Antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde Zika şunun miktar

Özet

Biz insan serumu, birincil insan hücreleri ve enfeksiyon miktar nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu tarafından kullanarak Zika virüs enfeksiyonu önceden varolan bağışıklık dang virüs karşı etkisini değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Flavivirus Zika ve Guillain-Barré sendromu ve bebeklerde, microcephaly gibi nörolojik komplikasyonlara son ortaya çıkması ciddi genel güvenlik endişeleri getirdi. Son yeniden doğuş Zika virüs (ZIKV) öncelikle alanlarda nerede nüfus maruz kalmış ve öncesi dokunulmazlık için diğer yakından ilgili bir durumda olduğu gibi risk faktörleri arasında en ciddi tehdit, antikor bağımlı geliştirme (ADE) teşkil etmektedir flaviviruses, özellikle dang virüs (DENV). Burada, DENV karşı insan serum antikor ZIKV enfeksiyon birincil insan hücreleri veya hücre hatları üzerinde etkisini miktarının bir protokol açıklayın.

Giriş

Sivrisinekler yoluyla bulaşan viral hastalıklar arasında Zika enfeksiyon en klinik olarak önemli¹biridir. Enfeksiyon flavivirus kullandığı, çoğu durumda, Aedes aegypti onun birincil vektör^1,2ZIKV neden olur. Ancak, Aedes albopictus bazı ZIKV salgınlar³birincil bir vektör olarak bildirdin çalışma vardır. Enfeksiyon birçok durumda asemptomatik olmakla birlikte, hastalığın en yaygın belirtileri ateş, baş ağrısı ve kas ağrı²vardır. Herhangi bir tedavi veya aşı ZIKV enfeksiyonu için kullanılabilir ve mevcut tedavi çoğunlukla destek oluyor. ZIKV Güney Amerika'da son salgınları şiddetli vakalarda hastalık ve yaklaşık 20-fold microcephaly²adlı fetusa nörogelişimsel bozuklukta artışa yol açtı. Güney Amerika DENV ve Batı Nil virüsü gibi birkaç arboviruses endemik bir alan olduğu için diğer flavivirus(es) için önceden dokunulmazlık, ZIKV enfeksiyonlar ve hastalık şiddetinde bir rol oynar olup olmadığını araştırmak çok önemlidir.

Çağlar boyunca, virüs infektivite konak hücre makine almak ve antiviral yanıt bastırmak için onların şansını artırmak için farklı stratejiler geliştirmişlerdir. Biri en büyüleyici tüm ana bilgisayar önceden bağışıklık antikorlar yanında onların çoğaltma fenomen ADE⁴ile geliştirmek için virüs kullanımıdır. ADE DENV tüm dört serotipleri arasında iyi okudu ve viral titreleri ve hastalık sonucu^5,6,7artırmak için kanıtlanmış oldu. Bir önceki tüp bebek çalışmada, önceden var olan birincil insan bağışıklık hücreleri⁸DENV bağışıklık nedeniyle ZIKV çoğaltma önemli enhancement göstermiştir. Biz de ZIKV çoğaltma primer hücre içinde geliştirmek için DENV önceden varolan antikor kapasitesini ölçmek için ilgili bir tüp bebek yöntemi gösterdi.

TCID-50 DENV nötralize için test edilir insan serum numuneleri geliştirdiğimiz protokolünü kullanan veya plak azaltma nötralizasyon testi (PRNT), ZIKV biyolojik ilgili hücre veya hücreleri ZIKV bulaşabilir dokulardan türetilmiş birlikte deneyleri.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan serum numuneleri bir kohort Columbia insan katılımcılardan elde edilmiştir. Örnek koleksiyon Universidad de Pamplona (Columbia, Güney Amerika) ve Los Potios hastane⁸iç gözden geçirme Kurulu (IRB) tarafından kabul edildi. Örnekleri anonim olarak verilmiştir ve müfettişler hasta bilgi erişim vardı. Serum numuneleri için DENV serotip kontrol edildi. Örnekleri daha fazla DENV enfeksiyon nötralize etmek için teyit edildi tüp bebek. Kumanda pilleri, serum numuneleri ABD sağlıklı bireylerden (HC) kullanılmıştır.

Not: Bu iletişim kuralı, Fcγ reseptör ifade herhangi bir insan hücre tipi ZIKV ADE çoğaltmasında incelemek için kullanılabilir. Protokol üç oluşur parçaları (Şekil 1).

1. hücre tohum ve enfeksiyon Kurulum

Not: Bu belirli çalışma, insan birincil makrofajlar veya U937 myelomonocytic hücre satırı (ATCC-CRL-1593.2) için kullanılmıştır. Hücreleri RPMI büyüme orta % 10 fetal Sığır serum ile (FBS) takıma 37 ° C kuluçka %5 karbondioksit (CO₂) ile muhafaza. Tüm adımları bir Biyogüvenlik yapılmıştır 2 (BSL-2) Biyogüvenlik kabini steril koşullarda seviye.

1. Tohum 3 x 10⁴ hücre başına bir steril düz-alt 96-şey plaka ile birlikte orta 100 µL iyi ve 37 ° C kuluçka %5 CO₂koyun.
2. Hücreleri tohum sonra serum numuneleri, oda sıcaklığında erimek ve 10 kat seri dilutions yapmak (yani, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000) serum-Alerjik orta örneklerinde karıştırma tarafından. Aliquot steril bir 96-şey plaka içine dilutions. Serum olmadan virüs ek bir denetim kullanın.
3. ZIKV hisse senedi 1-2 min için bir su banyosunda 37 ° C'de erimek ve hızlı bir şekilde gelecekte kullanılmak üzere buz aktarabilirsiniz.
4. ZIKV gerilme MR766 enfeksiyonu (MOI) eşit miktarda 0.1 çokluğu serum aliquots ekleyin.
   Not: Seyreltme faktörü sabit kalır ve toplam hacim ~ 200 µL olduğundan emin olun; triplicates her tedavi için yeterli olduğunu. Üç kuyular için aşağı akım analizi negatif kontrol kullanmak için bulaşmamış tutun.
5. Serum dilutions % 5 CO₂ için 1 h 37 ° C kuluçka eklenen virüs ile DENV karşı antikorlar formu kompleksleri Zika virions (için kullanışlı, bundan sonra "bağışıklık kompleksleri" anılacaktır) ile için izin vermek için kuluçkaya.
6. Düz-alt 96-şey plaka numaralı seribaşı hücreleri medyadan Aspire edin. Steril 1 fosfat tamponlu tuz (1 x PBS) x hücrelerle yıkayın.
7. Her şey için bağışıklık kompleksleri 50 µL ekleyin ve onları %5 CO₂ 37 ° C kuluçka 2s için kuluçkaya.
8. 2 h, kuluçka, Aspire edin hücrelerden bağışıklık kompleksleri içeren medyayı kullanarak bir çok kanallı pipet sonra hücre 2 yıkama x 1 x PBS tamamen bağışıklık kompleksleri ve herhangi bir bekâr virions kaldırmak için ile.
9. 100 µL FBS her şey ve hücrelerin % 5 CO₂ 37 ° C kuluçka 48 h için kuluçkaya % 10 ile takıma taze tam medya ekleyin.

2. RNA çıkarma

1. 96-şey plaka kuluçka makinesi kaldırmak ve Biyogüvenlik kabini aktarın.
2. Medya Aspire edin, hücreleri 2 yıkama x 1 x PBS ile ve RNA ayıklama için devam edin.
   Not: RNA çıkarılan seçim herhangi bir yöntemle ( Malzemeler tabloiçin bakınız).
3. Hücre lizis arabelleği ile % 10 β-mercaptoethanol şey başına 250 µL ekleyin. Pipet ucu kadar lizis prosedürü hızlandırmak için hücrelerle tırmalamak ile birlikte en az 5 x yukarı ve aşağı arabellek pipette.
4. Hücre lysates yeni, etiketli, steril 1,5 mL tüpler için transfer.
5. % 70 etanol (250 µL) eşit miktarda ekleyin. Karışım temizlenene kadar x - 5 x 4 yukarı ve aşağı pipet.
6. 15.000 x g 30 s. atma için santrifüj kapasitesi ile akışı ve karışımı (~ 500 µL) silis tabanlı sütunlar 2 mL koleksiyonu tüpler transfer ve sütunları aynı koleksiyon tüplerde tutmak.
7. Yıkama arabelleği 1 700 µL her sütununu ekleyin ve 15.000 x g 30 s. atma için aracılığıyla akış santrifüj kapasitesi ve sütunları aynı koleksiyon tüplerde tutmak.
8. Her sütun ve santrifüj yıkama arabelleğinin 2 500 µL 15.000 x g 30 s. atma süpernatant için ekleyin. 2 x bu adımı yineleyin.
9. Transfer sütunları yeni 2 mL koleksiyonu tüpler ve 2 dk. silis tabanlı sütunlar tamamen kuru olsun ve orada hiçbir etanol sağlamak için 15.000 x g , santrifüj yıkama arabelleğinden 2 yaptı.
10. 2 mL tüpler atın ve sütunlarda yeni, steril, etiketli, 1,5 mL kurtarma tüpler yerleştirin.
11. Her sütun ve 1 dak için 15.000 x g , santrifüj ortasındaki prewarmed (42 ° C) 30 µL RNase free su ekleyin.
12. Eluted RNA yeniden elde etmek ve bir spektrofotometre bir 260 nm dalga boyu kullanarak örnekleri, ölçmek.
    Not: İdeal olarak, RNA saflığı 260 absorbans değerleri arasındaki oran hesaplayarak belirlemek nm ve 280 nm. Arıtılmış RNA'ın 260/280 ideal 1.8-2.0 orandır.

3. kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu

Not: Nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) genellikle SYBR ben boya yeşil, Taq DNA polimeraz, deoxynucleotide trifosfatlardan (dNTPs) ve pasif bir boya oluşan herhangi bir SYBR yeşil karışımı kullanılarak yapılabilir. Herhangi bir qPCR makine SYBR yeşil tespiti kabil reaksiyonu gerçekleştirmek ve verileri elde etmek için kullanılabilir. Bu deneme için bir tek adımlı RT-PCR kiti SYBR yeşil kokteyl aldım kullanıldığı ben, ROX boya, Taq DNA polimeraz, dNTPs ve transkriptaz ek bir karışımı ( Tablo malzemeleriçin başvurmak). Zarf bölge karşı tasarlanmış ve ZIKV genomik düzeylerini ölçmek için bu çalışmada kullanılan astar ZIKV-qF için CCGCTGCCCAACACAAG ve CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT ZIKV-qR için vardır. İnsan β-2-mikroglobulin (b2a) ölçülen ve ZIKV (kat hizmetleri gen) ifade normalleştirmek için kullanılan bir denetim. Bu çalışmada kullanılan b2a gen ekspresyonu ölçmek için astar dizileri b2a-qF için CTCCGTGGCCTTAGCTGTG ve TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT b2a-qR için vardır. Her örnek için üç teknik çoğaltır ZIKV ve b2a genler için koymak için emin olun. RT-PCR Kur aşağıda kısaca açıklanmıştır.

1. RT-PCR Kur
   1. Örnek başına kullanım 100 ng RNA'ın.
   2. 1 µL ileriye ve geriye doğru astar her reaksiyon için belirli bir gen 10 µM stokları ekleyin.
   3. Ters transkriptaz Mix örnek başına 0,25 µL ekleyin.
   4. Her bireysel tepki için 12.5 µL SYBR yeşil karışımı ekleyin.
   5. En çok 25 µL su ekleyin. RNA, aliquot dışında tüm yukarıda belirtilen reaktifler, 96-şey PCR tabak içinde karıştırın ve RNA son eklemek bir şablonu alın.
   6. Şeffaf Yapışkan bant ile plaka mühür.
   7. 1000 x g reaktifleri karıştırmak 1 dk için plaka santrifüj kapasitesi.
   8. Plaka qPCR alete koyayım.
2. RT-PCR profili
   Not: Tablo 1gösterilen RT-PCR profili kullanın.
   1. Örnekleri için 10 min 50 ° c tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi sağlamak için kuluçkaya.
   2. CDNA sentez sonra Taq DNA polimeraz 95 ° c 5 min için aktif hale getirin.
   3. 10 s ve astar tavlama ve uzantısı için 30 60 ° C'de denatürasyon 95 ° C'de 40 döngüleri gerçekleştirmek s.
   4. Ek eritebilir eğrisi adım (65 ° C) sonunda koyun.
3. Veri Analizi
   1. Algori gösteren, ideal olarak, tek bir tepe tek bir amplicon ve bir amplifikasyon değeri varlığını doğrulamak belirli bir gen için tüm örneklerde fazla 1,6 Eğer qPCR makine çalıştırmak için kullanılan programın içinde erime eğrisi sekmesini tıklayarak eritebilir eğrisi izlemek THM 2 (amplifikasyon değeri qPCR makine tarafından kullanılan algoritmaya göre değişir) % 100 amplifikasyon değer olarak düşünür. 0.5 ° C sıcaklık artışları merdivenleri ve en az 10 saat holding arasında kullandığınızdan emin olun en iyi sonuçlar için erime eğrisi protokolündeki s.
   2. Emin yaptıktan sonra bir tek amplicon ve iyi amplifikasyon değer, ilk tıklayın bir nicel döngüsü (Ct/Cq değer) her örnek alın ve Microsoft Excel'e aktarmak için miktar veri sekmesinde.
   3. Bir elektronik tablo kullanarak, Ct değeri kullanarak her örnek ortalamasını hesaplamak. Ardından, formüller'i tıklatın ve ortalama seçin. Her örneği (çoğaltma) ortalama CT değerler daha ayrıntılı bir çözümleme için kullanılır.
   4. Daha sonra formül ΔCt kullanarak ΔCt hesaplamak = Ct hedef gen ortalama - Ct denetim gen ortalama (Bu durumda, ΔCt = ZIKV gen Ct ortalama - Ct b2a gen Ortalama).
   5. ΔΔCt verileri normalleştirmek için hesaplamak (Bu durumda, ΔΔCt ΔCt ZIKV örnekleri - b2a örnekleri =).
   6. Her tek ΔΔCt normalleştirilmiş değeri için formül 2^-(ΔΔCt) yazarak gen ekspresyonu kat artırmak hesaplayın. İstatistiksel testler gerçekleştirmek için kat artış sonuçlarını daha önceki çalışmalar^9,10' açıklandığı gibi elde edilebilir.

Sonuçlar

Şekil 1' de, ADE Protokolü taşımak için ilgili tüm adımları adım adım grafiksel gösterimi var. Bu DENV için ZIKV ADE tüm prosedürü önceden varolan dokunulmazlık nedeniyle gösteren bir Şematik diyagramı. Şekil 2 gösterir nasıl insan serum örnekleri üç farklı gruplar halinde kategorize: DENV enfeksiyon doğruladı örnekleri DENV enfekte grup olarak bilinir, DENV antikor-teyit örnekleri DENV maruz kalan ...

Tartışmalar

Olan diğer DENV serotipi ADE için önde gelen DENV antikorların bir etkili aşı¹¹gelişimine engel. ZIKV Flaviviridae, aynı ailesine ait ve diğer flaviviruses, özellikle DENV¹²ile önemli bir Homoloji vardır. Hem ZIKV hem de DENV için antikorları nötralize ana hedef çok yüksek yapısal ve Kuvaterner sırası Homoloji arasında iki virüs^13,14,15hisse zarf proteindir. Y...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum	GEMINI	100-106
iCycler	BioRad	785BR02188	Model No. CFX96 Optics Module
Microfuge 18 Centrifuge	Beckman Coulter	367160
Nanodrop-1000	Thermoscientific	1072
Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit	Qiagen	204154	Used for 1 step RT-qPCR
RNeasy RNA Isolation Kit	Qiagen	74106	Used for RNA extraction
RPMI-medium	Gibco	11875093