استخراج وتحليل للتايوانيين دنج الأخضر

Summary

نقدم بروتوكول لاستخدام الإيثانول كمذيب لاستخراج وتميز التايوانية دنج الأخضر الذي يسلك النشاط المضاد للبكتيريا.

Abstract

دنج الأخضر التايوانية غنية في الفلافونويدات برينيلاتيد ومعارض طائفة واسعة من الأنشطة البيولوجية، مثل مضادات الأكسدة، مضاد للجراثيم، ومنها السرطان. أن المركبات النشطة بيولوجيا من دنج الأخضر التايوانية بروبولينس، إلا وهي جيم ودال، وواو، وزاي تركيز بروبولينس في دنج الأخضر التايوانية تختلف حسب الموسم والموقع الجغرافي. وهكذا، من المهم لوضع إجراءات موحدة وقابلة للتكرار لتحديد نوعية دنج الأخضر التايوانية. نقدم هنا، هو بروتوكول يستخدم كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء، المستندة إلى الإيثانول استخراج وتحليل نشاط المضاد للبكتيريا لتوصيف نوعية دنج الأخضر التايوانية. هذا الأسلوب يشير إلى أن استخراج الإيثانول 95% و 99.5% تحقيق محصول المادة الجافة كحد أقصى من التايوانيين دنج الأخضر، مما تسفر عن تركيزات أعلى من بروبولينس التي لها خصائص مضادة للجراثيم. ووفقا لهذه النتائج، يعتبر هذا البروتوكول يمكن الاعتماد عليها وقابلة للتكرار لتحديد نوعية دنج الأخضر التايوانية.

Introduction

دنج خليط راتنجية طبيعية التي تنتجها أنواع النحل Apis mellifera. دنج قد استخدمت على نطاق واسع منذ العصور القديمة في الأدوية الشعبية. وأفادت دراسة مؤخرا أن دنج مفيد للوقاية من العدوى الميكروبية والالتهاب¹. وقد أثبتت دراسات عديدة أن المركبات الحيوية النشطة الرئيسية في دنج هي الفلافونويد، استرات الأحماض الفينولية، برينيلاتيد فكوماريك الأحماض والأحماض ديتيربينيك^2،3. وحتى الآن، تم تحديد 10 مشتقات فلافانوني برينيلاتيد من دنج الأخضر التايوانية من خلال كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك])^4،5،،من⁶⁷. هي الأكثر وفرة من بين هذه بروبولينس جيم ودال، واو، وزاي^5،7. آثار دنج الأخضر التايوانية بيولوجية كبيرة ترتبط بمحتواه العالي من بروبولينس⁸.

تركيزات المركبات النشطة بيولوجيا في دنج تختلف اختلافاً كبيرا تبعاً للموسم والموقع الجغرافي التي يتم الحصول عليها في دنج. ويتضمن دنج الأوروبية أساسا الفلافونويد aglycone والفينوليه الأحماض⁹. المركبات الحيوية النشطة الرئيسية في دنج من البرازيل هي برينيلاتيد فكوماريك الأحماض، مثل artepillin جيم¹⁰. أظهرت دراسة أن هذا الموسم عامل حاسم لتحديد المحتوى الإجمالي بروبولين في دنج الأخضر التايوانية¹¹. المحتوى بروبولين في دنج الأخضر التايوانية أعلى في الصيف (أيار/مايو-تموز/يوليه)، وأدنى في فصل الشتاء¹¹. خاصية مضادة للجراثيم دنج اعتبرت على نطاق واسع أن يكون مؤشرا على النشاط البيولوجي. وبصفة عامة، أظهرت عينات دنج جمعت من مختلف مناطق خاصية المضادة للبكتيريا مماثلة؛ على سبيل المثال، وهي عموما فعالة ضد تقريبا جميع البكتيريا إيجابية ويسلك تأثير محدود للبكتيريا ضد البكتيريا سلبية الغرام^10،،من¹²¹³. التفاعلات التآزر بين الفلافونويدات في دنج أظهرت أن تأثير البكتيريا¹⁴. وبالمثل، أبلغ دنج الأخضر التايوانية ليكون لها تأثير مضادات الميكروبات ضد البكتيريا إيجابية¹⁵. وعلاوة على ذلك، كما حددت دراسة تأثير مضادات الميكروبات من التفاعلات بين بروبولينس في دنج الأخضر التايوانية⁸.

من الصعب وصف المركبات النشطة بيولوجيا في دنج نظراً لتكوينها الكيميائي يمكن أن تختلف وفقا لمصدرها الأصلي. ولذلك، من الضروري وضع طريقة مجدية وقابلة للتكرار لتحديد نوعية دنج الأخضر التايوانية. ومع ذلك، أنشئ لا الإجراء القياسي لاستخراج دنج الأخضر التايوانية والتحليل الوظيفي اللاحقة. واقترحت عدة طرق مختلفة تطبيق المذيبات العضوية وغير العضوية دنج استخراج^16،،من^1718،،من¹⁹²⁰. لأن دنج خليط محبتين، بينت الدراسات أن استخراج العضوية أفضل من الاستخراج غير العضوية^8،،من¹⁸¹⁹. تركيز مجموع بروبولين في دنج الأخضر التايوانية وخصائصه المضادة للبكتيريا هي المؤشرات الرئيسية لنوعية دنج الأخضر التايوانية. وهكذا، والغرض من هذه الدراسة تقديم بروتوكول لاستخدام الإيثانول كمذيب لاستخلاص وتوصيف خصائص مضادة للجراثيم دنج الأخضر التايوانية.

Protocol

1-إعداد المركبات الإيثانول المستخرج

1. تزن 10 غم دنج الأخضر التايوانية المجمدة، التي تم جمعها من خلايا النحل في تايوان من أيار/مايو إلى تموز/يوليه، وطحن باستخدام مطحنة التوابل. تأكد من أن قطعة كاملة من دنج الأخضر التايوانية الأرض إلى مسحوق ناعم دون أي الجزيئات الكبيرة.
2. إضافة 100 مل تركيزات مختلفة من الإيثانول (60% و 70%، 80%، 95% و 99.5%)، وفصل قوارير وخلط كل تركيز مع 10 جرام من دنج الأرض بالمياه.
3. احتضان عند 25 درجة مئوية وهز قارورة 250 لفة في الدقيقة ح 48.
4. تصفية مقتطفات الإيثانول عن طريق تصفية الورق بحجم مسام ميكرومتر 25.
5. إعادة تشكيل فيلتراتيس بحجمها الأصلي (100 مل) مع الإيثانول 95% باستخدام دورق حجمي.
6. تخزين مقتطفات الإيثانول في-20 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

2-إعداد مستخلصات الإيثانول [هبلك]

1. التركيز 10 مل من الإيثانول مقتطفات من فراغ البخر عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
2. خبز المادة الجافة في 45 درجة مئوية ح 24.
3. إعادة تشكيل المادة الجافة مع 10 مل إيثانول 95%.
4. تصفية 1 مل إيثانول استخراج باستخدام عامل تصفية المحاقن معقمة مع حجم مسام 0.45 ميكرومتر.
5. ريفيلتير مقتطفات الإيثانول باستخدام عامل تصفية المحاقن معقمة مع حجم مسام 0.22 ميكرومتر. فيلتراتي التي يتم جمعها، ويمكن تحليلها مباشرة باستخدام [هبلك].

3-تحليل المحتوى بروبولين باستخدام [هبلك]

1. إنشاء المنحنيات القياسية من بروبولينس
   1. تحضير 1 لتر المرحلة المتنقلة للحل الميثانول: المياه 88.8:11.2 (v/v).
   2. إعداد تخفيف المسلسل من بروبولين تركيزات (جيم ودال، واو، وزاي) القياسية (15.625 مغ/مل 31.25 ملغ/مل، 62.5 ملغ/مل و 125 ملغ/مل، على التوالي) باستخدام الحل المرحلة المتنقلة كمذيب.
   3. حقن 20 ميليلتر من تركيزات بروبولين القياسية في العمود عكس المرحلة، تسلسلياً من التركيز المنخفض إلى التركيز العالي.
   4. تعيين العمود [هبلك] في 30 درجة مئوية ومعدل التدفق إلى 1 مل/دقيقة.
   5. تعيين الطول الموجي لكشف الأشعة فوق البنفسجية إلى 280 نانومتر ومسجل الوقت إلى 20 دقيقة.
   6. تحليل معايير على الأقل 3 x.
   7. ارسم استجابة قياس المحور (ص) ضد تركيز محور (س) باستخدام حساب الورقة البرمجيات، وإنشاء منحنى قياسي مع المعادلة وقيمة R-ساحة.
2. تحليل استخراج الإيثانول s
   1. حقن 20 ميليلتر من مقتطفات الإيثانول التي تم الحصول عليها من الخطوة 2، 5 في العمود عكس المرحلة.
   2. تعيين العمود [هبلك] في 30 درجة مئوية ومعدل التدفق إلى 1 مل/دقيقة.
   3. تعيين الطول الموجي لكشف الأشعة فوق البنفسجية إلى 280 نانومتر ومسجل الوقت إلى 20 دقيقة.
   4. تحليل معايير على الأقل 3 x.
   5. حساب تركيز بروبولين في استخراج الإيثانول، باستخدام المعادلة لمنحنى القياسية التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.1.7 يستخدم منطقة الذروة لكل بروبولين.

4-الحد الأدنى من تركيز المثبطة والحد الأدنى من تحليل تركيز جراثيم

ملاحظة: يتم استخدام الأسلوب ميكروديلوشن تقييم فعالية المضادة للبكتيريا بروبولينس استخراج الإيثانول من دنج الأخضر التايوانية.

1. التحضير لاختبار الكائنات الحية
   1. ذوبان الجليد السلالات البكتيرية، الإشريكيّة القولونية، و المكوّرات العنقودية الذهبية وثم الثقافة لهم في مرق الصويا تريبتيك ومرق المغذيات، على التوالي، في 37 درجة مئوية ح 24.
   2. ممر في المذهبة س. استخدام مرق الصويا تريبتيك و كولاي استخدام مرق المغذيات لجيلين، ومن ثم، حساب الوحدات المكونة للمستعمرة بالعد مستعمرات فردية على صفيحة أجار.
2. إعداد الإيثانول مقتطفات عن اختبار النشاط المضاد للبكتيريا
   1. وتركز على مستخلصات الإيثانول التي تم الحصول عليها من الخطوة 1.5 بتبخر فراغ عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   2. إعادة تشكيل المادة الجافة مع ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، وضبط تركيز الاستخراج إلى 12.8 ملغم/مل.
   3. جعل إضعاف مسلسل (تركيزات: 5، 10، 20، 40، 80، 160، 320 و 640 ميكروغرام/ملليلتر) من الإيثانول مقتطفات استخدام المرق.
3. اختبارات تركيز المثبطة الدنيا
   1. إضافة 10 ميليلتر من مقتطفات الإيثانول المخفف تتراوح بين 0.156 640.0 ميكروغرام/مل في لوحة 96-جيدا.
   2. باستخدام مرق، ضبط مستوى الصوت إلى 100 ميليلتر، والحفاظ على [دمس] 5% في كافة تخفيف.
   3. تلقيح 100 ميليلتر من ثقافة البكتيرية (1 × 10⁶/mL) في لوحة 96-جيدا.
   4. مقتطفات العدوى الثقافة التي تحتوي على تركيزات مختلفة من الإيثانول في 37 درجة مئوية ح 48.
   5. تحليل النمو البكتيري وفقا التعكر واستخدام الكثافة البصرية (القارئ الميكروسكوبية) في 590 نيوتن متر لتحديد تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC).
4. الحد الأدنى من تركيز جراثيم الاختبارات
   1. تطعيم 10 ميليلتر من ثقافة السائل من كل بئر اختبار هيئة التصنيع العسكري التي أظهرت أي نمو على صفيحة أجار.
   2. احتضان في 37 درجة مئوية ح 24.
   3. تحديد النشاط جراثيم بتحديد أدنى تركيز التي كشفت عن لا النمو البكتيري مرئية. ويعتبر تركيز يقضي تماما على نمو الخلايا يكون تركيز البكتيرية الدنيا (أم بي سي).

النتائج

وترد في الجدول 1بيانات تمثيلية لاستخراج الإيثانول إيجابية. وكان محصول المادة الجافة من دنج الأخضر التايوانية ارتباطاً إيجابيا مع تركيز الإيثانول. وكان مقتطفات الإيثانول 95% و 99.5% المادة الجافة أعلى العائد من دنج الأخضر التايوانية. محصول المادة الجافة أقل من دنج ?...

Discussion

وأفادت دراسة أن تعطن، باستخدام تركيزات مختلفة من الإيثانول، يمكن أن تستخدم ل استخراج دنج البرازيلي¹⁷؛ ومع ذلك، هو العملية تستغرق وقتاً طويلاً¹⁷. استغرق 10 أيام على الأقل لاستخراج المركبات النشطة بيولوجيا، مثل محتوى الفينولية، من دنج البرازيلي¹⁷. واقتر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Whatman no. 4 filter paper	Sigma-Aldrich	WHA1004125
methanol	Sigma-Aldrich	34860
reverse phase RP-18 column	Phenomenex Inc.	00G-0234-E0
Staphylococcus aureus	ATCC	BCRC 10780
Escherichia coli	ATCC	BCRC 10675
tryptic soy broth	Sigma-Aldrich	22092
nutrient broth	Sigma-Aldrich	70122
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
spice grinder	Waring	WSG60K
microplate Reader	Molecular Devices	EMAX PLUS
HPLC system	Agilent	1200 Series
vacuum evaporation	BÜCHI	Rotavapor R-215