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Résumé

Un protocole détaillé est décrit pour la séparation, l’identification et la caractérisation des proteoforms dans des échantillons de protéine à l’aide de la zone capillaire électrophorèse-electrospray ionisation-spectrométrie de masse (CZE-ESI-MS/MS). Le protocole peut être utilisé pour la caractérisation à haute résolution des proteoforms dans des échantillons de protéine simple et l’identification à grande échelle des proteoforms dans des échantillons de protéome complexe.

Résumé

Zone de capillarité électrophorèse-electrospray ionisation-spectrométrie de masse (CZE-ESI-MS/MS) a été reconnue comme un outil utile pour la protéomique de haut en bas qui a pour but de caractériser proteoforms dans protéomes complexes. Toutefois, l’application de CZE-MS/MS pour la protéomique de haut vers le bas à grande échelle ont été entravés par la faible capacité de chargement d’échantillon et étroite fenêtre de séparation de CZE. Ici, un protocole est décrit à l’aide de CZE-MS/MS avec un volume de chargement d’échantillon de microlitre-échelle et une fenêtre de 90 min de séparation pour la protéomique à grande échelle de haut en bas. La plate-forme CZE-MS/MS est basée sur un linéaire polyacrylamide (LPA)-enduite séparation capillaire avec électroosmotique extrêmement faible, une méthode de concentration dynamique échantillon en ligne basé sur la jonction-pH avec un rendement élevé pour le gerbage de protéine, une Electro-cinétiquement pompé gaine flux CE-MS interface avec la sensibilité extrêmement élevée et un spectromètre de masse de piège à ions à haute résolution de masse et la vitesse de numérisation. La plate-forme peut être utilisée pour la caractérisation à haute résolution des échantillons simple protéine intacte et la caractérisation à grande échelle des proteoforms dans différents protéomes complexes. À titre d’exemple, une séparation très efficace d’un mélange de protéines standard et une détection très sensible de beaucoup d’impuretés à l’aide de la plate-forme sont démontrées. Comme autre exemple, cette plate-forme peut produire plus de 500 proteoform et exécutent 190 identifications de protéine d’un proteome de Escherichia coli dans un seul CZE-MS/MS.

Introduction

Protéomique de haut en bas (TDP) vise la caractérisation à grande échelle des proteoforms au sein d’un proteome. TDP s’appuie sur la séparation de phase liquide efficace des protéines intactes avant l’analyse par spectrométrie de masse en tandem d’ionisation (ESI-MS/MS) électrospray en raison de la grande complexité et plage dynamique importante concentration du protéome1,2 ,3,4,5. L’électrophorèse capillaire de zone (CZE) est une technique puissante pour la séparation des biomolécules basé sur leurs rapports taille-à-charge6. CZE est relativement simple, nécessitant uniquement un ouvert tubulaire fusionnés avec silice capillaire, un électrolyte de fond (BGE) et un bloc d’alimentation. Un échantillon de protéines intactes peut être chargé dans le capillaire à l’aide de pression ou la tension, et séparation est enclenchée en immergeant les deux extrémités du capillaire dans le BGE et en appliquant une tension élevée. CZE peut approcher l’efficacité de séparation très haute (> 1 million de plateaux théoriques) pour la séparation des biomolécules7. CZE-MS a une sensibilité considérablement plus élevée que couramment chromatographie à phase inversée (RPLC)-MS pour l’analyse des protéines intactes,8. Bien que CZE-MS a un grand potentiel pour la protéomique à grande échelle de haut en bas, sa large application en protéomique a été entravée par plusieurs questions, notamment une faible capacité de chargement d’échantillon et une fenêtre étroite de séparation. L’exemple typique chargement volume dans CZE est environ 1 % du volume total capillaire, qui correspond habituellement à moins de 100 nL9,10,11. La fenêtre de la séparation de CZE est habituellement moins de 30 min, en raison de la forte électro-osmotique écoulement (EEO)9,10. Ces problèmes limitent la CZE-MS/MS pour l’identification d’un grand nombre de proteoforms et faible proteoforms abondante d’un complex proteome.

Beaucoup d’efforts réalisé pour améliorer l’exemple chargement volume de CZE via en ligne échantillon concentration méthodes (par exemple, solid-phase microextraction [SPME]12,13, champ-enhanced échantillon empilement [coupé]9 , 11 , 14et dynamique pH jonction15,16,17,18). FASCE et jonction de pH dynamiques sont plus simples que SPME, ne nécessitant qu’une différence significative entre le tampon et la BGE conductivité et pH. FASCE emploie un tampon échantillon beaucoup plus faible conductivité que la BGE, conduisant à un empilement des analytes à la limite entre la zone de l’échantillon et la zone BGE dans le capillaire. Jonction de pH dynamique utilise une prise d’échantillon de base (par exemple, bicarbonate d’ammonium 50 mM, pH 8) et un acide BGE (par exemple, l’acide acétique 5 % [v/v], pH 2.4) des deux côtés de la prise d’échantillon. À la demande d’une haute tension positive à la fin de l’injection du capillaire, titrage de la prise de l’échantillon de base se produit, mise au point de l’analyser dans un bouchon étanche avant de subir une séparation CZE. Récemment, le groupe Sun systématiquement contre FESS et jonction de pH dynamique pour l’empilage en ligne de protéines intactes, démontrant que la jonction pH dynamique pourrait produire de bien meilleures performances que la fasce pour la concentration en ligne de protéines intactes lorsque volume d’injection de l’échantillon était de 25 % du volume capillaire total19.

Séparation neutre enduits capillaires (p. ex., polyacrylamide linéaire [APL]) ont été employés pour réduire les expressions du folklore dans le capillaire, ralentissant la séparation CZE et élargissant la séparation fenêtre20,21. Récemment, le groupe Dovichi mis au point une procédure simple pour la préparation de l’enduit APL stable sur la paroi des capillaires, utilisant le persulfate d’ammonium (APS) comme l’initiateur et de la température (50 ° C) pour la production de radicaux libres et de polymérisation22 . Très récemment, le groupe Sun employée la séparation LPA-enduit capillaire et la méthode de jonction pH dynamique pour la séparation de CZE des protéines intactes, pour atteindre un échantillon de microlitre-échelle de chargement volume et une fenêtre de séparation de 90 min19. Ce système CZE ouvre la porte à l’utilisation de CZE-MS/MS pour la protéomique à grande échelle de haut en bas.

CZE-MS nécessite une interface hautement robuste et sensible au couple CZE à MS. Trois interfaces de CE-MS ont été bien développé et commercialisé dans l’histoire de CE-MS, et ils sont la gaine co-axial-flow interface23, l’interface sheathless en utilisant un embout poreux comme les ESI émetteur24et l’electro-cinétique gaine pompé flow interface25,26. L’electro-cinétiquement pompé gaine-flux-basé sur l’interface CZE/SM a atteint un faible zeptomole peptide détection limite9, plus 10 000 identifications de peptide (ID) de la HeLa cellulaire proteome en un seul lancer14, une caractérisation rapide des protéines intactes,11et des analyses très stables et reproductibles de biomolécules26. Récemment, le capillaire de séparation LPA-enduit, la méthode de jonction pH dynamique et l’interface de flux gaine electro-cinétiquement pompé ont été utilisés pour la protéomique de haut vers le bas à grande échelle d’un proteome Escherichia coli (e.coli)19 ,,27. La plate-forme CZE-MS/MS s’est approché de plus de 500 proteoform ID en une seule course19 et presque 6 000 proteoform IDs par couplage avec la chromatographie d’exclusion stérique (SEC)-RPLC fractionnement27. Les résultats montrent clairement la capacité de CZE-MS/MS pour la protéomique à grande échelle de haut en bas.

Décrit dans les présentes, une procédure détaillée d’utilisation CZE-MS/MS pour la protéomique à grande échelle de haut en bas. Le système CZE-MS/MS emploie le capillaire LPA-enduit pour réduire les expressions du folklore dans le capillaire, la méthode de jonction pH dynamique pour la concentration en ligne de protéines, l’interface de débit de gaine electro-cinétiquement pompé pour coupler CZE à MS, un Orbitrap valant masse spectromètre pour la collection des spectres MS et MS/MS des protéines et un logiciel de TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform Identification et caractérisation) pour la recherche de la proteoform ID via base de données.

Protocole

1. préparation du revêtement de l’APL sur la paroi interne du capillaire de séparation

  1. Prétraitement du capillaire
    1. Rincer successivement avec 500 µL de 1 M d’hydroxyde de sodium, eau déminéralisée, d’acide chlorhydrique 1 M, eau désionisée et SM-méthanol de qualité à l’aide d’une pompe à seringue dans un capillaire en silice fondue (120 cm de longueur, 50 µm de diamètre intérieur diamètre [interne] 360 µm de diamètre extérieur [OD]).
    2. Sécher le capillaire à l’azote (10 lb/po2, ≥ 12 h) et remplir le tube capillaire avec 50 % (v/v) 3-(triméthoxysilyl) méthacrylate de propyle dans le méthanol à l’aide d’un pousse-seringue. Sceller les deux extrémités du capillaire avec le caoutchouc de silice et il incuber à température ambiante pendant au moins 24 h.
      Remarque : Au cours de cette étape, la paroi interne du capillaire est fonctionnalisée avec C = C. Longer implique d’incubation meilleur revêtement capillaire due à une réaction plus complète.
    3. Couper une petite partie (environ 5 mm) du capillaire par les deux bouts avec une pierre de clivage. Rincer le tube capillaire avec du méthanol (500 µL) à l’aide d’un pousse-seringue pour nettoyer les réactifs n’ayant pas réagis. Sécher le capillaire à l’azote (10 lb/po2, ≥12 h).
  2. Préparation de l’enduit de l’APL
    Remarque : Cette procédure est basée sur Zhu et al. 22 avec des modifications mineures.
    1. Préparer une solution d’acrylamide (40 mg d’acrylamide dans 1 mL d’eau) et ammonium persulfate (APS) en solution (5 % [p/v] dans l’eau).
    2. Ajouter 2 ou 3 µL de la solution APS à 500 µL de la solution de l’acrylamide, vortex le mélange et il dégazer à l’azote pendant 5 min enlever l’oxygène dans la solution.
    3. Charger le mélange dans le capillaire prétraité à l’aide d’un aspirateur, sceller les deux extrémités du capillaire avec le caoutchouc de silice et il incuber dans un bain-marie à 50 ° C pendant 40 min.
    4. Enlever une petite partie (environ 5 mm) du capillaire aux deux extrémités avec une pierre de clivage. Poussez la solution n’a pas réagie par le capillaire avec de l’eau (200 µL), à l’aide de la seringue.
      Remarque : Vérifiez le polymère poussé hors du capillaire est une consistance du gel d’agarose. Une étape d’incubation plus longue (jusqu'à ~ 45-50 min) peut se traduire par un meilleur revêtement capillaire. Avec plus longues périodes de réaction, risque d’obstruer le tube capillaire et haute pression est nécessaire pour faire sortir le polymère avec de l’eau. Une pompe HPLC peut être utilisée à cet effet.

2. gravure à l’eau-forte du capillaire avec de l’acide fluorhydrique

ATTENTION : Utiliser des procédures de sécurité appropriées lors de la manipulation des solutions d’acide fluorhydrique (HF). Toutes les opérations liées à HF doivent se faire sous une hotte chimique. Avant toute opération de HF, assurez-vous que 2,5 % gel de gluconate de calcium peut être utilisé en cas d’exposition. Gants doubles sont nécessaires, un gant en nitrile typique à l’intérieur et un lourd néoprène gant extérieur. Porter une blouse et des lunettes de protection chimique. Après les opérations de HF, séparez les déchets liquides et solides. Déchets liquides HF doivent être neutralisées immédiatement avec une solution d’hydroxyde de sodium de concentration élevée pour le stockage temporaire, avant collecte des déchets. Les déchets solides de la HF doivent être stocké temporairement dans un récipient en plastique qui est bordé de deux sacs en plastique un gallon Ziploc épais et un couvercle. Tant les déchets solides et liquides doivent être correctement étiquetés.

  1. Brûler une partie du capillaire à l’aide d’une flamme douce (p. ex., briquet de poche) pour enlever le polyimide-revêtement extérieur (1 cm de longueur) environ 4 cm à une extrémité du capillaire. Nettoyer délicatement la partie brûlée du capillaire en frottant pour enlever le polyimide revêtement complètement.
    NOTE : Procéder avec prudence, comme la partie du capillaire sans le revêtement de polyimide sera un peu fragile.
  2. Percez un petit trou à l’extrémité d’un tube de 200 µL autour de la même taille que le diamètre extérieur capillaire pour maintenir suffisamment le capillaire en place une fois qu’il est enfilé à travers ce trou. Enfilez l’extrémité du capillaire qui se trouve à proximité de la partie brûlée dans le trou jusqu'à ce que la partie brûlée dans le tube.
    Remarque : Il est recommandé de tester la taille du trou à l’extrémité du capillaire de la partie brûlée pour s’assurer de la bonne taille, comme la partie brûlée du capillaire est fragile.
  3. Ajouter 150 µL de HF (48 % - 51 % solution dans l’eau) dans le tube de 200 µL afin que la solution HF est sujet à mi-chemin vers le haut la partie brûlée sur le capillaire. Incuber le capillaire dans la solution de HF à température ambiante pendant 90-100 min.
    Remarque : Il est recommandé qu’un autre trou est créé dans le couvercle du tube et un petit objet (par exemple, un petit bout de pipette) est utilisé pour maintenir le tube pendant que l’incubation se déroule. La pipette peut être utilisée pour perforer la mousse ou quelque autre plate-forme solide dont la chambre de réaction peut se suspendre à, créant un environnement sûr. Placez des serviettes en papier sous le tube contenant HF et suivre les procédures appropriées en cas de déversement.
  4. Retirer le tube capillaire du tube et laver l’extérieur avec de l’eau déionisée pour enlever tout résidu HF.
    Remarque : Vérifiez que le diamètre extérieur du capillaire à la partie la plus étroite de la partie brûlée est maintenant inférieur à 100 µm, comme il se doit.
  5. Couper la partie gravée du capillaire au milieu de la partie la plus étroite à l’aide d’une pierre de clivage pour produire un capillaire de séparation avec moins de 100 µm de diamètre extérieur à une extrémité. Coupez l’extrémité non gravées du capillaire pour obtenir un espacement de 1 m capillaire.
    NOTE : Éliminer les déchets de HF selon le protocole prescrit sur le plan institutionnel.

3. préparation des échantillons

  1. Préparation d’un mélange de protéines standard
    1. Préparer un mélange de protéines standard contenant le cytochrome c (Cyto.c, 12 kDa, 0,1 mg/mL), lysozyme (14,3 kDa, 0,1 mg/mL), β-caséine (24 kDa, 0,4 mg/mL), myoglobine (16,9 kDa, 0,1 mg/mL), l’anhydrase carbonique (CA, 29 kDa, 0,5 mg/mL) et l’albumine de sérum bovin (BSA, 66,5 kDa 1,0 mg/mL) en LC-MS de grade l’eau comme une solution-mère.
      Remarque : La solution peut être aliquotés et congelés à-80 ° C pour une utilisation.
    2. Diluer la solution mère par un facteur de 10 avec une solution de bicarbonate d’ammonium 50 mM (pH 8,0) en LC-MS l’eau de qualité pour analyse CZE-SM.
      NOTE : Filtrer la solution de bicarbonate d’ammonium avant de l’utiliser avec un filtre à membrane (p. ex., 0,2 µm de membrane de nitrate de cellulose et de 50 mm de diamètre).
  2. Préparation d’un échantillon d’e. coli
    1. Cellules de e. coli (K-12 MG1655) de culture dans un milieu LB à 37 ° C en agitant à 225 tr/min, jusqu'à ce que la valeur de DO600 approche 0,7. Recueillir des e. coli cellules parcentrifugation (3 283 x g, 10 min) et lavez-les plusieurs fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), afin de retirer le support.
    2. Suspendre les cellules d’Escherichia coli dans le tampon de lyse contenant 8 M urée, inhibiteurs de la protéase et bicarbonate d’ammonium de 100 mM (pH 8,0) et ultrasonicate sur la glace pendant 15 min à l’aide d’un perturbateur de la cellule par ultrasons avec une corne de la coupe pour la lyse cellulaire complet.
      1. 50 la valeur du Facteur de marche (%) et la valeur du Contrôle de sortie 7 pour le disruptor cellule ultrasonique.
    3. Centrifuger le lysat à 18 000 x g pendant 10 min. à frais virés le surnageant et éliminer le culot. Utilisez une petite aliquote du liquide surnageant pour mesure de la concentration protéique avec le dosage de l’acide (BCA) de bicinchoninic.
      Remarque : Le lysat doit être dilué au moins par un facteur de trois pour réduire la concentration d’urée inférieure à 3 M pour devenir compatible avec le test BCA. L’analyse BCA est réalisée en fonction de procédures par le fabricant.
    4. Mélanger 1 mg de protéines d’Escherichia coli à l’acétone froid avec un rapport de volume de 1:4 et gardez le mélange à-20 ° C durant la nuit à précipiter les protéines.
      Remarque : Effectuez toutes les expériences à l’acétone sous une hotte chimique.
    5. Tournez en bas des protéines précipitées (12 000 x g, 5 min) et éliminer le surnageant. Laver le culot avec de l’acétone froid à nouveau (même volume comme avant) et tourner de nouveau vers le bas.
    6. Retirer le surnageant et laisser le culot à sécher dans la hotte chimique pendant quelques minutes.
      Remarque : Sèchent pas le culot de protéine.
    7. Dissoudre le précipité protéines Escherichia coli (1 mg) dans 200 µL d’urée 8 M en bicarbonate d’ammonium de 100 mM (pH 8,0).
    8. Dénaturer, réduire et alkylation de l’échantillon.
      1. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 30 min dénaturer les protéines.
      2. Réduire avec le dithiothréitol (DTT) en ajoutant 2 µL de solution TNT 1 M (en 100 mM d’ammonium bicarbonate) dans l’échantillon et l’incubation de l’échantillon à 37 ° C pendant 30 min.
      3. Alkylation des protéines avec l’iodoacétamide (IAA) en ajoutant 6 µL de la solution 1 M d’IAA (en 100 mM d’ammonium bicarbonate) à l’échantillon et incuber l’échantillon pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité.
      4. Étancher l’excès IAA avec TNT en ajoutant 2 µL de la solution 1 M TNT et incuber pendant 5 min à température ambiante. Acidifier l’échantillon avec de l’acide formique (FA) pour obtenir une concentration finale de la FA de 1 % (v/v).
        NOTE : Réduction et alkylation sont effectuées pour faciliter le déroulement des protéines pour la fragmentation en aval. Ces étapes vont perdre les informations des ponts disulfures. Si l’objectif est d’étudier les ponts disulfures sur les protéines, Évitez ces étapes. N’oubliez pas de traiter toutes les solutions acides concentrées dans une hotte chimique.
    9. Dessalement de l’échantillon en utilisant une colonne de piège de C4 (p. ex., 4 mm de diamètre intérieur, 10 mm de longueur, rempli de particules de 3 µm ayant 300 Å pores) avec un système HPLC. Utilisez un détecteur UV à une longueur d’onde de 254 nm pour la détection.
      1. Régler le débit de phase mobile à 1 mL/min. activer la colonne en le rinçant avec 80 % (v/v) d’acétonitrile (ACN), 0,1 % FA dans l’eau pendant 10 min et équilibrer en le rinçant avec 2 % (v/v) ACN, 0,1 % FA dans l’eau pendant 10 min.
      2. 500 µg protéines sur la colonne de charge et de dessalement en les rinçant avec 2 % (v/v) ACN, 0,1 % FA dans l’eau pendant 10 min pour un débit de 1 mL/min.
      3. Éluer les protéines 80 % (v/v) ACN, 0,1 % FA dans l’eau pendant 3 min à un débit de 1 mL/min. Recueillir l’éluat et lyophiliser il avec une pompe à vide.
        Remarque : La colonne de piège C4 peut servir de dessalement de grandes quantités de protéines mais pas faible microgrammes de protéines en raison de la perte d’échantillon possible. Pour les matériaux de la protéine limitée, envisagez d’utiliser des pointes de pipette avec C4 médias pour dessalement de protéine. Veillez à ne pas sèchent les protéines quand déposer l’échantillon.
    10. Dissoudre les 500 µg de protéines (en supposant qu’aucune perte d’échantillon au cours de la préparation de l’échantillon) pour 250 µL de bicarbonate d’ammonium de 50 mM (pH 8,0) pour des expériences de CZE-MS.

4. mise en place du système CZE-MS/MS et analyse des échantillons

  1. Mise en place du système CZE
    1. Préparer une BGE contenant 5 % ou 10 % (v/v) d’acide acétique (pH ~2.4 ou ~ 2.2) en LC-MS de grade l’eau. Mettre ~1.5 mL de la BGE dans un flacon BGE qui correspond avec le plateau de la mémoire tampon de l’échantillonneur automatique CZE.
      Remarque : Assurez-vous BGE frais chaque semaine et le changement, la solution BGE dans le flacon tous les jours pour éviter toute contamination.
    2. Ajouter une solution d’échantillon (5-200 µL) à un tube d’insertion et de mettre le tuyau de l’insert dans une thatmatches de flacon échantillon avec le plateau de l’échantillon de l’échantillonneur automatique CZE.
    3. Charger l’échantillon, la BGE et la séparation capillaire dans l’échantillonneur automatique CZE.
      Remarque : La langue utilisée dans le présent protocole plus précisément reflète l’utilisation d’un échantillonneur particulière (voir Table des matières), mais les principes peuvent être appliqués à d’autres échantillonneurs.
      1. Dans la page de commande manuelle de l’échantillonneur automatique CZE, sélectionnez charger d’échantillon . Chargez le flacon BGE dans le bac tampon de l’échantillonneur automatique, notant sa position dans le bac tampon. Chargez le flacon sur le plateau de l’échantillon de l’échantillonneur automatique, notant sa position sur le plateau de l’échantillon.
        Remarque : L’instrument peut être opéré à commande manuelle en cliquant sur l’image de l’instrument pour Device Monitor sur la page principal instrument et puis cliquez sur Manuel sous le Contrôle Direct.
      2. Charger le capillaire de séparation dans l’échantillonneur automatique CZE, à l’aide de l’extrémité non gravées du capillaire. Mettre l’échantillonneur automatique à la position d’alignement à l’aide de la commande manuelle. Enfilez l’extrémité non gravées du capillaire dans un trou qui sert à maintenir la séparation capillaire jusqu'à ce qu’il ne peut pas être enfilée physiquement plus loin.
        Remarque : dans ce cas, l’extrémité du capillaire est presque à la même hauteur que le bout de l’électrode, et au moins 50 µL de l’échantillon est nécessaire dans le flacon d’échantillon pour s’assurer que l’extrémité du capillaire est immergée dans l’échantillon pendant l’injection. Si le volume de l’échantillon est faible (c'est-à-dire, 5 µL), la hauteur de la fin de l’injection de la capillaire doit être ajustée comme décrit à l’étape 4.1.3.2.1.
        1. Régler la hauteur de la fin de l’injection du capillaire si le volume de l’échantillon est inférieur à 50 µL (c.-à-d., 5 µL). Mettez l’échantillonneur automatique en veille à l’aide de la commande manuelle. Entrer la position de l’échantillon dans le système et mettre le capillaire de l’échantillon. Pousser l’extrémité de l’injection du capillaire plus loin vers le bas pour atteindre le fond du flacon échantillon.
          Remarque : dans ce cas, l’injection de l’échantillon peut être effectuée auprès d’un échantillon de seulement 5 µL dans le flacon.
      3. Continuer à utiliser la commande manuelle, rincer le tube capillaire avec la BGE pendant 20 min, à l’aide d’une pression de 20 lb/po2.
  2. Mise en place de l’interface CZE-MS
    1. Tirer un capillaire en verre borosilicaté (1 mm de diamètre extérieur, 0,75 mm de diamètre intérieur, 10 cm de long) dans deux émetteurs electrospray avec un orifice de 20 à 40 µm de diamètre extérieur
      NOTE : Garder la longueur de l’émetteur par électronébulisation que 4-5 cm et couper avec un clivage Pierre si nécessaire. Disposer de verre tous les déchets dans un conteneur d’objets coupants. Voici les paramètres pour obtenir des conseils de 20 à 40 µm. Régler la chaleur à 498, la traction à 5, la vitesse à 10, le retard à 150 et la pression à 200. Vérifiez la taille des émetteurs avec un microscope avant utilisation. Ajustez les paramètres légèrement si nécessaire.
    2. Montage d’un flux commercial gaine electro-cinétiquement pompé interface (voir Table des matières) à l’avant de la spectrométrie de masse. Remplissez le réservoir tampon de gaine avec un tampon contenant du méthanol à 10 % (v/v) et 0,2 % (v/v) FA en LC-MS l’eau de qualité.
    3. Rincer le T dans l’interface avec la gaine tampon par application de pression manuelle avec une seringue. Enfilez l’extrémité 1-mm-diamètre extérieur d’un émetteur electrospray à travers un tube de manchon et connecter l’émetteur avec un port de la Tvia un raccord. Tout simplement rincer le T manuellement à nouveau avec une seringue pour remplir l’émetteur avec le tampon de la gaine.
    4. Ajuster la distance entre l’orifice de l’émetteur et l’entrée du spectromètre de masse à ~ 2 mm à l’aide de la caméra qui est venu avec l’interface. Appliquer une tension de 2 à 2,2 kV dans le flacon de solution tampon de gaine pour electrospray. Régler la tension de pulvérisation pour atteindre un electrospray stable.
      Remarque : Si on n’observe aucune electrospray ou un instable electrospray, vérifier l’interface pour s’assurer qu’aucune grosses bulles dans l’émetteur, dans le Tet dans la tuyauterie qui permet de raccorder le flacon de solution tampon de gaine et le T. La distance entre l’orifice de l’émetteur et l’entrée du spectromètre de masse peut être grossièrement estimée par comparaison avec le diamètre extérieur de 1 mm de l’émetteur. La tension de la pulvérisation dépend de la taille de l’émetteur. Pour les émetteurs de 20 à 40 µm, 2-2,2 kV est assez bon. N’oubliez pas de toujours être prudent lorsque vous utilisez des hautes tensions.
    5. Mettre hors tension la tension de pulvérisation et visser doucement la fin gravée de la séparation capillaire par le biais de la T dans l’émetteur jusqu'à ce qu’il ne peut pas être poussé plus loin. Appliquez une pression faible (c.-à-d., 5 lb/po2) à la fin de l’injection du capillaire au cours de ce processus pour s’assurer qu'il n’y a pas de bulles dans le capillaire.
      NOTE : Le capillaire est relié à la T via une tubulure de manches et d’un raccord. Ajustez la position de l’extrémité gravée du capillaire dans l’émetteur avec l’aide de la caméra à 500 µm. La distance peut être grossièrement estimée par comparaison avec le diamètre extérieur de 1 mm de l’émetteur.
    6. Arrêter la basse pression à la fin de l’injection du capillaire. Rincer un peu l’émetteur avec le tampon de la gaine. Encore une fois, appliquer 2 à 2,2 kV de tension de pulvérisation pour tester le spray.
  3. Mise en place d’une méthode CZE pour injection de l’échantillon, séparation, rinçage capillaire et de déclencher le spectromètre de masse pour l’acquisition de données
    1. Sous le menu déroulant fichier sur l’écran principal instrument pour lancer une nouvelle méthode, sélectionnez la nouvelle méthode .
    2. Sélectionnez entrée comme SV/EV, plateau comme échantillon, pression comme 5 lb/po2, KV comme 0 et la durée 95 s pour une injection de l’échantillon.
      Remarque : L’échantillon est injecté dans le capillaire par application d’une pression. Volume d’injection de l’échantillon peut être calculé selon le temps de pression et d’injection à l’aide de la Loi de Poiseuille. Par exemple, 5 psi pour une injection de l’échantillon de 95-s correspond à environ 500 nL du volume de chargement d’échantillon pour une séparation de 1 m de longueur capillaire (diamètre intérieur de 50 µm).
    3. Sélectionnez les paramètres pour la séparation de CZE et définir les paramètres pour le déclenchement de l’acquisition de données.
      1. Définir Inlet comme InV, bac tampon, pression comme 0 lb/po2, KV comme 30 et la durée que 4 200 s pour la séparation de l’échantillon de mélange standard de protéines. Réglez prise d’InV, bac tampon, pression comme 0 lb/po2, KV comme 20 et la durée comme 6 600 s pour la séparation de l’échantillon de proteome d’e. coli .
        Remarque : La tension appliquée à la séparation peut être réglée selon la complexité de l’échantillon. Pour les échantillons de protéines simples, 30 kV peut être appliquée pour accélérer l’analyse. Pour des échantillons complexes, 20 kV est appliqué pour ralentir la séparation et acquérir plus des spectres MS/MS pour proteoform IDs.
      2. Définir les paramètres pour le déclenchement de l’acquisition de données sous la rubrique Événements chronométrés. Régler l’heure (s) 0,0 et Type comme relais 1 pour activer à l’étape 1 ; Régler heure (s) 1.0 et Type comme relais 1 pour Désactiver à l’étape 2.
    4. Sélectionnez entrée InV, bac tampon, pression comme 10 lb/po2, KV 30 et durée que 600 s rinçage capillaire.
    5. Sauvegarder les fichiers de la méthode pour le CZE-MS et MS/MS des expériences.
  4. Mise en place de la MS et MS/MS
    1. Définir les paramètres de MS et MS/MS pour l’analyse des protéines intactes, à l’aide d’un spectromètre de masse quadripolaire-ion trap (voir Table des matières).
      Remarque : Le mode d’ions positifs et supérieure dissociation par collision énergie (HCD) pour la fragmentation sont employés.
      1. Ajuster les paramètres du fichier tune : activer le mode des protéines intactes et utiliser une pression de piégeage de 0,2. Affectez le transfert ionique capillaire température de 320 ° C et le niveau de RF s-lentille 55.
      2. Générer le fichier de méthode MS et MS/MS.
        1. Pour MS pleine, définir le nombre de microscans à 3, la résolution de 240 000 (à m/z 200), la valeur de cible automatique de gain (AGC) de contrôle 1E6, le temps d’injection maximale à 50 ms et la plage de balayage à 600-2000 m/z.
      3. Pour MS/MS, utilisez dépendant des données acquisition (DDA) pour les huit ions plus intenses dans une gamme complète de MS. Définir la fenêtre d’isolement à 4 m/z et l’énergie de collision normalisée (NCE) à 20 %. Définir le nombre de microscans à 1, la résolution à 120 000 (à m/z 200), la valeur de cible AGC à 1E5 et le temps d’injection maximale à 200 ms.
      4. Définissez le seuil d’intensité pour le déclenchement de fragmentation à 1E5 et les ions avec un état de charge plus élevée que 5 à être isolés pour la fragmentation. Allumez l' exclure des isotopes et réglez l’exclusion dynamique à 30 s.
        Remarque : Le nombre de microscans pour MS/MS peut être augmenté à 3. Dans ce cas, une méthode de DDA Top3 peut être utilisée afin de réduire la durée du cycle.
    2. Mettre en place une connexion filaire entre l’auto-échantillonneur CE et le spectromètre de masse pour le déclenchement automatique de l’acquisition de données. Branchez une extrémité d’un fil au Contact de relais 1 A et 1 B Contact de relais à l’arrière de l’échantillonneur automatique CE. Branchez l’autre extrémité du câble de démarrage - et Démarrer dans + sur le côté du spectromètre de masse.
  5. CZE-MS/MS expérience et analyse des échantillons
    1. Appliquer 30 kV, à l’aide de la commande manuelle de la CE à la fin d’injection échantillon et 2-2,2 kV dans le flacon de solution tampon de gaine à l’aide de l’alimentation externe pour tester la séparation capillaire et l’électrospray.
      NOTE : La séparation actuelle, dans ce cas, est d’environ 8-9 µA si 5 % (v/v) d’acide acétique est utilisé comme le BGE.
    2. Mettre en place une séquence d’acquisition de données sur l’ordinateur de spectromètre de masse en sélectionnant une nouvelle séquence.
      1. Sélectionner inconnu comme le type d’échantillon et spécifiez un nom de fichier et le chemin d’accès. Indiquer la méthode de MS à utiliser pour chaque échantillon à exécuter en vertu de la Méthode de l’Instrument.
        Remarque : Étant donné qu’un ordinateur distinct pour le contrôle de l’échantillonneur automatique CE, la position de l’échantillon n’a pas besoin de spécifier ici.
    3. Mettre en place une séquence de séparation CZE sur l’ordinateur de CE pour indiquer la position de la mémoire tampon, la position de l’échantillon et la méthode CZE. Pour commencer une nouvelle séquence, sélectionnez la séquence dans le menu déroulant de l’analyse sur la page principal instrument.
    4. Commencez tout d’abord la méthode d’acquisition de données sur l’ordinateur de spectromètre de masse en sélectionnant exécuter séquence (ou exécuter l’exemple pour les parcours unique). Ensuite, démarrez la séquence de la CE sur l’ordinateur d’échantillonneur automatique CE.
      Remarque : Lorsque la tension de la séparation est activé après l’injection de l’échantillon, un signal est transmis par l’échantillonneur automatique CE pour le spectromètre de masse pour le déclenchement de l’acquisition de données. La séparation actuelle va diminuer au début pendant la séparation due à l’empilement d’échantillon jonction pH dynamique. Ensuite, le courant récupère progressivement.

5. recherche des fichiers Raw collectées avec le logiciel TopPIC

  1. Transférez les fichiers .raw, y compris les données de MS et MS/MS, de l’ordinateur de spectromètre de masse à un ordinateur dédié à la recherche de base de données.
    Remarque : Ces fichiers .raw peuvent être grande et nécessite un ordinateur puissant pour parvenir à une recherche rapide de la base de données.
  2. Télécharger ProteoWizard et TopPIC suite à l’ordinateur dédié à la recherche de base de données.
    NOTE : Suite ProteoWizard et TopPIC sont des logiciels libres et peuvent être consultés en ligne (ProteoWizard : http://proteowizard.sourceforge.net; Suite TopPIC : http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). UniProt bases de données sont utilisées pour les recherches de base de données et peuvent être trouvés sur le site UniProt.
  3. Convertir les fichiers .raw fichiers .mzML avec msconvert, un outil de conversion de format de fichier MS en ProteoWizard28. Dans l’interface graphique de msconvert (MSConvertGUI.exe), cliquez sur le bouton Parcourir et sélectionnez le fichier .raw à convertir. Sélectionnez le format de sortie Hatta dit Harber et garder toutes les autres options à leurs valeurs par défaut. Cliquez sur le bouton Démarrer en bas à droite de l’interface graphique.
  4. Convertir les fichiers de .mzML .msalign avec l’outil TopFD dans le TopPIC suite29.
    1. Dans le GUI de TopFD (topfd_gui.exe), cliquez sur fichier et sélectionnez le fichier .mzML créé à l’étape précédente. Conservez les valeurs par défaut des paramètres et, ensuite, cliquez sur le bouton Démarrer en bas à droite de l’interface graphique.
      Remarque : TopFD convertit précurseur et fragment de grappes isotopiques en Masse monoisotopique et identifie les caractéristiques proteoform possible dans MS1 données en combinant des amas isotopique précurseurs avec des masses monoisotopique similaires et des temps de migration étroite. Trois fichiers seront générés de TopFD, y compris un fichier ms1.msalign, un fichier ms2.msalign et un fichier .feature. Les fichiers ms1.msalign et ms2.msalign contiennent des masses monoisotopique déconvoluée des spectres MS1 et MS/MS, respectivement. Le fichier .feature contient des fonctionnalités de proteoform possible.
  5. Effectuer une recherche de base de données avec TopPIC (version 1.1.3) dans TopPIC suite30.
    1. Dans le TopPIC GUI (toppic_gui.exe), cliquez sur fichier de base de données et sélectionner une base de données approprié pour la recherche.
    2. Cliquez sur fichier de spectre et sélectionnez le fichier ms2.msalign généré à l’étape 5.4.1 comme entrée. Sélectionnez le fichier de fonctionnalités MS1 et choisissez le fichier .feature généré à l’étape 5.4.1.
    3. La valeur carbamidomethylation de cystéine (C57) comme une modification fixe grâce au traitement de l’IAA.
      Remarque : Un fichier texte peut également être créé avec diverses modifications fixes par un éditeur de texte. Ensuite, le fichier texte peut être sélectionné en utilisant le bouton de fichier à côté fixe de modifications dans l’interface graphique de TopPIC.
    4. Sélectionnez la fonctionnalité de base de données de leurre , puis, sous paramètres de coupure, FDR (taux de fausse découverte) dans le menu déroulant en regard de niveau spectral. Fixer le FDR à 0,01 au niveau du spectre et 0.05 au niveau proteoform.
      Remarque : TopPIC fournit plusieurs options pour le filtrage des résultats : au niveau du spectre FDR, FDR proteoform niveau ou les deux. Le FDR est évalué basée sur l' approche de cible-leurre31.
    5. Laissez Generating fonction désactivée, puis affectez-lui la tolérance d’erreur (ppm) 15.
    6. Sous Paramètres avancés, sélectionnez 2 pour le nombre maximal de changements de massives dans le menu déroulant. Définir la masse maximale shift (Da) de modifications inconnues à 500 da. Quittez tous les autres paramètres à leurs valeurs par défaut et cliquez sur le bouton Démarrer en bas à droite de l’interface graphique.
      Remarque : Le logiciel TopPIC génère deux fichiers texte qui en résulte. Le fichier avec l’extension. OUTPUT_TABLE contient la liste des matchs de spectre proteoform identifiée (PrSMs) et celui avec un suffixe. FORM_OUTPUT_TABLE contient la liste des proteoforms identifiées. Pour chaque PrSM, le logiciel fournit des informations générales sur le match, le patron de fragmentation observés, les ions fragments appariés et déplacements de masse détecté.

Résultats

La figure 1 montre un schéma de base de pH-jonction CZE-ESI-MS système dynamique utilisé dans l’expérience. Une longue prise de l’échantillon dans un tampon de base est injectée dans une séparation LPA-enduit capillaire remplie avec un acide BGE. Après avoir appliqué les hautes tensions I et II, l’analyser dans la zone de l’échantillon sera concentré via la méthode de jonction pH dynamique. Pour évaluer la performance du système...

Discussion

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour utiliser CZE-MS/MS pour la caractérisation à haute résolution des proteoforms dans des échantillons de protéines simples et pour l’identification à grande échelle des proteoforms dans des échantillons de protéome complexe. Un diagramme du système CZE-ESI-MS/MS est illustré à la Figure 1. Il y a quatre étapes cruciales dans le protocole. Tout d’abord, la préparation d’une enduction LPA sur la paroi interne de la séparatio...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient groupe de Heedeok Hong à Michigan State University, département de chimie, de bien vouloir fournir les cellules d’Escherichia coli pour les expériences. Les auteurs remercient le soutien de la National Institute of General Medical Sciences, le National Institutes of Health (NIH) par Grant R01GM118470 (pour X. Liu) et Grant R01GM125991 (de L. soleil et X. Liu).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Fused silica capillaryPolymicro Technologies106815001750 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pelletsMacron Fine Chemicals7708-10Corrosive
LC-MS grade waterFisher ScientificW6-1
Hydrochloric acidFisher ScientificSA48-1Corrosive
MethanolFisher ScientificA456-4Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateSigma-AldrichM6514Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acidAcros Organics423805000Highy toxic
AcrylamideAcros Organics164855000Toxic, health hazard
Ammonium persulfateSigma-AldrichA3678Health hazard, Oxidizer
lysozymeSigma-AldrichL6876
Cytochrome CSigma-AldrichC7752
MyoglobinSigma-AldrichM1882
ß-caseinSgma-AldrichC6905
Carbonic anhydraseSigma-AldrichC3934
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
UreaAlfa Aesar36428-36
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD0632Health Hazard
IodoacetamideFisher ScientificAC122270250Health Hazard
Formic AcidFisher ScientificA117-50Corrosive, Health Hazard
C4 trap columnSepax Technologies110043-4001C3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
AcetonitrileFisher ScientificA998SK-4Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich1066-33-7
Nalgene rapid-flow filtersThermo Scientific126-00200.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cellsK-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered salineSigma-AldrichD8537
BCA assayThermo Scientific23250
AcetoneFisher ScientificA11-1
HPLC system for protein desaltingAgilient1260 Infinity II
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
CE autosamplerCMP ScientificECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interfaceCMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette pullerSutter InstrumentsP-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysisBranson101063196Model S-250A
Vaccum concentratorThermo Fisher ScientificSPD131DDA-115

Références

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