JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Detaylı bir protokol ayırma, kimlik ve kapiller bölge Elektroforez-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (CZE-ESI-MS/MS) kullanarak protein örnekleri proteoforms karakterizasyonu için tanımlanır. Protokol proteoforms basit protein örneklerinde yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms karmaşık Proteom örneklerinde büyük ölçekli tanımlaması için kullanılabilir.

Özet

Kapiller bölge Elektroforez-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (CZE-ESI-MS/MS) karmaşık proteomes proteoforms karakterize amaçlamaktadır tepeden proteomik için yararlı bir araç olarak kabul edilmiştir. Ancak, CZE-MS/MS uygulama için büyük ölçekli tepeden proteomik düşük örnek yükleme kapasitesi ile engelledi ve CZE ayrılık pencere dar. Burada, bir protokol CZE-MS/MS microliter ölçekli örnek yükleme hacmi ve bir 90 dk ayrılık pencere ile büyük ölçekli tepeden proteomik için kullanılarak açıklanmıştır. Bir doğrusal polyacrylamide (LPA) tabanlı CZE-MS/MS platformu-kaplamalı ayırma ile son derece düşük electroosmotic akışı, protein istifleme, pH-kavşak tabanlı dinamik online örneği konsantrasyon yöntemi yüksek verimlilik ile kılcal bir Elektro-kinetically pompalanan kılıf akışı CE-MS arayüzü ile son derece yüksek hassasiyet ve bir iyon kapanı kütle spektrometre ile yüksek çözünürlük kitle ve hız tarayın. Platform, basit sağlam protein örnekleri yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms çeşitli karmaşık proteomes içinde büyük ölçekli karakterizasyonu için kullanılabilir. Örneğin, bir standart protein karışımı son derece verimli bir ayrılması ve son derece hassas bir platform kullanılarak birçok yabancı maddelerin tespiti gösterilmiştir. Başka bir örnek olarak, bu platform 500'den fazla proteoform üretebilir ve 190 protein tanımlamaları bir Escherichia coli Proteom bir tek CZE-MS/MS üzerinden çalıştırın.

Giriş

Proteoforms bir Proteom içinde büyük ölçekli karakterizasyonu için yukarıdan aşağıya proteomik (TDP) amaçlamaktadır. TDP electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (ESI-MS/MS) analizi yüksek karmaşıklık nedeniyle daha önce olduğu gibi proteinler etkili sıvı faz ayrılması ve büyük konsantrasyon Proteom1,2 dinamik aralığını kullanır ,3,4,5. Kapiller bölge Elektroforez (CZE) üzerinde onların boyutu ücret oranları6dayalı biomolecules ayrılması için güçlü bir tekniktir. CZE nispeten yalnızca bir açık borulu erimiş silis kapiller, bir arka plan elektrolit (BGE) ve bir güç kaynağı gerektiren basittir. Bir örnek olduğu gibi proteinlerin kapiller basınç veya gerilim kullanarak yüklenebilir ve ayırma her iki ucunda da BGE kılcal çeker ve bir yüksek gerilim uygulayarak başlatılır. CZE Ultra yüksek ayırma verimliliği yaklaşım (> 1 milyon teorik plakaları) biomolecules7ayrılması için. CZE-MS vardır büyük ölçüde daha yüksek bir hassasiyet daha yaygın olarak kullanılan ters fazlı sıvı kromatografi (RPLL)-analizi için MS sağlam proteinler8. CZE-MS büyük ölçekli tepeden proteomik için büyük bir potansiyele sahip olsa da, proteomik geniş kendi uygulamasında bir düşük örnek yükleme kapasitesi ve dar ayrılık pencere de dahil olmak üzere birkaç sorunu tarafından engellemiştir. Yükleme hacmi CZE içinde tipik örneğidir genellikle 100 nL9,10' a,11karşılık gelen toplam kapiller hacmi yaklaşık % 1. CZE ayrılık pencere genellikle az 30 dk güçlü electroosmotic akışı (EOF)9,10nedeniyle var. Bu sorunlar CZE-MS/MS çok sayıda proteoforms ve karmaşık bir Proteom üzerinden düşük bol proteoforms tanımlanması için sınırlayın.

Yükleme hacmi CZE üzerinden online örnek toplama yöntemleri (Örneğin, katı fazlı microextraction [SPME]12,13, örnek alan Gelişmiş yığın [FESS]9 örnek geliştirmek için çok çaba yapıldığı yeri , 11 , 14ve dinamik pH kavşak15,16,17,18). FESS ve dinamik pH kavşak SPME, sadece örnek arabellek ve BGE arasında önemli bir fark iletkenlik ve pH gerektiren daha basit. FESS analitler örnek bölge ve kılcal BGE bölgesinde arasındaki sınır üzerinde istifleme için önde gelen BGE daha fazla düşük iletkenlik ile bir örnek arabelleği kullanır. Dinamik pH kavşak bir temel örnek fiş (Örneğin, 50 mM Amonyum Bikarbonat, pH 8) ve örnek tak her iki tarafında asidik bir BGE (Örneğin, [v/v] % 5 asetik asit, pH 2.4) kullanır. Kılcal enjeksiyon sonunda yüksek pozitif gerilim başvuru üzerine, titrasyon temel örnek fiş, CZE ayrılık geçiyor önce sıkı bir fiş analitler odaklanan oluşur. Son zamanlarda, Güneş Grup sistematik FESS ve dinamik pH kavşak online olduğu gibi proteinlerin istifleme için bu dinamik pH kavşak üretmek FESS sağlam proteinler çevrimiçi konsantrasyon için daha çok iyi performans gösteren göre ne zaman numune enjeksiyon hacmi toplam kılcal birim%1925'i oldu.

Yansıtmaya kaplamalı ayrılık kılcal damarlar (Örneğin, doğrusal polyacrylamide [LPA]) CZE ayrılık yavaş ve ayrılık pencere20,21genişletme EOF kılcal içinde azaltmak için istihdam edilmiştir. Son zamanlarda, Dovichi grup kılcal damarlar, iç duvar üzerinde istikrarlı LPA kaplama hazırlanması için basit bir prosedür amonyum Persülfat (APS) kullanan Başlatıcı ve serbest radikal üretimi ve polimerizasyon22 için sıcaklık (50 ° C) olarak geliştirilen . Çok yakın zamanda, Güneş grup yükleme birimi ve bir 90 dk ayrılık pencere19microliter-ölçek örnek ulaşan LPA kaplı ayrılık kapiller ve dinamik pH kavşak yöntemi olduğu gibi proteinlerin CZE ayrılması için istihdam. Bu CZE sistemini CZE-MS/MS için büyük ölçekli tepeden proteomik kullanarak için kapıyı açar.

CZE-MS Çift CZE MS için son derece sağlam ve hassas bir arayüzü gerektirmektedir. Üç CE-MS arabirimi de gelişmiş ve CE-MS tarihinde ticari olmuştur, ve onlar koaksiyel kılıf-akış arabirimi23, gözenekli bahşiş ESI emitör24, kullanarak sheathless arayüzü ve elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi25,26. Elektro-kinetically pompalanan kılıf-akış arabirimi-tabanlı CZE-MS/MS düşük zeptomole peptid algılama sınırı9ulaştı, 10.000'den fazla peptid tanımlamaları (IDS) üzerinden HeLa Proteom14, hızlı bir karakterizasyonu çalıştırmak tek bir hücre sağlam proteinler11ve son derece istikrarlı ve tekrarlanabilir analizleri biomolecules26. Son zamanlarda, ayrılık LPA kaplı kılcal, dinamik pH kavşak yöntemi ve elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi bir Escherichia coli (e.coli) Proteom19 büyük ölçekli tepeden proteomik için kullanılan ,27. 500'den fazla proteoform kimlikleri tek bir19 ve boyutu-dışlama Kromatografi (sn) ile kaplin yaklaşık 6.000 proteoform kimlikleri üzerinden çalıştırmak CZE-MS/MS platform yaklaştı-RPLL ayırma27. Sonuçlar açıkça CZE-MS/MS yeteneği için büyük ölçekli tepeden proteomik gösterir.

Burada, CZE-MS/MS için büyük ölçekli tepeden proteomik kullanmanın ayrıntılı bir yordam açıklanır. CZE-MS/MS sistem EOF kılcal, proteinler, MS, bir orbitrap CZE kaplin için elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi çevrimiçi konsantrasyon için dinamik pH kavşak yöntemi içinde azaltmak için LPA kaplı kılcal istihdam kitle Spektrometre proteinlerin ve proteoform kimliği ile veritabanı arama için a sendelemek (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform kimlik ve karakterizasyonu) bilgisayar yazılımı MS ve MS/MS spectra koleksiyonu için.

Protokol

1. ayrılık kılcal iç duvarında LPA kaplama hazırlanması

  1. Kılcal Önarıtma
    1. Erimiş silis kılcal (120 cm uzunluğunda, 50 µm iç çapı [kimlik], dış çapı [doz] 360 µm) art arda 500 µL 1 M sodyum hidroksit, deiyonize su, 1 M hidroklorik asit, deiyonize su ve bir şırınga pompa kullanarak LC-MS sınıf metanol ile yıkayın.
    2. Azot Gazı (10 PSI, ≥ 12 h) ile kılcal kuru ve kılcal (v/v) 3-(trimethoxysilyl) % 50 ile doldurmak propil metakrilat bir şırınga pompa kullanarak metanol içinde. Her iki ucunda da kılcal silis kauçuk mühür ve oda sıcaklığında en az 24 saat için kuluçkaya.
      Not: C ile kılcal iç duvar Bu adım sırasında functionalized C. Longer kuluçka sonuçlarında daha kapsamlı bir tepki nedeniyle daha iyi kılcal kaplama =.
    3. Küçük bir bölümü (~ 5 mm), her iki uçtan sıyırmada bir taş ile kılcal kesti. Kılcal unreacted reaktifleri kadar temiz bir şırınga pompa kullanarak metanol (500 µL) ile yıkayın. Azot Gazı (10 PSI, ≥12 h) ile kılcal kuru.
  2. LPA kaplama hazırlanması
    Not: Bu yordam Zhu vd üzerinde temel alır küçük değişiklikler ile 22 .
    1. Akrilamid çözüm (1 mL su akrilamid 40 mg) ve amonyum Persülfat (APS) çözüm (%5 [w/v] su) hazırlayın.
    2. Akrilamid çözüm, girdap karışımı, 500 µL için 2-3 µL APS çözüm ekleyin ve oksijen çözümde kaldırmak 5 min için azot gazı ile degas.
    3. Karışımı bir vakum kullanma ön işleme kılcal damar yüklemek her iki ucunda da kılcal silis kauçuk mühür ve 50 ° c 40 min için bir su banyosunda kuluçkaya.
    4. Küçük bir bölümü (~ 5 mm) her iki uçtan sıyırmada taşlı kılcal kaldırın. Enjektör pompa kullanarak unreacted çözüm kılcal su (200 µL), ile dışarı itin.
      Not: kılcal damar dışına itti polimer özel tutarlılık jel gibi olduğundan emin olun. Daha uzun bir kuluçka adım (~ 45-50 dk ilâ) daha iyi bir kılcal kaplama neden olur. Daha uzun tepki süreleri, kılcal engellenmiş duruma ve yüksek basınçlı su ile polimer dışarı itmek için gereklidir. HPLC pompa bu amaç için kullanılabilir.

2. kılcal hidroflorik asit dağlama

: Uygun güvenlik prosedürleri hidroflorik asit (HF) çözümler taşıma sırasında dikkatli olun. HF-ile ilgili tüm işlemleri kimyasal bir mahallede yapılması gerekir. HF ile ilgili herhangi bir işlem daha önce % 2.5 Kalsiyum glukonat jel maruz kalma durumunda kullanılabilir olduğundan emin olun. Çift eldiven gereklidir, dışarıda bir tipik nitril eldiven içinde ve ağır bir Neopren eldiven. Bir laboratuar önlüğü ve kimyasal koruyucu gözlük giymek. Sonra HF işlemleri, sıvı ve katı tehlikeli atıklar ayrı tutun. Sıvı HF atık hemen önce atık pick-up geçici depolama için bir yüksek konsantrasyon sodyum hidroksit çözüm ile etkisiz hale gerekir. Katı HF atık iki kalın plastik bir galonluk Ziploc çanta ve bir kapak ile kaplı bir plastik kap içinde geçici olarak depolanması gerekir. Hem katı ve sıvı atık düzgün etiketlenmesi gerekir.

  1. Nazik bir alev kullanarak kılcal bir kısmı yanık (Örneğin, cep daha hafif) polimid dış kaplama (1 cm uzunluğunda) yaklaşık 4 cm uzakta kılcal bir ucunu kaldırmak için. Yavaşça kılcal yanmış kısmı tamamen kaplama polimid kaldırmak için silerek temizleyin.
    Not: polimid kaplama-ecek var olmak biraz kırılgan olmadan, kılcal bölümü olarak dikkatli olun.
  2. Bu delikten dişli bir kez yeterince kılcal tutmak için kılcal dış çapı yaklaşık olarak aynı boyutta çevresinde 200-µL tüp sonunda küçük bir delik. Tüp yanmış alandır kadar yani yanmış kısmı delikten yakın kılcal sonu iş parçacığı.
    Not: Bu kılcal yanmış kısmı kırılgan olduğu gibi doğru boyutu sağlamak için yanmış bölümü uzak kılcal sonu ile delik boyutunu sınamak için tavsiye edilir.
  3. HF çözüm hakkında yarısına kadar yanmış kısmı kılcal üzerinde böylece ~ 150 µL HF (su içinde % 48-%51 çözelti), 200-µL tüp ekleyin. 90-100 dakika oda sıcaklığında HF çözümde kılcal kuluçkaya.
    Not: Bu başka bir delik tüpün kapağı içinde oluşturulur ve bazı küçük bir nesne (Örneğin, bir küçük pipet ucu) kuluçka yer alıyor tüp kadar tutmak için kullanılan önerilir. Pipet Ucu, köpük veya güvenli bir ortam oluşturmak hangi reaksiyon odası, asmak bazı diğer sağlam platformu ponksiyon için kullanılabilir. Kağıt havlu HF içeren tüp aşağıda yerleştirin ve bir kaza durumunda uygun yordamları izleyin.
  4. Kılcal tüp sizden kaldırmak ve dış herhangi bir kalıntı HF kaldırmak için deiyonize su ile yıkayın.
    Not: olması gerektiği gibi kılcal yanmış bölümünün dar kısmında dış çapı şimdi 100 µm küçük olduğundan emin olun.
  5. Kılcal sıyırmada taş ayırma kılcal bir ucunda doz 100 µm ile üretmek için kullanma en dar kısmı ortasında kabartma parçası kesti. 1-m ayrılık kapiller almak için kılcal sigara kazınmış sonuna kesti.
    Not: HF atık kurumsal olarak öngörülen protokolüne göre atın.

3. örnekleri hazırlanması

  1. Standart protein karışımı hazırlanması
    1. Sitokrom c (Cyto.c, 12 kDa, 0.1 mg/mL), lizozim (14.3 kDa, 0.1 mg/mL), β-kazein (24 kDa, 0.4 mg/mL), miyoglobin (16.9 kDa, 0.1 mg/mL), karbonik anhidraz (CA, 29 kDa, 0,5 mg/mL) ve sığır serum albumin (BSA, 66,5 kDa içeren bir standart protein karışımı hazırlayın 1.0 mg/mL) LC-MS içinde sınıf su hisse senedi bir çözüm olarak.
      Not: Stok çözüm bölünmemeli ve kullanım için-80 ° C'de depolanmış olabilir.
    2. Hisse senedi çözüm 10 LC-MS sınıf su CZE-MS analizi için 50 mM Amonyum Bikarbonat solüsyonu (pH 8.0) bir faktörle oranında seyreltin.
      Not: kullanmadan önce Amonyum Bikarbonat çözüm (Örneğin, selüloz nitrat membran ve 50 mm çapında 0.2 µm) bir membran filtre ile filtre.
  2. Bir E. coli örnek hazırlanması
    1. Kültür E. coli (K-12 MG1655) hücreler LB orta 37 ° C'de OD600 değeri 0,7 yaklaşımlar kadar 225 rpm'de sallayarak süre. E. coli hücreleri yoluylaSantrifüjü (3,283 x g, 10 dk) toplamak ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi ile (PBS) orta kaldırmak için birden çok kez yıkayın.
    2. 8 M üre, proteaz inhibitörleri ve 100 mM Amonyum Bikarbonat (pH 8.0) içeren lizis arabellek E. coli hücrelerde askıya alma ve buz için 15 dk ultrasonik hücre topu Kupası boynuz ile tam hücre lizis için kullanarak ultrasonicate.
      1. Görev çevrimi (%) 50'ye ve Çıkış kontrolü için ultrasonik hücre topu 7'ye ayarlayın.
    3. Lysate 18.000 x g 10 dk. toplamak için de süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet atın. Süpernatant, küçük bir aliquot protein konsantrasyonu ölçümü ile bicinchoninic asit (BCA) tahlil için kullanın.
      Not: lysate seyreltilmiş gereken en az üre konsantrasyonunu azaltmak için üç kat 3 M BCA tahlil ile uyumlu olabilmek için indirin. BCA tahlil üreticinin yordam göre gerçekleştirilir.
    4. Mix 1 mg 1:4 ve tutmak-20 ° C'de proteinler çökelti gecede karışımı bir hacim oranı ile soğuk aseton ile E. coli proteinlerin.
      Not: tüm deneylerin kimyasal bir mahallede aseton kullanarak gerçekleştirin.
    5. Çöktürülmüş proteinler (12.000 x g, 5 min) spin ve süpernatant kaldırın. Spin aşağı tekrar ve Pelet (daha önce olduğu gibi aynı miktar) daha soğuk aseton ile yıkayın.
    6. Süpernatant kaldırmak ve kimyasal mahallede birkaç dakika kurumaya Pelet sağlar.
      Not: protein Pelet overdry değil.
    7. Çöktürülmüş dağıtılması E. coli proteinler (1 mg) 200 µL 8 M üre 100 mM Amonyum Bikarbonat (pH 8.0) içinde.
    8. Denatüre, azaltmak ve örnek alkylate.
      1. Örnek 37 ° c proteinler denatüre 30 dk için kuluçkaya.
      2. Dithiothreitol (DTT) ile 1 M DTT çözümde (100 mM Amonyum Bikarbonat) 2 µL örnek ekleyerek ve örnek için 30 dk 37 ° C'de kuluçka azaltmak.
      3. Proteinler ile iodoacetamide (IAA) 1 M IAA çözümde (100 mM Amonyum Bikarbonat) 6 µL ekleyerek alkylate için örnek ve örnek karanlık oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
      4. 1 M DTT çözüm 2 µL ekleyerek DTT ile aşırı IAA gidermek ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Formik asit (%1 (v/v) son SK konsantrasyon almak için SK) ile örnek acidify.
        Not: Azaltma ve alkillenme proteinler aşağı akım parçalanma için elinde tutmasına yardımcı olmak için yapılmaktadır. Bu adımlar disülfür bağları bilgileri kaybedersiniz. Eğer amaç disülfür bağları proteinler üzerinde çalışmaya, bu adımların kaçının. Tüm konsantre asit çözümler bir kimyasal başlıklı işlemek hatırlıyorum.
    9. HPLC sistemi ile bir C4 tuzağı sütun (Örneğin, kimlik, 4 mm, 10 mm uzunluğunda, 300 Å gözenekleri olan 3 µm parçacıkları ile Paketli) kullanarak örnek desalt. Dalga boyu 254 bir UV dedektör kullanmak nm algılama için.
      1. Mobil faz akış hızı 1 mL/dak için Activate küme sütun ile % 80'i (v/v) Asetonitril (ACN), % 0,1 temizlenerek SK suda 10 dakika ve (v/v) ACN, % %0,1 2 ile temizlenerek equilibrate 10 dk suda SK.
      2. Yük 500 µg proteinler sütuna ve (v/v) ACN, % %0,1 2 ile temizlenerek desalt için 1 mL/dk akış hızı, 10 min sudaki SK.
      3. Proteinler (v/v) ACN, % %0,1 80 ile elute için 3 dk 1 mL/dk akış hızı az suda SK. Eluate toplamak ve vakum yoğunlaştırıcı ile lyophilize.
        Not: C4 tuzağı sütun büyük miktarda protein ama olası örnek kaybı nedeniyle proteinlerin düşük değil mikrogram desalt için kullanılabilir. Sınırlı protein malzemeler için pipet ipuçları C4 medya ile protein desalting için kullanmayı düşünebilirsiniz. Proteinler örnek lyophilizing zaman overdry değil dikkatli olun.
    10. (Numune hazırlama sırasında hiçbir örnek kaybı varsayarak) proteinlerin 500 µg CZE-MS deneyler için 50 mM Amonyum Bikarbonat (pH 8.0) 250 µL geçiyoruz.

4. Kurulum CZE-MS/MS sistem ve analiz örnekleri

  1. CZE sisteminin kurulumu
    1. % 5 veya % 10 (v/v) asetik asit içeren bir BGE hazırlamak (pH ~2.4 veya ~ 2.2) LC-MS içinde sınıf su. BGE ~1.5 mL CZE Otomatik Örnekleyici arabellek tepsi ile eşleşen bir BGE şişe içine koymak.
      Not: taze BGE her hafta ve değişim BGE çözüm şişede her gün herhangi bir kirlenmesini önlemek için yapmak.
    2. Bir örnek çözümü (5-200 µL) bir INSERT tüp ekleyin ve INSERT tüp CZE Otomatik Örnekleyici örnek tepsisi ile bir örnek flakon thatmatches içine koydu.
    3. Örnek, BGE ve kapiller ayrılık CZE Otomatik Örnekleyici yükleyin.
      Not: Bu protokol için en doğru kullanılan dili bir belirli Otomatik Örnekleyici kullanımını yansıtır (bkz. Tablo malzemeler), ancak diğer autosamplers için ilkeleri uygulanabilir.
      1. Örnek yük CZE Otomatik Örnekleyici manuel kontrol sayfasında seçin. BGE şişe arabellek tepsisi konumunu belirterek Otomatik Örnekleyici arabellek tepsisine yükleyin. Örnek şişeyi örnek tepsisi konumunu belirterek Otomatik Örnekleyici örnek tepsisine yükleyin.
        Not: Araç içinde manuel kontrol aracı resim üzerinde Aygıt İzleyicisi için ana enstrüman sayfasında tıklatın ve sonra el ile Doğrudan denetimialtında seçim çalıştırılabilir.
      2. Ayrılık kılcal damar kılcal sigara kazınmış sonuna kullanarak CZE Otomatik örnekleyici, yük. Otomatik Örnekleyici manuel kontrol kullanarak Hizalama yerime koyun. Kılcal sigara kazınmış sonuna kadar fiziksel olarak dişli değil ayrılık kapiller daha fazla tutmak için kullanılan bir deliğe iplik.
        Not: Bu durumda, kılcal neredeyse sonuna elektrot olarak aynı yükseklikte bitti ve en az 50 µL örnek örnek şişede kılcal sonu enjeksiyon sırasında örnek batırılır emin olmak için gereklidir. Numune hacmi ise düşük (yani, 5 µL), yükseklik kapiller 4.1.3.2.1 adımda anlatıldığı gibi ayarlanması gereken enjeksiyon sonu.
        1. Numune hacmi 50 µL (yani, 5 µL) düşükse kılcal enjeksiyon sonu yüksekliğini ayarlayın. Otomatik Örnekleyici manuel kontrol kullanarak bekleme moduna geçin. Sistem örnek konumda yazın ve kılcal örnek için hareket. Enjeksiyon sonuna ulaşmak örnek şişeyi alt aşağı daha fazla kılcal itin.
          Not: Bu durumda, şişe içinde sadece 5 µL örneği ile örnek enjeksiyon yapılabilir.
      3. Sürekli manuel kontrol kullanmak için kılcal 20 psi basınç uygulayarak BGE 20 dk ile yıkayın.
  2. Set-up CZE-MS arabirimi
    1. Borosilikat cam kapiller (1 mm doz, kimlik, 10 cm uzunluğunda 0,75 mm olarak) iki electrospray emitters bir doz 20-40 µm delik ile içine çek
      Not: electrospray verici olarak 4-5 cm uzunluk tutmak ve bir sıyırmada stone ile gerekirse kesti. Tüm bardak atmayın "Sharps" kap içinde atık. 20 - 40 µm ipuçları almak için ayarlar aşağıdaki gibidir: 498 sıcağa, çekme 5, 10 hızı, gecikme 150 ve 200 basınç için ayarlayın. Yayımlayıcıları boyutunu mikroskop kullanmadan önce danışın. Parametreleri biraz ayarlayın.
    2. Bir ticari elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi ( Tablo malzemelerigörmek) kütle spektrometre önüne monte edin. Kılıf arabellek rezervuar % 10 (v/v) metanol ve % 0.2 (v/v) SK LC-MS sınıf su içeren bir arabellek ile doldurun.
    3. Baskı, el ile bir şırınga ile uygulamak kılıf arabellek üzerinden ile arayüzü T floş. 1-mm-od sonuna bir electrospray verici bir kol boru aracılığıyla iş parçacığı ve verici bir in Tüzerinden uygun bir ile bağlayınız. Sadece T el ile yeniden verici ile kılıf arabelleği dolduracak bir şırınga ile yıkayın.
    4. Yayıcıyı ağız ve kütle spektrometre ~ 2 mm giriş arayüzü ile geldi kamera yardımı ile arasındaki mesafeyi ayarlamak. 2 - 2.2 kV gerilim kılıf arabellek flakon electrospray için de geçerli. İstikrarlı bir electrospray ulaşmak için sprey gerilim ayarlayın.
      Not: yok electrospray ya da kararsız bir electrospray gözlenen, arabirimi büyük hava kabarcığı yok verici, Tve kılıf arabellek flakon ve Tbağlamak için kullanılan boru olduğundan emin olmak için kontrol edin. Yayıcıyı ağız ve kütle spektrometre giriş arasındaki mesafe yaklaşık Yayıcıyı 1 mm doz ile karşılaştırarak tahmin edilebilir. Sprey voltaj verici boyutuna bağlıdır. 20 - 40 µm yayıcılar için 2-2.2 kV yeterince iyi değil. Her zaman yüksek voltajlarını kullanırken dikkatli olmayı unutma.
    5. Sprey gerilim açmak ve daha itti değil kadar yavaşça içine verici T kapiller ayrılık kazınmış sonu iplik. Bir düşük basınç (yani, 5 PSI) kılcal enjeksiyon sonunda kapiller içinde hava kabarcığı yok emin olmak için bu işlem sırasında uygulanır.
      Not: Kılcal T üzerinden için bağlanan bir kol boru ve bir montaj. 500 µm içinde kamera yardımı ile verici kılcal kazınmış sonu konumunu ayarlayın. Mesafe yaklaşık Yayıcıyı 1 mm doz ile karşılaştırarak tahmin edilebilir.
    6. Alçak basınç kapiller enjeksiyon sonunda durdur. Yayıcıyı biraz ile kılıf tamponunu boşaltır. Yine, sprey test etmek için 2-2.2 kV sprey gerilim uygulanır.
  3. CZE yöntemi örnek enjeksiyon, ayrılık, kapiller kızarma ve veri toplama kütle spektrometre, uyarının harekete geçirilmesine karşılık için up
    1. Altında yeni bir yöntemi başlatmak için ana enstrüman ekran Dosya aşağı açılan menüsünden yeni yöntemi seçin.
    2. Giriş SV/EV, tepsi örnek olarak, 5 psi basınç , KV 0 ve süre olarak 95 olarak seçin örnek enjeksiyon için s.
      Not: Numune basınç uygulayarak kılcal damar yolu ile enjekte edilir. Numune enjeksiyon hacmi tabanlı Poiseuille'nın hukuk kullanma basıncı ve enjeksiyon zamanında hesaplanabilir. Örneğin, 5 psi bir 95-s örnek enjeksiyon için yaklaşık 500'e karşılık gelen bir 1 m uzunluğunda ayrılması kapiller (50 µm kimlik) için örnek yükleme biriminin nL.
    3. CZE ayrılması için parametreleri seçin ve veri toplama tetikleme için parametreleri ayarlayın.
      1. Ayarla giriş Inv, tepsi tampon olarak, 0 psi basınç , KV 30 ve süre olarak 4.200 s standart protein karışımı örnek ayrılması için. Ayarla giriş Inv, tepsi tampon olarak, 0 psi basınç , KV 20 ve süre 6.600 s E. coli Proteom örnek ayrılması için.
        Not: ayrılması için uygulanan gerilim örnek karmaşıklık göre ayarlanabilir. Basit protein örnekleri, 30 kV Analizi'ni hızlandırmak için uygulanabilir. Karmaşık örnekleri, 20 kV ayrılık yavaş ve daha fazla MS/MS spectra proteoform kimlikleri için elde etmek için uygulanır.
      2. Veri toplama Zaman aşımınaolayları tetikleyen için parametreleri ayarlayın. Time (s) 0.0 ve türü olarak Röle 1 olarak Etkinleştir için 1. adımda ayarlanan; Time (s) devre dışı bırak için adım 2 1.0 ve türü olarak Röle 1 olarak ayarlayın.
    4. Giriş Inv, tepsi tampon olarak, 10 PSI basınç , KV 30 ve süre olarak 600 seçin kapiller kızarma için s.
    5. Yöntem dosyaları CZE-MS ve MS/MS deneyler için kaydedin.
  4. Kurulum, MS ve MS/MS
    1. Sağlam protein analizi quadrupole-iyon kapanı kütle spektrometre için MS ve MS/MS parametrelerini ayarlayın (bkz. Tablo malzeme).
      Not: Pozitif iyon modu ve daha yüksek enerji collisional ayrılma (PİLGRİM6A) parçalanma için istihdam edilmektedir.
      1. Melodi dosya ayarlarını yapma: olduğu gibi protein modu açmak ve 0,2 bindirme baskısı kullanın. İyon transferi kapiller sıcaklık 320 ° c ve s-objektif RF düzeyi 55 için ayarlayın.
      2. MS ve MS/MS yöntemi dosya oluşturun.
        1. Tam MS için microscans 3, 240.000 (at m/z 200) çözünürlük, otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedef değer sayısını 1E6, 50 ms maksimum enjeksiyon vakti ve 600-2000 m/ztarama aralığı ayarlayın.
      3. MS/MS, MS tam bir spektrum sekiz en yoğun iyonu için veri bağımlı edinme (DDA) kullanın. Yalıtım pencere 4 m/z ve % 20 için normalleştirilmiş collisional enerji (NCE) olarak ayarlayın. Microscans 1, çözünürlük için 120.000 (at m/z 200) sayısı, 1E5 AGC hedef değerine ve 200 ms maksimum enjeksiyon zamanı ayarlayın.
      4. 1E5 parçalanma tetikleneceği yoğunluğu eşik ayarlayabilirsiniz ve parçalanma için izole olmak için 5'ten daha yüksek bir ücret durumuyla iyonları. İzotoplar hariç üzerinde açın ve dinamik dışlama 30'a ayarlayın s.
        Not: MS/MS için microscans sayısı 3'e artırılabilir. Bu durumda, bir Top3 DDA Yöntem döngüsü zamanı azaltmak için kullanılabilir.
    2. CE Otomatik Örnekleyici ve otomatik veri edinimi tetikleneceği kütle spektrometre arasında kablolu bağlantı kurun. Röle 1 kişi A ve CE Otomatik Örnekleyici arkasında 1 kişi B geçiş için bir tel bir ucunu bağlayın. Başlama yeri - için kablonun diğer ucunu takın ve Başlama yeri + yan tarafında kütle spektrometre.
  5. CZE-MS/MS deney ve analiz örnekleri
    1. 30 geçerli örnek enjeksiyon sonunda ve 2-2.2 kV ayrılık kapiller ve electrospray test etmek için harici güç kaynağı kullanmayı kılıf arabellek şişe, CE manuel kontrol kullanarak kV.
      Not: Geçerli, bu durumda, çevresinde ayrılmasıdır %5 (v/v) asetik asit BGE kullanılırsa, 8-9 µA.
    2. Bir veri alma sırası kütle spektrometre bilgisayarda yeni bir sıra seçerek ayarlayın.
      1. Bilinmeyen örnek türü olarak seçin ve bir dosya adını ve yolunu belirtin. Enstrüman yöntemi' nin altında çalıştırmak her örnek için kullanılmak üzere MS yöntemi gösterir.
        Not: CE Otomatik Örnekleyici kontrol etmek için ayrı bir bilgisayar olduğundan, örnek konum burada belirtilmesi gerekmez.
    3. CZE ayrılma sırası CE bilgisayarda tampon konum, örnek konum ve CZE yöntemi belirtmek için ayarlayın. Yeni bir sıra başlatmak için ana enstrüman sayfa analiz aþaðý açýlan menüsünden altında sırasını seçin.
    4. Veri alma yöntemi kütle spektrometre bilgisayarda ilk sıra çalıştırmak (veya örneği çalıştırmak için tek çalışır) seçerek başlayın. CE sıra CE Otomatik Örnekleyici bilgisayarda başlatın.
      Not: ayrılık gerilim örnek enjeksiyon sonra açık olduğunda, bir sinyal CE Otomatik Örnekleyici veri toplama tetikleneceği kütle spektrometre gönderilir. Geçerli ayırma dinamik pH kavşak örnek istifleme nedeniyle ayırma sırasında başında azalacak. O zaman, geçerli yavaş yavaş kurtarır.

5. veritabanı arama sendelemek yazılımı ile toplanan ham dosyaları

  1. Veritabanı arama için adanmış bir bilgisayar için kütle spektrometre bilgisayardan MS ve MS/MS veri de dahil olmak üzere .çiğ dosya aktarımı.
    Not: Bu .çiğ dosyalar büyük ve hızlı veritabanı arama ulaşmak için güçlü bir bilgisayar gerektirir.
  2. Veritabanı arama için adanmış bilgisayara ProteoWizard ve sendelemek suite indirin.
    Not: ProteoWizard ve sendelemek suite açık kaynak bilgisayar yazılımı are ve online bulunabilir (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; Sendelemek Süiti: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). UniProt veritabanları için veritabanı arama kullanılır ve UniProt Web sitesinde bulunabilir.
  3. .Çiğ dosyalarını dönüştürmek .mzML dosyaları msconvert ile ProteoWizard28bir MS dosya biçimi dönüştürme aracı. Msconvert (MSConvertGUI.exe) GUI, Gözat düğmesini tıklatın ve .çiğ dosyasını dönüştürmek için seçin. MzML çıktı biçimini seçin ve diğer tüm seçenekler varsayılan değerlerinde tutun. GUI sağ altında Başlat düğmesini tıklatın.
  4. Sendelemek suite29TopFD aracını kullanarak .msalign dosyaları .mzML dosyaları dönüştürmek.
    1. GUI, TopFD (topfd_gui.exe), Dosya düğmesini tıklatın ve önceki adımda oluşturduğunuz .mzML dosyası seçin. Parametrelerin varsayılan değerlerini tutmak ve sonra GUI sağ altında Başlat düğmesini tıklatın.
      Not: TopFD monoisotopic kitlelere öncü ve parça izotopik kümeleri dönüştürür ve benzer monoisotopic kitleler ve yakın geçiş süreleri ile öncü izotopik kümeleri birleştirerek MS1 veri mümkün proteoform özellikleri tanımlar. TopFD bir ms1.msalign dosyası, bir ms2.msalign dosyası ve bir .feature dosyası da dahil olmak üzere üç dosyaları oluşturulur. Ms1.msalign ve ms2.msalign dosyaları MS1 ve MS/MS spectra, kitlelerin deconvoluted monoisotopic sırasıyla içerir. .Feature dosyası mümkün proteoform özellikleri içerir.
  5. Sendelemek (sürüm 1.1.3) kullanarak bir veritabanı araması sendelemek Süiti30' u yapmak.
    1. Sendelemek GUI (toppic_gui.exe), veritabanı dosyasını tıklayın ve arama için uygun bir veritabanı seçin.
    2. Spektrum dosyasını tıklatın ve adım 5.4.1 giriş olarak üretilen ms2.msalign dosyasını seçin. MS1 Özellik dosyası seçin ve adım 5.4.1 üretilen .feature dosyasını seçin.
    3. Sistein carbamidomethylation (C57) sabit bir değişiklik nedeniyle IAA tedavi olarak ayarlayın.
      Not: Bir metin dosyası aynı zamanda çeşitli sabit değişikliklerle bir metin Düzenleyicisi tarafından oluşturulabilir. Sonra metin dosyasının sendelemek GUI içinde sabit değişiklikler Dosya düğmesini kullanarak seçilebilir.
    4. Yem veritabanı özelliği seçin ve kesme ayarları altında spektrum düzeyyanındaki aşağı açılan menüde FDR (yanlış bulma oranı) seçin. FDR proteoform düzeyinde spektrum düzeyi ve 0,05 0,01 için ayarlayın.
      Not: Sendelemek sonuçları filtreleme için birden çok seçenek sağlar: spektrum düzeyi FDR, proteoform düzeyinde FDR veya her ikisi. FDR hedef-yem yaklaşım31tarihinde göre değerlendirilir.
    5. Seçili ve hata toleransı (ppm) 15'e ayarlamak oluşturma işlevi bırakın.
    6. Gelişmiş parametrelerialtında 2 kitle vardiya sayısı için aþaðý açýlan menüsünden seçin. Maksimum kütle kayması (Da) 500 bilinmeyen değişiklikler ayarla da diğer tüm parametreleri varsayılan değerlerinde bırakın ve şu GUI altındaki Başlat düğmesini tıklatın.
      Not: Sendelemek yazılım iki elde edilen metin dosyaları oluşturur. Dosya sonekini. OUTPUT_TABLE tespit proteoform spektrumlu maçlar (PrSMs) ve bir sonek ile bir listesini içerir. FORM_OUTPUT_TABLE tespit proteoforms listesini içerir. Her PrSM için yazılım genel bilgi sağlar maç, gözlenen parçalanma desen, eşleşen parça iyonları ve tespit edilen kitle vardiya.

Sonuçlar

Şekil 1 bir diyagram deneyde kullanılan dinamik pH Kavşağı-tabanlı sisteminin CZE-ESI-MS gösterir. Temel bir arabellek örnekte uzun bir fiş bir asidik BGE ile dolu bir LPA kaplı ayrılık kılcal damar içine enjekte edilir. Yüksek voltaj uygulandıktan sonra ı ve II, örnek bölge içindeki analitler konsantre yolu ile dinamik pH kavşak yöntemi olacaktır. CZE-MS sistem performansını değerlendirmek için bir standart protein karış...

Tartışmalar

Burada CZE-MS/MS proteoforms basit protein örneklerinde yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms karmaşık Proteom örneklerinde büyük ölçekli tanımlaması için kullanmak için detaylı bir protokol sağlar. Bir diyagramı CZE-ESI-MS/MS sisteminin Şekil 1' de gösterilen. İletişim kuralında dört kritik adım vardır. İlk olarak, yüksek kaliteli LPA kaplama kapiller ayrılması iç duvarda hazırlanması son derece önemlidir. Bir LPA kaplı ayrılık kılcal ...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Heedeok Hong'un grubu Michigan State University, Kimya Bölümü, nazikçe Escherichia coli hücreleri deneyler için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar genel tıbbi Bilimler Ulusal Enstitüsü, ulusal kurumları sağlık (NIH) Grant R01GM118470 (için X. Liu) ve Grant R01GM125991 destek (L. güneş ve X. Liu için) teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Fused silica capillaryPolymicro Technologies106815001750 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pelletsMacron Fine Chemicals7708-10Corrosive
LC-MS grade waterFisher ScientificW6-1
Hydrochloric acidFisher ScientificSA48-1Corrosive
MethanolFisher ScientificA456-4Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateSigma-AldrichM6514Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acidAcros Organics423805000Highy toxic
AcrylamideAcros Organics164855000Toxic, health hazard
Ammonium persulfateSigma-AldrichA3678Health hazard, Oxidizer
lysozymeSigma-AldrichL6876
Cytochrome CSigma-AldrichC7752
MyoglobinSigma-AldrichM1882
ß-caseinSgma-AldrichC6905
Carbonic anhydraseSigma-AldrichC3934
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
UreaAlfa Aesar36428-36
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD0632Health Hazard
IodoacetamideFisher ScientificAC122270250Health Hazard
Formic AcidFisher ScientificA117-50Corrosive, Health Hazard
C4 trap columnSepax Technologies110043-4001C3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
AcetonitrileFisher ScientificA998SK-4Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich1066-33-7
Nalgene rapid-flow filtersThermo Scientific126-00200.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cellsK-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered salineSigma-AldrichD8537
BCA assayThermo Scientific23250
AcetoneFisher ScientificA11-1
HPLC system for protein desaltingAgilient1260 Infinity II
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
CE autosamplerCMP ScientificECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interfaceCMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette pullerSutter InstrumentsP-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysisBranson101063196Model S-250A
Vaccum concentratorThermo Fisher ScientificSPD131DDA-115

Referanslar

  1. Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
  2. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
  3. Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
  4. Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
  5. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
  6. Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
  7. Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
  8. Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
  9. Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
  10. Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
  11. Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
  12. Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
  13. Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
  14. Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
  15. Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
  16. Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
  17. Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
  18. Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
  19. Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
  20. Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
  21. Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
  22. Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
  23. Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
  24. Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
  25. Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
  26. Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  27. McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
  28. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  29. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
  30. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  31. Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
  32. Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
  33. Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
  34. Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
  35. Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kimyasay 140yukar dan a a ya proteomikkapiller b lge Elektroforezelectrospray iyonla matandem k tle spektrometresiproteoformEscherichia coli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır