台湾グリーン プロポリスの抽出と分析

要約

抽出し抗菌活性を示す台湾産グリーンプロを特徴付ける溶媒としてエタノールを使用するためのプロトコルを提案します。

要約

台湾産グリーンプロ プレニル フラボノイドが豊富です、抗酸化、抗菌などの生物活性と抗がんものの広い範囲を展示します。台湾グリーン プロポリスの生理活性化合物、propolins、すなわち、C、D、F、および g.台湾グリーン プロポリスに含まれる propolins の濃度は、季節と地理的な場所によって異なります。したがって、台湾緑プロポリスの品質を決定するための標準および繰り返し可能な手順を確立する重要です。ここでは、台湾緑プロポリスの品質を特徴付けるに抗菌活性分析、高速液体クロマトグラフィー、エタノール ベースの抽出を使用するプロトコルを提案する.このメソッドは、95%、99.5% エタノール抽出が台湾緑プロポリス、抗菌特性を持つ propolins の最高濃度降伏から最大の乾物収量を達成することを示します。これらの調査結果によると現在のプロトコルは、信頼性と再現台湾緑プロポリスの品質を決めるのとみなされます。

概要

プロポリス蜂種セイヨウミツバチによって生成される天然樹脂混合物であります。プロポリスは、古来より民間療法で広く使用されています。研究は、最近そのプロポリスは微生物感染症と炎症¹を防止するために有益な報告。プロポリスに含まれる主な生理活性物質は、フラボノイド、フェノール酸エステル、プレニルp多数の調査は示した-クマル酸と diterpenic 酸^2,3。日には、台湾緑プロポリスから 10 プレニル フラバノン誘導体は高速液体クロマトグラフィー (HPLC)^4,5,6,7を介して識別されています。これらの中で最も豊富な propolins C、D、F、および G^5,7です。台湾グリーン プロポリスのかなり生物学的効果は、propolins⁸の高いコンテンツに関連付けられます。

プロポリスに含まれる生理活性化合物の濃度は季節やプロポリスの取得元となる地理的な場所によって大きく異なります。ヨーロッパのプロポリスには、フラボノイドのアグリコンとフェノール酸⁹主に含まれています。ブラジル産プロポリスに含まれる主な生理活性物質は、プレニルp-クマル酸、アルテピリン C¹⁰など。研究は、シーズンがグリーンプロ ポリス台湾¹¹で合計 propolin のコンテンツを決定する重要な要因であることを示した。台湾グリーン プロポリスの propolin の内容は、冬¹¹夏 (7 月) および最下位最高です。プロポリスの抗菌特性は、広く生物学的活性の指標となると考えられています。一般に、様々 な地域から採取したプロポリスのサンプルと同様の抗菌プロパティを展示してたとえば、それは一般的にほぼすべてのグラム陽性菌に対して有効であるし、グラム陰性菌^10,12,13に対して限定的な抗菌効果を展示します。プロポリスに含まれるフラボノイドの相乗的相互作用は、抗菌効果¹⁴を持っている示した。同様に、台湾の緑プロポリスは¹⁵グラム陽性菌に対する抗菌効果があると報じられました。さらに、研究には、台湾産グリーンプロ⁸の propolins の相互作用により抗菌効果も識別されます。

プロポリスに含まれる生理活性化合物の性状は、その化学組成は、その元のソースによって異なりますので難しいです。したがって、台湾緑プロポリスの品質を決めるため可能で再現可能な方法を確立する必要があります。ただし、標準的な手順が確立されていない台湾緑プロポリス抽出とその後の機能分析のため。プロポリス抽出^{16,17,18,19,20}いろいろ有機および無機溶剤を適用するいくつかの方法を提案されています。プロポリスは脂溶性の混合物、有機抽出は無機抽出^8,18,19より研究が示しています。台湾グリーン プロポリスとその抗菌特性で合計 propolin 濃度は、台湾緑プロポリスの品質の重要な指標です。したがって、本研究の目的は溶媒としてエタノールを使用して抽出し、台湾緑プロポリスの抗菌特性を特徴付けるのためのプロトコルを提示します。

プロトコル

1. エタノール抽出化合物の調製

1. 5 月から 7 月まで台湾でハチの巣から採取、冷凍の台湾緑プロポリスの 10 グラムの重量を量るし、スパイス グラインダーを使用してそれを挽きます。台湾グリーン プロポリスの全作品がなく任意の大きな粒子の細かい粉末状に地面であることを確認します。
2. 各種濃度のエタノール (60%、70%、80%、95%、99.5%) と別のフラスコと地面プロポリスの 10 g の各濃度をミックスに水 100 mL を追加します。
3. 25 ° C で、48 h の 250 rpm でフラスコを振る。
4. エタノール抽出液 25 μ m 孔径のフィルター ペーパーをフィルター処理します。
5. 95% エタノール、メスフラスコを使用して、元のボリューム (100 mL) にろ液を再構築します。
6. -20 ° C のエタノール抽出物を保存します。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。

2. エタノール抽出物の高速液体クロマトグラフィーのための準備

1. 40 ° C 15 分で真空蒸着法によるエタノール抽出物の 10 mL を集中します。
2. 24 h 45 ° C で乾物を焼きます。
3. 95% エタノール 10 mL で乾物を再構成します。
4. フィルター 1 mL のエタノールは、0.45 μ m 孔サイズの滅菌シリンジ フィルターを使用して抽出します。
5. 孔径 0.22 μ m の滅菌注射器フィルターを用いたエタノール抽出物を非します。濾液は、収集され、直接高速液体クロマトグラフィーを使用して分析することができます。

3. 高速液体クロマトグラフィーを使用して Propolin コンテンツの分析

1. Propolins の標準曲線の確立
   1. 88.8:11.2 (v/v) メタノール: 水ソリューションの移動相の 1 L を準備します。
   2. 準備 propolin のシリアル希薄標準 (C、D、F、および G) の濃度 (15.625 mg/mL、31.25 mg/mL、62.5 mg/mL と 125 mg/mL、それぞれ) 移動相溶液を溶媒として用いた。
   3. 高濃度低濃度から順に、逆相カラムに propolin 標準的な濃度の 20 μ L を注入します。
   4. 30 の ° C および 1 mL/分の流量で HPLC カラムを設定します。
   5. 280 に UV 検出器の波長を設定 nm と 20 分時の記録。
   6. 分析基準の少なくとも 3 x。
   7. プロット測定応答 (y 軸) の濃度 (x 軸) に対して計算を使用してソフトウェアをシートし、方程式と R 二乗値標準曲線を作成します。
2. 解析エタノール抽出s
   1. 逆相カラムに 2.5 ステップから得られるエタノール抽出物の 20 μ L を注入します。
   2. 30 の ° C および 1 mL/分の流量で HPLC カラムを設定します。
   3. 280 に UV 検出器の波長を設定 nm と 20 分時の記録。
   4. 分析基準の少なくとも 3 x。
   5. 各 propolin のピーク面積を使用するステップ 3.1.7 から得られる標準曲線の方程式を使って、エタノール抽出物の propolin の濃度を計算します。

4. 最小発育阻止濃度と最小殺菌濃度分析

注: 台湾緑プロポリスからエタノール抽出した propolins の抗菌効果を評価する微量液体希釈法を使用します。

1. 試験菌の調製
   1. 黄色ブドウ球菌と大腸菌、細菌の緊張を解凍し、文化にトリプシン醤油スープで栄養流体培養基、それぞれ、24 h の 37 ° C で。
   2. トリプシン大豆スープと 2 つの世代の栄養流体培養基を使用してE. 大腸菌を用いた黄色ブドウ球菌を通過し、その後、寒天版の個々 のコロニーをカウントすることによってコロニー形成単位を計算します。
2. 調製されたエタノールの抽出抗菌活性試験
   1. 40 ° C で真空蒸着法による 15 分間の 1.5 ステップから得られるエタノール抽出物を集中します。
   2. ジメチルスルホキシド (DMSO) で乾物を再構成し、12.8 mg/ml の抽出液の濃度を調整します。
   3. シリアル希釈を行う (濃度: 5、10、20、40、80、160、320、640 μ g/mL) エタノールの抽出スープを使用します。
3. 最小発育阻止濃度テスト
   1. 0.156 640.0 μ g/ml 96 ウェル プレートに至るまで希薄エタノール抽出液の 10 μ L を追加します。
   2. スープを使用すると、100 μ L にボリュームを調整し、すべての希釈液に 5 %dmso を維持します。
   3. 96 ウェル プレートに培養 (1 x 10⁶/mL) 100 μ L を接種します。
   4. 各種濃度のエタノールを含む培養菌を 48 h の 37 ° C で抽出します。
   5. 濁度と 590 で光学濃度 (マイクロ プレート リーダー) を使用してによると細菌の増殖を分析最小発育阻止濃度 (MIC) を決定する nm。
4. 最小殺菌濃度テスト
   1. 寒天プレート上に増殖しないマイク テストの各ウェルから液体培養の 10 μ L を接種します。
   2. 37 ° C 24 時間で孵化させなさい。
   3. 目に見える細菌の成長を明らかに最低濃度を識別することによって殺菌作用を決定します。細胞の増殖を完全に排除する濃度は、最小の細菌濃度 (MBC) と見なされます。

結果

エタノール抽出のための肯定的な代表的なデータは、表 1に掲載されています。台湾グリーン プロポリスから乾物収量はエタノール濃度と積極的に関連付けられました。95%、99.5% エタノール抽出物は、台湾緑プロポリスから得られる最高の乾物を持っていた。台湾グリーン プロポリスから最低乾物収量は、水抽出溶媒として使用したときに発生しました?...

ディスカッション

研究報告ブラジル産プロポリス抽出¹⁷; 用のエタノールの濃度を使用して浸漬可能性があります。しかし、プロセスは、時間のかかる¹⁷でした。ブラジル産プロポリス¹⁷からフェノール含量などの生理活性物質を抽出するために少なくとも 10 日かかった。また、ブラジル産プロポリス^19,21,...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Whatman no. 4 filter paper	Sigma-Aldrich	WHA1004125
methanol	Sigma-Aldrich	34860
reverse phase RP-18 column	Phenomenex Inc.	00G-0234-E0
Staphylococcus aureus	ATCC	BCRC 10780
Escherichia coli	ATCC	BCRC 10675
tryptic soy broth	Sigma-Aldrich	22092
nutrient broth	Sigma-Aldrich	70122
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
spice grinder	Waring	WSG60K
microplate Reader	Molecular Devices	EMAX PLUS
HPLC system	Agilent	1200 Series
vacuum evaporation	BÜCHI	Rotavapor R-215