/MS، استخدام البيانات تعتمد على اقتناء (DDA) لثمانية الأيونات الأكثر كثافة في طائفة كاملة من مرض التصلب العصبي المتعدد. تعيين إطار العزلة إلى 4 m/z وتطبيع الاصطدامية الطاقة (NCE) بنسبة 20%. تعيين العدد من ميكروسكانس إلى 1، القرار إلى 120 (في ض م/ 200) وأن 1E5 قيمة الهدف AGC ووقت حقن أقصى 200 مرض التصلب العصبي المتعدد.
      4. تعيين العتبة كثافة لتحريك التجزؤ إلى 1E5 وتعيين الأيونات مع دولة رسوم أعلى من 5 لتكون معزولة للتجزؤ. بدوره على استبعاد النظائر وتعيين استبعاد الديناميكية إلى 30 ثانية.
        ملاحظة: يمكن زيادة عدد ميكروسكانس ل MS/MS إلى 3. وفي هذه الحالة، يمكن استخدام أسلوب Top3 أجندة الدوحة للتنمية من أجل تقليل وقت دورة.
    2. قم بإعداد اتصال سلكي بين أوتوسامبلير CE ومطياف كتلة لتحريك التلقائية للحصول على البيانات. الاتصال نهاية واحد من الأسلاك "التتابع 1 الاتصال" و ترحيل 1 الاتصال ب على الجزء الخلفي أوتوسامبلير م. توصيل الطرف الآخر من السلك تبدأ في-- و "ابدأ في" + على جانب مطياف كتلة.
  5. تشيكيا-MS/MS التجربة وتحليل العينات
    1. تطبيق 30 كيلو فولت باستخدام عنصر التحكم اليدوي CE في نهاية حقن العينة ووادي الملوك 2-2.2 في غمد القنينة المخزن المؤقت باستخدام إمدادات الطاقة الخارجية لاختبار فصل الشعرية واليكتروسبراي.
      ملاحظة: الفصل الحالي، وفي هذه الحالة، حوالي 8-9 µA إذا تم استخدام حامض الخليك 5% (v/v) كما بجي.
    2. قم بإعداد تسلسل اقتناء بيانات على الكمبيوتر مطياف كتلة بتحديد تسلسل جديد.
      1. حدد غير معروف كنوع النموذج وقم بتعيين اسم الملف والمسار. الإشارة إلى أسلوب مرض التصلب العصبي المتعدد لاستخدامها لكل عينة تشغيل ضمن أسلوب الصك.
        ملاحظة: نظراً لوجود جهاز كمبيوتر منفصل للسيطرة على أوتوسامبلير CE، لا تحتاج الموقف عينة الذي يتم تحديده هنا.
    3. قم بإعداد تسلسل انفصال تشيكيا على الكمبيوتر CE للإشارة إلى موقف المخزن المؤقت، وموقف العينة، وطريقة تشيكيا. لبدء تسلسل جديد، حدد تسلسل ضمن القائمة المنسدلة تحليل الأداة الرئيسية في الصفحة.
    4. ابدأ أسلوب الحصول على البيانات على الكمبيوتر مطياف كتلة أولاً بتحديد تسلسل تشغيل (أو تشغيل نموذج لتشغيل واحد). ثم بدء تشغيل تسلسل CE على الكمبيوتر أوتوسامبلير CE.
      ملاحظة: عند فصل التيار الكهربائي بعد حقن العينة، يتم إرسال إشارة إلى مطياف كتلة لتحريك الحصول على البيانات من أوتوسامبلير م. الفصل الحالي سينخفض في بداية خلال الفصل سبب التراص عينة مفرق دينامية الأس الهيدروجيني. ثم، استرداد الحالي تدريجيا.

5-قاعدة بيانات البحث عن الملفات الخام التي تم جمعها مع البرنامج توبيك

  1. نقل ملفات.raw، بما في ذلك البيانات مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد/مرض التصلب العصبي المتعدد، من الكمبيوتر مطياف الشامل لجهاز كمبيوتر مخصص للبحث في قاعدة البيانات.
    ملاحظة: ملفات.raw هذه قد تكون كبيرة وتتطلب جهاز كمبيوتر قوية بغية التوصل إلى بحث قاعدة بيانات بسرعة.
  2. تحميل جناح بروتيوويزارد وتوبيك على الكمبيوتر مخصصة للبحث في قاعدة البيانات.
    ملاحظة: جناح بروتيوويزارد وتوبيك هي برمجيات المصدر المفتوح، ويمكن الاطلاع على شبكة الإنترنت (بروتيوويزارد: http://proteowizard.sourceforge.net; جناح توبيك: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). أونيبروت قواعد البيانات المستخدمة لعمليات البحث في قاعدة البيانات ويمكن الاطلاع على الموقع الإلكتروني أونيبروت.
  3. تحويل ملفات.raw الملفات.mzML مع مسكونفيرت، وأداة تحويل تنسيق MS ملف في بروتيوويزارد28. في واجهة المستخدم الرسومية مسكونفيرت (MSConvertGUI.exe)، انقر فوق الزر استعراض وحدد الملف.raw ليتم تحويلها. حدد مزمل كتنسيق الإخراج، وإبقاء جميع الخيارات الأخرى في القيم الافتراضية الخاصة بهم. انقر فوق الزر ابدأ في الجانب السفلي الأيسر من واجهة المستخدم الرسومية.
  4. تحويل ملفات.mzML.msalign الملفات باستخدام أداة توبفد في جناح توبيك29.
    1. في "واجهة المستخدم الرسومية توبفد" (topfd_gui.exe)، انقر فوق الزر ملف وحدد ملف.mzML الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة. الحفاظ على القيم الافتراضية للمعلمات، ومن ثم انقر فوق الزر ابدأ في الجانب السفلي الأيسر من واجهة المستخدم الرسومية.
      ملاحظة: توبفد بتحويل السلائف ويفتت كتل النظائر للجماهير مونويسوتوبيك ويحدد السمات بروتيوفورم المحتملة في البيانات MS1 بالجمع بين مجموعات السلائف النظائر مماثلة مونويسوتوبيك الجماهير وأوقات الهجرة الوثيق. سيتم إنشاء ملفات ثلاثة من توبفد، بما في ذلك ملف ms1.msalign وملف ms2.msalign وملف.feature. تحتوي الملفات ms1.msalign و ms2.msalign على الجماهير مونويسوتوبيك ديكونفولوتيد MS1 ومرض التصلب العصبي المتعدد/مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف، على التوالي. الملف.feature يحتوي على ميزات بروتيوفورم الممكنة.
  5. إجراء بحث قاعدة بيانات مع توبيك (الإصدار 1.1.3) في جناح توبيك30.
    1. في GUI توبيك (toppic_gui.exe)، انقر فوق ملف قاعدة البيانات وقم بتحديد قاعدة بيانات مناسبة للبحث.
    2. انقر فوق الملف الطيف وحدد الملف ms2.msalign التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.4.1 كالإدخال. تحديد MS1 ميزة ملف واختر ملف.feature التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.4.1.
    3. تعيين سيستين كارباميدوميثيليشن (C57) كتعديل ثابت بسبب معاملة الأكاديمية الدولية.
      ملاحظة: ملف نصي يمكن أيضا إنشاء مع مختلف التعديلات ثابتة بمحرر نص. وبعد ذلك، يمكن تحديد ملف نصي باستخدام الزر الملف إلى جانب التعديلات ثابت في "واجهة المستخدم الرسومية توبيك".
    4. حدد ميزة شرك قاعدة البيانات ، وتحت إعدادات استقطاع، حدد فرانكلين روزفلت (معدل اكتشاف كاذبة) في القائمة المنسدلة الموجودة بجانب مستوى الطيف. تعيين فرانكلين روزفلت إلى 0.01 في مستوى الطيف و 0.05 على مستوى بروتيوفورم.
      ملاحظة: توبيك يوفر خيارات متعددة لتصفية النتائج: مستوى الطيف فرانكلين روزفلت، فرانكلين روزفلت بروتيوفورم-مستوى، أو كليهما. يتم تقييم فرانكلين روزفلت استناداً إلى نهج المستهدفة-شرك31.
    5. ترك وظيفة توليد غير محددة وتعيين الخطأ التسامح (جزء في المليون) إلى 15.
    6. تحت معلمات متقدمة، حدد 2 للحد الأقصى لعدد من التحولات الجماعية في القائمة المنسدلة. تعيين إزاحة الكتلة الحد الأقصى (دا) من التعديلات غير معروف إلى 500 da. ترك كافة المعلمات الأخرى في القيم الافتراضية وانقر فوق الزر ابدأ في أسفل يسار واجهة المستخدم الرسومية.
      ملاحظة: البرنامج توبيك إنشاء اثنين من الملفات النصية الناتجة. الملف مع اللاحقة. OUTPUT_TABLE يحتوي على قائمة التطابقات الطيف بروتيوفورم المحددة (برسمس)، وواحدة مع لاحقة. FORM_OUTPUT_TABLE يحتوي على قائمة بروتيوفورمس التي تم تحديدها. لكل برسم، البرنامج يوفر معلومات عامة عن المباراة، وتجزئة لوحظ نمط، وأيونات يفتت المتطابقة، ووسائل الكشف عن التحولات.

النتائج

ويبين الشكل 1 مخططا لنظام ديناميكي تشيكيا-أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد المستندة إلى مفرق الأس الهيدروجيني المستخدمة في التجربة. المكونات طويلة من العينة في المخزن مؤقت أساسية يحقن المغلفة ببدل الوالد الوحيد فصل شعرية مليئة بجي حمضية. بعد تطبيق الف?...

Discussion

هنا نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام تشيكيا-MS/MS لتوصيف الاستبانة بروتيوفورمس في عينات بسيطة البروتين وتحديد بروتيوفورمس في عينات البروتين معقدة واسعة النطاق. رسم تخطيطي لمنظومة تشيكيا-ESI-MS/MS يرد في الشكل 1. هناك أربع خطوات حاسمة في البروتوكول. أولاً، إعداد عالي الجودة [لبا] الطل...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون مجموعة هيديوك هونغ في قسم الكيمياء، جامعة ولاية ميشيغان، يرجى توفير خلايا الإشريكيّة القولونية للتجارب. يشكر المؤلفون الدعم من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة، والوطنية معاهد للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) من خلال منحة R01GM118470 (على X. Liu) ومنحة R01GM125991 (للأم الشمس و X. Liu).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Fused silica capillaryPolymicro Technologies106815001750 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pelletsMacron Fine Chemicals7708-10Corrosive
LC-MS grade waterFisher ScientificW6-1
Hydrochloric acidFisher ScientificSA48-1Corrosive
MethanolFisher ScientificA456-4Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateSigma-AldrichM6514Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acidAcros Organics423805000Highy toxic
AcrylamideAcros Organics164855000Toxic, health hazard
Ammonium persulfateSigma-AldrichA3678Health hazard, Oxidizer
lysozymeSigma-AldrichL6876
Cytochrome CSigma-AldrichC7752
MyoglobinSigma-AldrichM1882
ß-caseinSgma-AldrichC6905
Carbonic anhydraseSigma-AldrichC3934
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
UreaAlfa Aesar36428-36
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD0632Health Hazard
IodoacetamideFisher ScientificAC122270250Health Hazard
Formic AcidFisher ScientificA117-50Corrosive, Health Hazard
C4 trap columnSepax Technologies110043-4001C3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
AcetonitrileFisher ScientificA998SK-4Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich1066-33-7
Nalgene rapid-flow filtersThermo Scientific126-00200.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cellsK-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered salineSigma-AldrichD8537
BCA assayThermo Scientific23250
AcetoneFisher ScientificA11-1
HPLC system for protein desaltingAgilient1260 Infinity II
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
CE autosamplerCMP ScientificECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interfaceCMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette pullerSutter InstrumentsP-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysisBranson101063196Model S-250A
Vaccum concentratorThermo Fisher ScientificSPD131DDA-115

References

  1. Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
  2. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
  3. Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
  4. Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
  5. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
  6. Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
  7. Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
  8. Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
  9. Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
  10. Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
  11. Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
  12. Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
  13. Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
  14. Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
  15. Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
  16. Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
  17. Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
  18. Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
  19. Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
  20. Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
  21. Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
  22. Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
  23. Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
  24. Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
  25. Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
  26. Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  27. McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
  28. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  29. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
  30. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  31. Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
  32. Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
  33. Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
  34. Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
  35. Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved