Quantificação de realce dependente de anticorpo do vírus nas células humanas primárias Zika

Resumo

Nós descrevemos um método para avaliar o efeito da imunidade pré-existente contra vírus da dengue sobre a infecção pelo vírus Zika usando soro humano, células humanas primárias e quantificação de infecção por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa.

Resumo

O recente surgimento dos flavivirus Zika e complicações neurológicas, como síndrome de Guillain-Barré e microcefalia em lactentes, tem trazido preocupações sérias de segurança pública. Entre os fatores de risco, realce dependente de anticorpos (ADE) é uma ameaça a mais significativa, como o recente ressurgimento do vírus Zika (ZIKV) é principalmente em áreas onde a população foi exposta e está em um estado de pré-imunidade para outras estreitamente relacionadas flavivírus, especialmente o vírus da dengue (DENV). Aqui, descrevemos um protocolo para quantificar o efeito dos anticorpos de soro humano contra DENV na infecção ZIKV em células humanas primárias ou linhas celulares.

Introdução

Entre as doenças virais transmitidas por mosquitos, Zika infecção é um do mais clinicamente importantes¹. A infecção é causada pelo flavivirus ZIKV que, na maioria dos casos, usa o Aedes aegypti como seu principal vetor^1,2. No entanto, existem estudos que relataram Aedes albopictus como um vetor primário em alguns focos ZIKV³. Embora a infecção é assintomática em muitos casos, os sintomas mais comuns são febre, dor de cabeça e dor de músculo². Não há cura ou vacina disponível para infecção ZIKV e o tratamento disponível na maior parte é favorável. Surtos recentes de ZIKV na América do Sul levaram a casos graves da doença e aumento do distúrbio neurológico em fetos chamada microcefalia²aproximadamente 20-fold. Como a América do Sul é uma zona endémica de vários arbovírus como vírus DENV e do oeste do Nilo, é crucial investigar se imunidade prévia para outros flavivirus(es) desempenha um papel na gravidade de infecções ZIKV e doença.

Ao longo dos tempos, os vírus evoluíram diferentes estratégias para aumentar suas chances de infecciosidade para assumir a maquinaria de célula do hospedeiro e suprimir a resposta antiviral. Uma das mais fascinantes de todos é o uso de anticorpos pre-imune do hospedeiro por vírus para realçar sua replicação com o fenômeno ADE⁴. ADE em todos os quatro sorotipos de DENV tem sido bem estudada e demonstrada para aumentar a concentração viral e doença resultado^5,6,7. Em um estudo in vitro anterior, mostramos uma melhoria significativa da replicação de ZIKV devido ao pré-existente imunidade DENV em células do sistema imunológico humano primário⁸. Também demonstrámos um método in vitro relevante para quantificar a capacidade dos anticorpos pré-existentes DENV para melhorar a replicação de ZIKV em células primárias.

O protocolo que desenvolvemos usa amostras de soro humano que são testadas para a neutralização de DENV TCID-50 ou ensaios de teste de neutralização de redução de placas (PRNT), juntamente com ZIKV em células biologicamente relevantes ou células derivadas de tecidos que ZIKV pode infectar.

Protocolo

Amostras de soro utilizadas neste estudo foram obtidas de humanos participantes de uma coorte de Columbia. Coleta de amostra foi aprovada pelo Conselho de revisão interna (IRB) na Universidad de Pamplona (Columbia, América do Sul) e Los Potios Hospital⁸. As amostras foram fornecidas anonimamente e os investigadores não tinham acesso a informações do paciente. As amostras de soro foram verificadas para o sorotipo DENV. As amostras foram confirmadas para neutralizar a infecção DENV in vitro. Para controle, utilizaram-se amostras de soro de indivíduos saudáveis (HC) dos EUA.

Nota: Este protocolo pode ser usado para examinar a replicação ADE de ZIKV em qualquer tipo de célula humana, expressando o receptor de Fcγ. O protocolo é composto de três partes (Figura 1).

1. propagação de células e infecção Setup

Nota: Para este estudo particular, macrófagos primários humanos ou linha de celular U937 mielomonocítica (ATCC-CRL-1593.2) foram utilizados. As células foram mantidas em meio de cultura RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em uma incubadora de 37 ° C com 5% de dióxido de carbono (CO₂). Todas as etapas foram realizadas em uma biossegurança de nível 2 (BSL-2) do gabinete de segurança biológica em condições estéreis.

1. Células de⁴ sementes 3 x 10 por bem em uma placa de 96 poços de fundo plano estéril junto com 100 µ l de meio e colocá-los na incubadora 37 ° C com 5% de CO₂.
2. Após a semeadura as células, descongelar amostras de soro à temperatura ambiente e fazer 10 vezes diluições em série (ou seja, 1/10, 1/100, 1/1.000, 1/10.000), misturando as amostras em meio livre de soro. Alíquota as diluições em uma placa de 96 poços estéril. Use o vírus sem soro como um controle adicional.
3. Descongelar o estoque ZIKV a 37 ° C em banho-maria por 1-2 min e rapidamente transferi-los para gelo para uso futuro.
4. Adicione uma multiplicidade 0.1 de quantidade equivalente de infecção (MOI) da estirpe ZIKV MR766 para as alíquotas de soro.
   Nota: Certifique-se que o fator de diluição permanece constante e o volume total é de ~ 200 µ l; é o suficiente para triplica de cada tratamento. Mantenha três poços não infectados para usar como controle negativo para análise a jusante.
5. Incube as diluições do soro com o vírus adicionado na incubadora 37 ° C com 5% de CO₂ para 1 h, a fim de permitir que os anticorpos DENV para formar complexos com os virions Zika (por conveniência, doravante referida como "complexos imunes").
6. Aspire a mídia a partir de células que foram semeadas em placa de 96 poços de fundo plano. Lave as células com estéril 1x tampão fosfato salino (1X PBS).
7. Adicionar 50 µ l dos complexos imunes a cada poço e incube-os na incubadora 37 ° C com 5% de CO₂ por 2 h.
8. Depois de 2 h de incubação, aspirar a mídia contendo os complexos imunes de células, usando um multicanal Pipetar e lavar as células 2 x com PBS 1x para remover completamente os imunocomplexos e qualquer virions desanexadas.
9. Adicione 100 µ l de fresca mídia completa suplementada com 10% FBS a cada bem e incube as celulas na incubadora 37 ° C com 5% de CO₂ por 48 h.

2. extração do RNA

1. Retirar a placa de 96 poços da incubadora e transferi-lo para a armário de biossegurança.
2. Aspire a mídia, lavar as células 2 x com PBS 1x e proceder à extração do RNA.
   Nota: RNA pode ser extraído por qualquer método de escolha (consulte a Tabela de materiais).
3. Adicione 250 µ l de tampão de lise celular com 10% de β-Mercaptoetanol por bem. Pipete o buffer e descer pelo menos 5x juntamente com coçar as células com a ponta da pipeta para acelerar o processo de Lise.
4. Transferi os lisados celulares para tubos novos, rotulado, estéril 1,5 mL.
5. Adicione uma quantidade igual de etanol a 70% (250 µ l). Pipetar e descer 4 x - 5x até obter uma mistura clara.
6. Transfira a mistura (~ 500 µ l) para rotulado colunas baseadas em sílica, em tubos de colheita de 2ml e centrifugar a 15.000 x g durante 30 s. descarte o fluxo através de e manter as colunas em tubos de coleção mesmo.
7. Adicione 700 µ l de tampão de lavagem 1 para cada coluna e centrifugar a 15.000 x g durante 30 s. descarte o fluxo através de e manter as colunas em tubos de coleção mesmo.
8. Adicione 500 µ l de tampão de lavagem 2 para cada coluna e centrifugação a 15.000 x g por 30 s. descartar o sobrenadante. Repita este passo 2x.
9. Transferência as colunas para novos tubos de colheita de 2ml e centrifugar 15.000 x g por 2 min. Certifique-se que colunas baseadas em sílica ficam completamente secas e não há nenhum etanol deixaram de tampão de lavagem 2.
10. Descarte os tubos de 2 mL e coloque as colunas no novo, estéril, rotulado, tubos de recuperação de 1,5 mL.
11. Adicione escaldadas (42 ° C) 30 µ l de água livre de RNase no centro de cada coluna e centrifugar 15.000 x g por 1 min.
12. Recuperar o RNA eluted e quantificar as amostras, usando um espectrofotômetro no comprimento de onda de nm 260.
    Nota: Idealmente, determinar a pureza do RNA pelo cálculo da relação entre os valores de absorvância em 260 nm e 280 nm. Relação de 260/280 do RNA purificado é idealmente entre 1.8-2.0.

3. reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa

Nota: Reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR) pode ser realizada com o uso de qualquer mistura SYBR green, que geralmente é composta de SYBR Green tingir, Taq DNA polimerase, deoxynucleotide trifosfatos (dNTPs) e uma tintura passiva. Qualquer máquina de qPCR capaz de detecção do SYBR verde pode ser usada para realizar a reação e adquirir os dados. Para este experimento, foi utilizado um kit de RT-PCR de uma etapa que teve um coquetel de SYBR Green I, ROX tintura, Taq DNA polimerase, dNTPs e uma mistura adicional de transcriptase reversa (consulte a Tabela de materiais). Os primers desenhado contra a região de envelope e usado neste estudo para quantificar níveis de genômica de ZIKV são CCGCTGCCCAACACAAG para ZIKV-qF e CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT para ZIKV-qR. Como um controle, humana β-2-microglobulina (B2M) foi medido e utilizado para normalizar a expressão de ZIKV (gene de limpeza). As sequências de cartilha para quantificar a expressão de gene B2M usada neste estudo são CTCCGTGGCCTTAGCTGTG para B2M-qF e TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT para B2M-qR. Certifique-se de colocar três técnicas repetições para cada amostra para o ZIKV e os genes B2M. A configuração de RT-PCR é brevemente descrita abaixo.

1. Instalação de RT-PCR
   1. Uso 100 ng do RNA por amostra.
   2. Adicione 1 µ l de 10 ações µM de primers para diante e reversos de um gene específico para cada reação.
   3. Adicione 0,25 µ l de mistura de transcriptase reversa, por exemplo.
   4. Para cada reação individual, adicione 12,5 µ l de mistura de SYBR Green.
   5. Adicione até 25 µ l de água. Fazer um mestre misturar de todos os reagentes acima mencionados, exceto RNA, alíquota na placa PCR de 96 poços, e adicionar o RNA última.
   6. Feche a placa com fita adesiva transparente.
   7. Centrifugue a placa a 1.000 x g por 1 min misturar os reagentes.
   8. Coloque a placa na máquina de qPCR.
2. Perfil de RT-PCR
   Nota: Use o perfil de RT-PCR, mostrado no tabela 1.
   1. Incube as amostras a 50 ° C durante 10 minutos para garantir a síntese de DNA complementar (cDNA).
   2. Após a síntese do cDNA, ative a Taq DNA polimerase a 95 ° C por 5 min.
   3. Executar 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 10 s e recozimento da primeira demão e extensão a 60 ° C por 30 s.
   4. Coloca o passo de curva de derretimento adicionais (65° C) no final.
3. Análise de dados
   1. Monitorar a curva de derretimento clicando na guia de curva de derretimento no programa usado para executar a máquina qPCR, que, idealmente, mostra um pico único em todas as amostras de um determinado gene confirmar a presença de apenas um amplicon e um valor de amplificação mais de 1.6 se o algori THM considera o valor de amplificação de 100% (o valor de amplificação varia de acordo com o algoritmo usado pela máquina qPCR) 2. Certifique-se de usar incrementos de temperatura de 0,5 ° C entre etapas e um mínimo de tempo de 10 s no protocolo de curva de degelo, para obter melhores resultados.
   2. Depois de certificar-se de que há um único amplicon e amplificação bom valor, primeiro clique na guia dados de quantificação para obter um ciclo quantitativo (valor de Ct/Cq) de cada amostra e exportar para o Microsoft Excel.
   3. Usando uma planilha, calcule a média de cada amostra, usando o valor de Ct. Em seguida, clique em fórmulas e selecione a média. Os valores médios de CT de cada amostra (replicação) são utilizados para uma análise mais aprofundada.
   4. Em seguida, calcular a ΔCt usando a fórmula ΔCt = Ct do gene alvo de média - média Ct do gene do controle (neste caso, ΔCt = Ct do gene ZIKV de média - média Ct do gene B2M).
   5. Calcular ΔΔCt para normalizar os dados (neste caso, ΔΔCt = ΔCt ZIKV samples - amostras de B2M).
   6. Calcule que a dobra aumenta a expressão gênica, digitando a fórmula 2^-(ΔΔCt) para cada valor de ΔΔCt único normalizado. Os resultados do aumento de dobra para realizar testes estatísticos podem ser obtidos como descrito em anteriores estudos^9,10.

Resultados

Na Figura 1, há uma ilustração diagramática passo a passo de todas as etapas envolvidas para realizar o protocolo de ADE. É um diagrama esquemático mostrando todo o processo de ADE de ZIKV devido a imunidade preexistente para DENV. A Figura 2 mostra como soro amostras foram categorizadas em três grupos diferentes: amostras DENV-confirmada a infecção são referidas como o grupo de DENV-infectados, DENV anticorpo-confirmad...

Discussão

Reatividade cruzada de anticorpos DENV levando para o ADE de outros sorotipos DENV tem dificultado o desenvolvimento de uma vacina eficaz¹¹. ZIKV pertence à mesma família, Flaviviridae e tem uma considerável homologia com outros flavivírus, especialmente DENV¹². O alvo principal de anticorpos neutralizantes para ZIKV e DENV é a proteína de envelope, que compartilha uma homologia de sequência estrutural e quaternário muito alta entre os dois vírus^1...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Bovine Serum	GEMINI	100-106
iCycler	BioRad	785BR02188	Model No. CFX96 Optics Module
Microfuge 18 Centrifuge	Beckman Coulter	367160
Nanodrop-1000	Thermoscientific	1072
Quantifast SYBR-One step RT-PCR kit	Qiagen	204154	Used for 1 step RT-qPCR
RNeasy RNA Isolation Kit	Qiagen	74106	Used for RNA extraction
RPMI-medium	Gibco	11875093