التحديد الكمي لتعزيز تعتمد على جسم مضاد الفيروس Zika في خلايا الإنسان الأولية

Summary

يصف لنا طريقة لتقييم أثر الحصانة موجودة مسبقاً ضد فيروس حمى الدنج في عدوى فيروس زيكا باستخدام مصل الدم البشري وخلايا الإنسان الأولية، والكمي العدوى بالكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل.

Abstract

وادي ظهور مصفر Zika والمضاعفات العصبية، مثل متلازمة غيلان-باريه وصغر الرأس عند الرضع، الشواغل المتعلقة بالسلامة العامة الخطيرة. من بين عوامل الخطر، يشكل تعزيز تعتمد على جسم (ADE) التهديد الأكثر أهمية، كما الأخيرة ظهور الفيروس Zika (زيكف) أساسا في المجالات التي تعرضت فيها السكان وفي حالة من الحصانة السابقة إلى أخرى وثيقة الصلة flaviviruses، وبخاصة فيروس حمى الدنج (DENV). هنا، يمكننا وصف بروتوكول للتحديد الكمي لأثر أضداد المصل البشري DENV على الإصابة زيكف في الخلايا البشرية الرئيسية أو خطوط الخلايا.

Introduction

من بين الأمراض الفيروسية المنقولة بالبعوض، العدوى Zika واحد من أكثر سريرياً هامة¹. بسبب العدوى مصفر زيكف التي، في معظم الحالات، يستخدم بعوض الزاعجة المصرية ك ناقل الابتدائي^1،2. ومع ذلك، هناك الدراسات التي أبلغت عن Aedes albopictus كناقل الأولية في بعض حالات تفشي زيكف³. على الرغم من أن الإصابة أعراض في كثير من الحالات، الأعراض الأكثر شيوعاً هي الحمى والصداع و الأم العضلات². لا تتوفر أي علاج أو لقاح للإصابة زيكف والعلاج المتاحة في معظمها داعمة. الأخيرة تفشي زيكف في أمريكا الجنوبية أدت إلى الحالات الشديدة من المرض، وزيادة الاضطرابات النمائية في الأجنة يدعى صعل²برنامج تقريبا. كما أن أمريكا الجنوبية منطقة مستوطنة إلى سيتناقش عدة مثل الفيروس DENV وغرب النيل، من الأهمية بمكان للتحقيق في ما إذا كانت الحصانة السابقة إلى أخرى flavivirus(es) يلعب دوراً في شدة زيكف العدوى والمرض.

على مر العصور، تطورت الفيروسات استراتيجيات مختلفة لزيادة فرصهم للعدوى من أجل السيطرة على آليات الخلية المضيفة وقمع استجابة الأدوية المضادة للفيروسات. واحدة من أروع من كل ما هو استخدام الأجسام المضادة المناعية قبل المضيف بالفيروسات لتعزيز تكرارها مع ظاهرة ADE⁴. ADE عبر جميع اللقاح أربعة من DENV وقد درست بشكل جيد وأظهر زيادة التتر الفيروسية والأمراض نتيجة^5،،من⁶⁷. في دراسة سابقة في المختبر، وقد أظهرنا زيادة كبيرة في زيكف النسخ المتماثل بسبب الموجودة مسبقاً DENV الحصانة في الخلايا المناعية البشرية الأولية⁸. كما أظهرنا أسلوب ذات صلة في المختبر لقياس قدرة DENV الموجودة من قبل الأجسام المضادة لتحسين النسخ المتماثل زيكف في الخلايا الأولية.

يستخدم البروتوكول الذي وضعنا عينات مصل الدم البشري الذي يتم اختباره لتحييد DENV في تسيد-50 أو فحوصات البلاك الحد من تحييد الاختبار (طباعة)، جنبا إلى جنب مع زيكف في ذات الصلة بيولوجيا الخلايا أو الخلايا المشتقة من الأنسجة التي يمكن أن تصيب زيكف.

Protocol

وتم الحصول على عينات الأمصال المستخدمة في هذه الدراسة من المشاركين البشرية من مجموعة من كولومبيا. وأقر المجلس الاستعراض الداخلي (IRB) في جامعة دي بامبلونا (كولومبيا، أمريكا الجنوبية) ومستشفى لوس بوتيوس⁸جمع العينات. قدمت العينات مجهولة والمحققين لم يكن الوصول إلى معلومات المريض. تم فحص عينات مصلية للنمط المصلي DENV المسيطر. العينات وتأكدت كذلك لتحييد العدوى DENV في المختبر. لعنصر التحكم، استخدمت عينات المصل من الأشخاص الأصحاء (HC) من الولايات المتحدة الأمريكية.

ملاحظة: يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة النسخ المتماثل ADE زيكف في أي نوع من الخلايا البشرية التعبير عن مستقبلات Fcγ. البروتوكول ويتكون من ثلاثة أجزاء (الشكل 1).

1-الخلية البذر والإعداد للإصابة

ملاحظة: وقد استخدمت لهذا دراسة معينة أو الضامة الابتدائي البشرية أو U937 حيدي الخلية خط (ATCC-CRL-1593.2). تم الاحتفاظ بالخلايا في ربمي النمو المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون (CO₂). جميع الخطوات التي نفذت في مجال السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL-2) السلامة الأحيائية من مجلس الوزراء في ظروف معقمة.

1. البذور 3 × 10⁴ خلايا كل جيدا في صفيحة مسطحة القاع 96-جيدا عقيمة جنبا إلى جنب مع 100 ميليلتر من المتوسطة ووضعها في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO₂.
2. بعد زرع الخلايا، ذوبان الجليد عينات المصل في درجة حرارة الغرفة وجعل الوقت تخفيف المسلسل (أي1/10، 1/100، 1/1,000، 1/10,000) عن طريق خلط العينات في المتوسط خالية من المصل. الكوة تخفيف في لوحة 96-جيدا عقيمة. استخدم الفيروس دون المصل كعنصر تحكم إضافية.
3. ذوبان الجليد رصيد زيكف عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 1-2 دقيقة ونقلها بسرعة الجليد لاستخدامها في المستقبل.
4. إضافة تعدد 0.1 من العدوى (وزارة الداخلية) ما يعادل مبلغ زيكف سلالة MR766 إلى مختبرين المصل.
   ملاحظة: تأكد من أن عامل إضعاف ما زالت مستمرة وأن إجمالي حجم ~ 200 ميليلتر؛ وهذا يكفي تريبليكاتيس لكل معاملة. تبقى ثلاثة آبار وقاية لاستخدامه كمراقبة سلبية لتحليل المتلقين للمعلومات.
5. احتضان تخفيف المصل مع الفيروس وأضاف في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ لح 1 بغية السماح لأجسام DENV إلى نموذج المجمعات مع فيريونس زيكا (للراحة، يشار إلى "مجمعات محصنة").
6. نضح الوسائط من الخلايا التي كانت تبذر في لوحة مسطحة القاع 96-جيدا. تغسل الخلايا مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (1 x PBS).
7. إضافة 50 ميليلتر من المجمعات المناعة لكل بئر واحتضانها لهم في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ ح 2.
8. بعد نضح ح 2 من الحضانة، وسائل الإعلام التي تحتوي على مجمعات محصنة من الخلايا، باستخدام القنوات المتعددة "الماصة؛"، وتغسل الخلايا 2 x مع 1 x برنامج تلفزيوني إزالة أي فيريونس فاتحة ومجمعات محصنة تماما.
9. إضافة 100 ميليلتر من وسائل الإعلام كاملة جديدة تستكمل مع 10% FBS لكل الخير واحتضان الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ ح 48.

2. استخراج الحمض النووي الريبي

1. إزالة لوحة 96-جيدا من الحاضنة ونقلها إلى مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
2. نضح وسائط الإعلام، وتغسل الخلايا 2 x مع 1 x برنامج تلفزيوني، والمضي قدما لاستخراج الحمض النووي الريبي.
   ملاحظة: ويمكن استخراج الحمض النووي الريبي بأي طريقة لاختيار (الرجوع إلى الجدول للمواد).
3. إضافة 250 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية مع 10% β-mercaptoethanol كل بئر. "الماصة؛" المخزن المؤقت صعودا وهبوطاً على الأقل 5 س جنبا إلى جنب مع خدش الخلايا مع طرف الماصة لتسريع عملية تحلل.
4. نقل ليساتيس الخلية إلى أنابيب مل 1.5 الجديد، المسمى، وعقيمة.
5. إضافة مبلغ مساو من الإيثانول 70% (250 ميليلتر). "الماصة؛" صعودا وهبوطاً 4 س-5 س حتى يصبح الخليط واضحة.
6. نقل الخليط (~ 500 ميليلتر) إلى تسمية الأعمدة المستندة على السليكا في أنابيب جمع 2 مل والطرد المركزي في 15,000 س ز لتجاهل س. 30 من التدفق من خلال الحفاظ الأعمدة في أنابيب جمع نفس.
7. إضافة 700 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 1 لكل عمود والطرد المركزي في 15,000 س ز لتجاهل س. 30 من التدفق من خلال إبقاء الأعمدة في أنابيب جمع نفس.
8. إضافة 500 ميليلتر يغسل المخزن المؤقت 2 لكل عمود وأجهزة الطرد المركزي في س 15,000 ز لتجاهل س. 30 المادة طافية. كرر هذه الخطوة 2 x.
9. نقل الأعمدة إلى أنابيب جمع 2 مل جديدة وأجهزة الطرد المركزي في س 15,000 ز للحد الأدنى 2 ضمان الحصول على أعمدة القائم على السليكا جافة تماما، وهناك لا الإيثانول غادر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2.
10. تجاهل هذه الأنابيب 2 مل ومكان الأعمدة في الجديدة والعقيمة، المسمى، أنابيب الإنعاش 1.5 مل.
11. إضافة بريوارميد (42 درجة مئوية) 30 ميليلتر من المياه خالية من رناسي في وسط كل عمود وأجهزة الطرد المركزي في 15,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
12. استرداد التيد الجيش الملكي النيبالي، وتحديد حجم العينات، باستخدام جهاز المطياف الضوئي في الطول موجي نانومتر 260.
    ملاحظة: ومن الناحية المثالية، تحديد نقاء الجيش الملكي النيبالي بحساب النسبة بين امتصاص القيم في 260 nm و 280 نانومتر. نسبة 260/280 المنقي رنا مثالي بين 1.8 2.0.

3-الكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل

ملاحظة: يمكن أن تنفذ الكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرة-PCR) باستخدام أي مزيج سيبر الأخضر الذي يتكون عادة من "الأخضر سيبر" أنا صبغ بوليميراز "الدنا بوليميراز"، ديوكسينوكليوتيدي تريفوسفاتيس (دنتبس) وصبغة سلبية. يمكن استخدام أي آلة qPCR قادرة على الكشف عن سيبر أخضر القيام برد فعل، والحصول على البيانات. استخدمت مجموعة RT-PCR خطوة واحدة لهذه التجربة، التي كان مزيج من "الأخضر سيبر" أنا روكس صبغ، بوليميراز الدنا بوليميراز، دنتبس وخليط مادة إضافية من المنتسخة العكسية (الرجوع إلى الجدول للمواد). كبسولة تفجير تصميم ضد منطقة المغلف والمستخدمة في هذه الدراسة لقياس مستويات الجينوم زيكف هي ككجكتجكككاكاكاج لربع النهائي زيكف وككاكتاكجتكتتتجكاجاكات زيكف-ريال قطري. كعنصر تحكم، يقاس الإنسان بيتا-2-ميكروجلوبولين (B2M) واستخدامه لتطبيع التعبير عن زيكف (الجينات التدبير المنزلي). تسلسل التمهيدي التحديد الكمي للتعبير الجيني B2M المستخدمة في هذه الدراسة هي كتككجتجككتاجكتجتج ل B2M-qF وتتجاجتاكجكتجاتاجككت ل B2M-ريال قطري. تأكد من وضع ثلاثة replicates التقنية لكل عينة زيكف والجينات B2M. إعداد RT-PCR يرد بإيجاز أدناه.

1. الإعداد RT-PCR
   1. استخدام 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي كل عينة.
   2. إضافة 1 ميليلتر من 10 ميكرون الأرصدة من الإشعال إلى الأمام وعكس كل من جين معين لكل رد فعل.
   3. إضافة 0.25 ميليلتر من مزيج المنتسخة العكسية كل عينة.
   4. لكل رد فعل فردي، إضافة 12.5 ميليلتر من مزيج "الأخضر سيبر".
   5. إضافة إلى 25 ميليلتر من الماء. جعل ماجستير في مزيج من جميع الكواشف المذكورة أعلاه باستثناء الجيش الملكي النيبالي، اليكووت في لوحة بكر 96-جيدا، وإضافة الحمض النووي الريبي آخر.
   6. ختم اللوحة بشريط لاصق شفاف.
   7. الطرد المركزي اللوحة في 1,000 س ز لمدة 1 دقيقة لخلط الكواشف.
   8. وضع اللوحة في الجهاز قبكر.
2. RT-PCR الشخصية
   ملاحظة: استخدام التشكيل الجانبي RT-PCR هو مبين في الجدول 1 .
   1. احتضان العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لضمان تركيب الحمض النووي التكميلية (كدنا).
   2. بعد التوليف كدنا، تنشيط بوليميراز "الدنا بوليميراز" في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   3. إجراء دورات 40 من تمسخ عند 95 درجة مئوية 10 s والصلب التمهيدي والإرشاد عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
   4. وضع الخطوة منحنى تذوب إضافية (65 درجة مئوية) في نهاية المطاف.
3. تحليل البيانات
   1. رصد المنحنى تذوب بواسطة النقر فوق علامة التبويب منحنى تذوب في البرنامج الذي تم استخدامه لتشغيل الجهاز قبكر، التي، من الناحية المثالية، ويبين ذروة واحدة في جميع العينات لجين معين للتأكد من وجود أمبليكون واحدة فقط وقيمة تضخيم إذا أكثر من 1.6 الغوري ويرى thm 2 كقيمة التضخيم 100% (قيمة التضخيم تختلف الخوارزمية المستخدمة من قبل الجهاز qPCR). تأكد من استخدام 0.5 درجة مئوية درجة الحرارة زيادات بين الخطوات والحد أدنى عقد الساعة 10 s في البروتوكول منحنى تذوب، لتحقيق أفضل النتائج.
   2. بعد التأكد من وجود أمبليكون واحد وقيمة التضخيم جيدة، أولاً انقر فوق علامة التبويب بيانات القياس الكمي للحصول على دورة كمية (Ct/Cq القيمة) من كل عينة وتصدير إلى Microsoft Excel.
   3. استخدام جداول بيانات، حساب متوسط كل عينة باستخدام قيمة الأشعة المقطعية. بعد ذلك، انقر فوق الصيغ وحدد المتوسط. يتم استخدام القيم المقطعية متوسط كل عينة (تكرار) لمزيد من التحليل.
   4. حساب ΔCt استخدام ΔCt الصيغة التالية، = متوسط Ct الجينات المستهدفة--متوسط Ct الجينات التحكم (في هذه الحالة، ΔCt = متوسط Ct الجين زيكف--متوسط Ct الجينات B2M).
   5. حساب ΔΔCt لتطبيع البيانات (في هذه الحالة، ΔΔCt = ΔCt زيكف عينات-عينات B2M).
   6. حساب إضعاف زيادة التعبير الجيني بكتابة 2^-(ΔΔCt) صيغة لكل قيمة واحدة ΔΔCt تطبيع. يمكن الحصول على نتائج زيادة إضعاف لإجراء الاختبارات الإحصائية كما هو موضح في دراسات سابقة^9،10.

النتائج

في الشكل 1، هناك مثال خطوة بخطوة البيانية لجميع الخطوات التي تنطوي عليها لتنفيذ البروتوكول ADE. ورسم تخطيطي يظهر الإجراء بأكمله "أدى زيكف" بسبب الحصانة موجودة مسبقاً إلى DENV. ويبين الشكل 2 المصل الإنسان كيف تم تصنيف العينات إلى ثلاث مجموعات م?...

Discussion

وقد أعاق ه DENV الأجسام المضادة مما يؤدي إلى ADE اللقاح DENV الأخرى تطوير لقاح فعال¹¹. وينتمي إلى نفس العائلة، فيروسات مصفرة، زيكف التماثل كبير مع فلافيفيروسيس الأخرى، لا سيما DENV¹². والهدف الرئيسي لتحييد الأجسام المضادة لكل من زيكف و DENV هو البروتين المغلف، الذي أسهم الت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum	GEMINI	100-106
iCycler	BioRad	785BR02188	Model No. CFX96 Optics Module
Microfuge 18 Centrifuge	Beckman Coulter	367160
Nanodrop-1000	Thermoscientific	1072
Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit	Qiagen	204154	Used for 1 step RT-qPCR
RNeasy RNA Isolation Kit	Qiagen	74106	Used for RNA extraction
RPMI-medium	Gibco	11875093