Estrazione ed analisi di propoli verde taiwanesi

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo dell'etanolo come solvente per estrarre e caratterizzare Taiwanese propoli verde che esibisce l'attività antibatterica.

Abstract

Propoli verde taiwanese sono ricco di flavonoidi prenilato e presenta una vasta gamma di attività biologiche, come antiossidante, antibatterico e quelli anticancro. I composti bioattivi di propoli verde Taiwanese sono propolins, cioè C, D, F e G. La concentrazione di propolins in Taiwanese propoli verde varia a seconda della stagione e la posizione geografica. Pertanto, è fondamentale per stabilire una procedura standard ripetibile per la determinazione della qualità di propoli verde Taiwanese. Qui, presentiamo un protocollo che utilizza estrazione basata su etanolo, cromatografia liquida ad alte prestazioni e un'analisi di attività antibatterica per caratterizzare la qualità Taiwanese propoli verde. Questo metodo indica che le estrazioni di etanolo 95% e 99,5% raggiungere i rendimenti massima sostanza secca da Taiwanese propoli verde, producendo quindi le più alte concentrazioni di propolins che hanno proprietà antibatteriche. Secondo questi risultati, il presente protocollo è ritenuto affidabile e ripetibile per determinare la qualità di propoli verde Taiwanese.

Introduzione

La propoli è una miscela resinosa naturale prodotta da specie di ape mellifera di Apis. Propoli sono stato ampiamente utilizzato sin dall'antichità in folk medicine. Uno studio recentemente riferito che propoli sono utile per prevenire le infezioni microbiche e infiammazione¹. Numerosi studi hanno dimostrato che i principali composti bioattivi in propoli sono i flavonoidi, esteri di acidi fenolici, prenilato p-cumarico acidi e acidi diterpenici^2,3. Fino ad oggi, sono state identificate 10 derivati di flavanone prenilato da Taiwanese propoli verde mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)^4,5,6,7. I più abbondanti fra questi sono propolins C, D, F e G^5,7. Gli effetti biologici considerevoli di propoli verde Taiwanese sono correlati con il suo alto contenuto di propolins⁸.

Le concentrazioni di composti bioattivi in propoli variano notevolmente a seconda della stagione e la posizione geografica da cui si ricava la propoli. Propoli europeo contiene principalmente il flavonoide aglicone e fenolica acidi⁹. I principali composti bioattivi propoli in Brasile sono prenilato p-cumarico acidi, ad esempio artepillin C¹⁰. Uno studio ha dimostrato che la stagione è un fattore critico per la determinazione del contenuto totale propolin in Taiwanese propoli verde¹¹. Il contenuto di propolin in Taiwanese propoli verde è più alto in estate (maggio - luglio) e la più bassa in inverno¹¹. La proprietà antibatterica della propoli è stato ampiamente considerata un indicatore di attività biologica. Generalmente, i campioni di propoli raccolti da varie regioni hanno esibito una simile proprietà antibatteriche; ad esempio, è generalmente efficace contro quasi tutti i batteri Gram-positivi ed esibisce un limitato effetto antibatterico contro batteri gram-negativi^10,12,13. Interazioni sinergiche tra i flavonoidi nella propoli sono state dimostrate per avere un effetto antibatterico¹⁴. Allo stesso modo, propoli verde Taiwanese è stato segnalato per avere un effetto antimicrobico contro batteri Gram-positivi¹⁵. Inoltre, uno studio ha inoltre identificato un effetto antimicrobico dall'interazione di propolins in Taiwanese propoli verde⁸.

La caratterizzazione dei composti bioattivi di propoli è difficile perché la sua composizione chimica può variare secondo la sua fonte di provenienza. Pertanto, è necessario stabilire un metodo fattibile e ripetibile per determinare la qualità della propoli verde Taiwanese. Tuttavia, nessuna procedura standard è stato stabilito per l'estrazione di propoli verde Taiwanese e successiva analisi funzionale. Sono stati proposti diversi metodi che variamente applicano solventi organici ed inorganici per propoli estrazione^{16,17,18,19,20}. Perché la propoli è un composto lipofilico, studi hanno dimostrato che estrazione biologica è meglio di estrazione inorganici^8,18,19. La concentrazione totale propolin in Taiwanese propoli verde e le sue proprietà antibatteriche sono indicatori chiave della qualità della propoli verde Taiwanese. Così, lo scopo di questo studio è di presentare un protocollo per l'utilizzo dell'etanolo come solvente per estrarre e caratterizzare le proprietà antibatteriche del Taiwanese propoli verde.

Protocollo

1. preparazione di composti di etanolo-estratti

1. Pesare 10 g di propoli verde Taiwanese congelati, che è stato raccolto dagli alveari in Taiwan da maggio a luglio, e macinatelo usando la smerigliatrice della Spezia. Confermare che pezzi interi di propoli verde Taiwanese sono macinati in polvere finissima senza eventuali particelle di grandi dimensioni.
2. Aggiungere 100 mL di varie concentrazioni di etanolo (60%, 70%, 80%, 95% e 99,5%) e acqua per beute separate e mescolare ogni concentrazione con 10 g di propoli di terra.
3. Incubare a 25 ° C ed agitare il matraccio a 250 giri/min per 48 h.
4. Filtrare gli estratti di etanolo attraverso carta da filtro con un diametro dei pori 25 μm.
5. Ricostituire i filtrati al loro volume originale (100 mL) con etanolo al 95% utilizzando un matraccio.
6. Conservare gli estratti dell'etanolo a-20 ° C.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. preparazione degli estratti dell'etanolo per HPLC

1. Concentrato 10 mL di etanolo estratti per evaporazione sotto vuoto a 40 ° C per 15 min.
2. Cuocere in forno la sostanza secca a 45 ° C per 24 h.
3. Ricostituire la sostanza secca con 10 mL di etanolo al 95%.
4. Filtro 1 mL di etanolo estrae utilizzando un filtro siringa sterile con un diametro dei pori da 0,45 µm.
5. Refilter gli estratti di etanolo con un filtro siringa sterile con un diametro dei pori da 0,22 µm. Il filtrato viene raccolto e possa essere analizzato direttamente mediante HPLC.

3. analisi del contenuto Propolin facendo uso di HPLC

1. Creazione di curve standard di propolins
   1. Preparare 1 L della fase mobile della soluzione di metanolo: acqua di 88.8:11.2 (v/v).
   2. Preparare diluizioni seriali del propolin concentrazioni standard (C, D, F e G) (15,625 mg/mL, 31,25 mg/mL, 62,5 mg/mL e 125 mg/mL, rispettivamente) utilizzando la soluzione di fase mobile come un solvente.
   3. Iniettare 20 µ l di propolin concentrazioni standard nella colonna fase inversa, in modo sequenziale dalla bassa concentrazione ad alta concentrazione.
   4. Impostare la colonna HPLC a 30 ° C e portata del flusso a 1 mL/min.
   5. Impostare la lunghezza d'onda del rilevatore UV a 280 nm e il tempo di registratore a 20 min.
   6. Analizzare le norme almeno 3 x.
   7. Tracciare la risposta di misurazione (asse y) contro la concentrazione (asse x) usando calcolo foglio software e creare una curva standard con l'equazione e il valore R-quadrato.
2. Analisi di Estratto di etanolo s
   1. Iniettare 20 µ l di etanolo estratti ottenuti dal passo 2.5 nella colonna a fase inversa.
   2. Impostare la colonna HPLC a 30 ° C e portata del flusso a 1 mL/min.
   3. Impostare la lunghezza d'onda del rilevatore UV a 280 nm e il tempo di registratore a 20 min.
   4. Analizzare le norme almeno 3 x.
   5. Calcolare la concentrazione di propolin nell'estratto dell'etanolo, usando l'equazione per la curva standard ottenuta dal punto 3.1.7 che utilizza l'area dei picchi per ogni propolin.

4. minima concentrazione inibente e minima concentrazione battericida analisi

Nota: Il metodo di microdilution è utilizzato per valutare l'efficacia antibatterica di propolins etanolo-estratti da propoli verde Taiwanese.

1. Preparazione degli organismi di prova
   1. Scongelare i ceppi batterici, Staphylococcus aureus ed Escherichia coli e quindi, cultura li in brodo di soia triptico e brodo nutritivo, rispettivamente, a 37 ° C per 24 h.
   2. Passaggio di S. aureus utilizzando brodo di soia triptico ed e. coli utilizzando brodo nutritivo per due generazioni e, quindi, calcolare unità formanti colonie contando diverse colonie su una piastra di agar.
2. Preparazione di etanolo estratti per test di attività antibatterica
   1. Concentrare gli estratti dell'etanolo ottenuti dal passaggio 1.5 per evaporazione sotto vuoto a 40 ° C per 15 min.
   2. Ricostituire la sostanza secca con solfossido dimetilico (DMSO) e regolare la concentrazione dell'estratto di 12,8 mg/mL.
   3. Preparare una diluizione seriale (concentrazioni: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 e 640 µ g/mL) di etanolo estratti utilizzando il brodo.
3. Prove di concentrazione minima inibente
   1. Aggiungere 10 µ l di etanolo diluito estratti che vanno da 0,156 a 640.0 µ g/mL in una piastra a 96 pozzetti.
   2. Utilizzando il brodo, regolare il volume a 100 µ l e mantenere 5% DMSO in tutte le diluizioni.
   3. Inoculare 100 µ l di coltura batterica (1 x 106/ml) nella piastra a 96 pozzetti.
   4. Inoculo di coltura contenenti varie concentrazioni di etanolo estrae a 37 ° C per 48 h.
   5. Analizzare la crescita batterica secondo la torbidità e l'utilizzo di densità ottica (lettore di micropiastre) a 590 nm per determinare la concentrazione minima inibente (MIC).
4. Concentrazione battericida minima test
   1. Inoculare 10 µ l di cultura liquido da ciascun pozzetto del test MIC che ha esibito alcuna crescita su una piastra di agar.
   2. Incubare a 37 ° C per 24 h.
   3. Determinare l'attività battericida identificando la concentrazione più bassa che ha rivelato nessun visibile crescita batterica. La concentrazione che elimina completamente la crescita delle cellule è considerata essere la minima concentrazione batterica (MBC).

Risultati

Positivi dati rappresentativi per l'estrazione di etanolo sono presentati nella tabella 1. La resa di sostanza secca da propoli verde Taiwanese è stata associata positivamente con la concentrazione di etanolo. Gli estratti di etanolo 95% e 99,5% avevano la sostanza secca più alta rendimento da propoli verde Taiwanese. Il rendimento più basso secca da propoli verde Taiwanese si è verificato quando l'acqua è stata usata come il solvente di estrazione. Questi risultati ...

Discussione

Uno studio ha riferito che la macerazione, utilizzando le varie concentrazioni di etanolo, poteva essere utilizzati per propoli brasiliano estrazione¹⁷; Tuttavia, il processo è stato molto tempo¹⁷. Ci sono voluti almeno 10 giorni per estrarre i composti bioattivi, ad esempio contenuto fenolico, dal propoli brasiliano¹⁷. In alternativa, estrazione di etanolo in combinazione con il riscaldamento a 37 ° C, 50 ° C o 70 ° C per 30 min è stato propost...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Whatman no. 4 filter paper	Sigma-Aldrich	WHA1004125
methanol	Sigma-Aldrich	34860
reverse phase RP-18 column	Phenomenex Inc.	00G-0234-E0
Staphylococcus aureus	ATCC	BCRC 10780
Escherichia coli	ATCC	BCRC 10675
tryptic soy broth	Sigma-Aldrich	22092
nutrient broth	Sigma-Aldrich	70122
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
spice grinder	Waring	WSG60K
microplate Reader	Molecular Devices	EMAX PLUS
HPLC system	Agilent	1200 Series
vacuum evaporation	BÜCHI	Rotavapor R-215