كريسبر بوساطة "تحرير الجينوم" "البشري مسببات الأمراض الفطرية" المبيضات البيض

Summary

هندسة الجينوم كفاءة من المبيضات البيض أمر بالغ الأهمية لفهم الآلية المرضية وتطوير المداواة. هنا، يمكننا وصف بروتوكولا لتحرير بسرعة وبدقة الجينوم المبيضة استخدام كريسبر. البروتوكول يسمح للمحققين إدخال مجموعة كبيرة من التعديلات الوراثية بما في ذلك الطفرات وعمليات الإدراج والحذف.

Abstract

يصف هذا الأسلوب كفاءة كريسبر وساطة الجينوم تحرير الممرض الفطرية البشرية مثنوية المبيضات البيض. يتطلب تحرير كريسبر بوساطة الجينوم في المبيضة Cas9، دليل الجيش الملكي النيبالي، وإصلاح القالب. بلازميد الإعراب عن كودون خميرة الأمثل Cas9 (CaCas9) قد تم إنشاؤها. دليل تسلسل المنبع مباشرة من بام يتم استنساخ الموقع (نج) إلى ناقل التعبير Cas9. قالب إصلاح ثم تقدمت التمهيدي التمديد في المختبر. كوترانسفورميشن إصلاح القالب ومتجه إلى المبيضة يؤدي إلى تحرير الجينوم. اعتماداً على قالب إصلاح المستخدمة، يمكن أن يعرض المحقق النوكليوتيدات التغييرات أو عمليات الإدراج أو الحذف. كما مثنوية المبيضة الطفرات مصنوعة في كلا الآليلات الجينات، شريطة عدم إيواء الآليلات A و B بطانات التي تتداخل مع دليل استهداف أو إصلاح إدراج قالب. يمكن تحرير الجينات مولتيميمبير الأسر بالتوازي إذا تسلسل المصانة مناسبة موجودة في جميع أفراد الأسرة. هو محاط بمواقع FRT كريسبر المبيضة النظام المذكور وترميز فلبس. بناء على تحريض فليباسي، تتم إزالة علامة المضادات الحيوية (CaCas9) ودليل الحمض النووي الريبي من الجينوم. وهذا يسمح للمحقق لإجراء التعديلات اللاحقة للجينوم. المبيضة كريسبر أداة قوية هندسة الوراثية فطرية، والتعديلات الطفيفة على البروتوكولات وصف تسمح بتعديل الأنواع الفطرية الأخرى بما في ذلك جيم-صناعي، أ. كاستيلي، و S. cerevisiae.

Introduction

المبيضات البيض هو^2،،من¹³مسببات الأمراض الفطرية البشرية الأكثر انتشارا. فهم الاختلافات بين المبيضة والبيولوجيا الجزيئية الثدييات أمر بالغ الأهمية لتطوير الجيل القادم من العلاجات المضادة للفطور. وهذا يتطلب المحققين ليتمكن من معالجتها بسرعة ودقة وراثيا المبيضة.

التحوير الوراثي المبيضة كانت تحديا تاريخيا. لا يحتفظ المبيضة والبلازميدات، وبالتالي يجب أن يدمج كافة بنيات في الجينوم. وعلاوة على ذلك، المبيضة مثنوية؛ ولذلك، عند انقطاع أحد جينات أو الأخذ بطفرة، من المهم التأكد من أن كلا نسخ تم تغيير⁴. وبالإضافة إلى ذلك، يتم بعض المكاني المبيضة متخالف، مما زاد من تعقيد الاستجواب الوراثية⁵. التلاعب وراثيا المبيضة، أنها نموذجية القيام بجولات متعددة من جزئ مثلى⁶. ومع ذلك، طبيعة مثنوية الجينوم وتطوير بناء شاقة جعلت هذا عملية يحتمل أن تكون شاقة، لا سيما إذا كانت عدة تغييرات مطلوبة. هذه القيود وأهمية الطبية المبيضة الطلب على تطوير التكنولوجيات الجديدة التي من شأنها أن تمكن المحققين أكثر سهولة التلاعب جينوم المبيضة .

متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر)-تحرير وساطة الجينوم هو أداة قوية تمكن الباحثين تغيير تسلسل الجينوم. كريسبر يتطلب ثلاثة عناصر: 1) نوكلياسي Cas9 أن كليافيس الهدف الحمض النووي، 2) 20 قاعدة دليل الحمض النووي الريبي التي تستهدف Cas9 لتسلسل الفائدة، و 3) إصلاح الحمض النووي قالب إصلاح الموقع الانقسام، ويتضمن التغيير المقصود^{7، 8}. بمجرد الدليل يجلب Cas9 إلى تسلسل الجينوم المستهدفة، يتطلب Cas9 تسلسل عزر المتاخمة (بام) بروتوسباسير (نج) المنبع مباشرة تسلسل دليل تنشق الحمض الخلوي الصبغي⁹. ويوفر درجة عالية من استهداف خصوصية الحاجة إلى دليل قاعدة 20 وتسلسل بام ويحد من الانقسام خارج الهدف.

وقد تم تصميم أنظمة كريسبر لتحرير الجينوم من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية، ومعالجة مجموعة متنوعة من المشاكل¹⁰. الموصوفة هنا بروتوكول كريسبر مرنة وفعالة لتحرير جين المبيضة للفائدة. يدخل التجربة كودون توقف لجينات، مما تسبب في إنهاء الترجمة. ويمكن إجراء عمليات تحرير أخرى اعتماداً على قالب الإصلاح التي يتم تقديمها. جزء ملحوظ مع نورسيوثريسين (نات^ص) التي تحتوي على الخميرة كودون محسن Cas9 (CaCas9) والذي أدرج دليل الحمض النووي الريبي في الجينوم المبيضة في موقع محايد. كوترانسفورميشن مع إصلاح قالب ترميز الطفرة المرجوة يؤدي إلى إصلاح الانقسام جزئ مثلى وتحرير الجينوم تتسم بالكفاءة. المذكورة أدناه هي تحرير TPK2، ولكن جميع المبيضة فتح قراءة الإطارات يمكن أن تكون مستهدفة عدة مرات قبل كريسبر. نظام كريسبر هو محاط بمواقع معاهدة سجل الأفلام ويمكن إزالتها من الجينوم المبيضة بتحريض فليباسي ترميز على بلازميد التعبير CaCas9. ويتيح نظام كريسبر المبيضة المحققون بدقة وسرعة تحرير^11،الجينوم المبيضة ¹².

Protocol

1-التعريف واستنساخ لتسلسل دليل الحمض النووي الريبي

1. تحديد دليل تسلسل الحمض النووي الريبي
   1. التعرف 5 '-نج-3' تسلسل بام قريبة من حيث سيتم إدراج كودون التوقف. (الشكل 1A) يسمى كل تسلسل بام توجد في أزواج قاعدة أول 100 من TPK2 (الشكل 1A).
      ملاحظة: يمكن الاطلاع على تسلسلات دليل استهداف كل إطار القراءة المفتوح المبيضة في http://osf.io/ARDTX ^11،12.
   2. تحديد التسلسل إلى الأمام دليل Primer_3، التي سوف تكون 20 قواعد مباشرة من أم نج الموقع المنبع ولن يحتوي على أكثر من 5 الملخص في صف واحد. الأيسر على قاعدة مباشرة المنبع نج واسحب المؤشر 20 قواعد، الأيسر ثم في علامة التبويب التمهيدي لإضافة التمهيدي.
   3. تحديد تسلسل عكس Primer_3 الدليل، الذي سيكون مكملاً للتسلسل "إلى الأمام دليل".
      ملاحظة: يظهر هي الأدلة التي تستخدم PAM_3 (الشكل 1B).
   4. انقر بالزر الأيمن التمهيدي وحدد "نسخ البيانات التمهيدي". لصق في التسلسل في برنامج تحرير نص.
2. إضافة تسلسلات المتراكمة إلى أوليجوس إلى الأمام وعكس دليل لتسهيل استنساخ (الجدول 1، الشكل 1B).
   1. إضافة تسلسل النوكليوتيدات أتتتج إلى نهاية 5 ' Primer_3 دليل قدما قبل الشراء.
   2. إضافة ز إلى 3 ' نهاية Primer_3 دليل قدما قبل الشراء.
   3. إضافة تسلسل النوكليوتيدات آآآك إلى نهاية 5 ' Primer_3 دليل عكس قبل الشراء.
   4. إضافة ج 3 ' نهاية Primer_3 دليل عكس قبل الشراء.
3. CaCas9 دايجست التعبير متجه pV1524 مع بسمبي.
   ملاحظة: pV1524 يحتوي على علامات نورسيوثريسين (نات^ص) والامبيسلين (أمبير^r). وقد Cas9 كودون الأمثل المبيضة.
   1. هضم بلازميد واسطة إضافة: 2 ميكروغرام من pv1524، ميكروليتر 5 10 × المخزن المؤقت، 1 ميكروليتر من بسمبي، وح₂س إلى 50 ميكروليتر في أنبوب 1.5 مل. احتضان في 55 درجة مئوية عن 20 دقيقة (بدلاً من ذلك، هضم pv1524 لمدة 15 دقيقة مع Esp3I، إيسوشيزومير بسمبي، في 37 درجة مئوية)
   2. بارد بدرجة حرارة الغرفة (RT) وتدور لمدة 30 ثانية في س 2,348 ز لتحقيق التكثيف إلى الجزء السفلي من الأنبوب. انتقل إلى الخطوة 1.4 أو تخزين بلازميد هضمها عند-20 درجة مئوية.
4. الفوسفاتيز-علاج العمود الفقري هضمها.
   1. إضافة 1 ميكروليتر من العجل الفوسفاتيز المعوية (CIP) إلى الخليط الهضم واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
   2. تنقية بلازميد هضمها استخدام تنقية عدة (الإرشادات المتوفرة مع مجموعة أدوات) تفاعل المتسلسل (PCR) بوليميريز متاحة تجارياً والوت أنه في 30 ميكروليتر من شطف المخزن المؤقت (المجلس التنفيذي).
5. فوسفوريلاتي ويصلب إلى الأمام دليل Primer_3 وعكس دليل Primer_3.
   1. إضافة ميكروليتر 0.5 من 100 ميكرومتر إلى الأمام دليل Primer_3، ميكروليتر 0.5 من 100 ميكرومتر عكس Primer_3 دليل ميكروليتر 5 من 10 x T4 ليجاسى العازلة، 1 ميكروليتر من T4 بولينوكليوتيدي كيناز وميكروليتر 43 ح₂س إلى أنبوب PCR.
   2. إضافة 5 ميكروليتر من 10 x T4 ليجاسى العازلة وميكروليتر 1 من T4 بولينوكليوتيدي كيناز ميكروليتر 44 من البيولوجيا الجزيئية-الصف ح₂س في أنبوب PCR ثانية.
      ملاحظة: وهذا سيكون بمثابة عنصر التحكم السلبي.
   3. احتضان الخلائط رد فعل في ثيرموسيكلير عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   4. تبريد المخلوط بمعدل أبطأ المنحدر إلى 16 درجة مئوية يصلب، أوليجوس. ثم ضع خليط اليغو الملدن في 4 درجات مئوية.
6. سد أوليجوس الملدن في pv1524 هضمها من الخطوة 1.4.3.
   1. يضاف ما يلي إلى أنبوب PCR: يهضم ميكروليتر 1 10 x T4 ليجاسى العازلة، ميكروليتر 0.5 من ليجاسى T4 الحمض النووي، ميكروليتر 0.5 من مزيج اليغو الملدنة، ويعامل CIP تنقية بلازميد (20 – 40 نانوغرام)، وح₂س إلى إجمالي 10 ميكروليتر.
   2. يضاف ما يلي إلى أنبوب PCR: 1 ميكروليتر من 10 x T4 ليجاسى العازلة، ميكروليتر 0.5 من الحمض النووي T4 ليجاسى، يهضم يعامل CIP ناقلات المنقي (20 – 40 نانوغرام)، ميكروليتر 1 خليط المراقبة السلبية، وح₂س تصل إلى إجمالي 10 ميكروليتر.
   3. احتضان كل الأنابيب في ثيرموسيكلير في 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم تبرد إلى 25 درجة مئوية.
7. تحويل 5 ميكروليتر من الخلائط ربط كيميائيا المختصة الإشريكيّة القولونية DH5α استخدام بروتوكول تحويل صدمة حرارة قياسية. حدد الوسائط رطل أمبير/نات (200 ميكروغرام/مل أمبير، 50 ميكروغرام/مل Nat).
   ملاحظة: سيؤدي إلى فقدان Nat/CaCas9/دليل الوحدة النمطية للفشل في تحديد pV1524 ومشتقاته على وسائط التحديد مزدوجة بالختان حزب العمل الفيجي/FRT في البكتيريا.
8. تنقية والبلازميدات من أربعة ترانسفورمانتس مينيبريب، وتسلسل تسلسل الإدخال مع تسلسل التمهيدي (الجدول 1).
   ملاحظة: معظم الوقت، وتسلسل ترانسفورمانتس 4 غير كافية لتحديد النسخة الصحيحة على الأقل 1.
9. حفظ البلازميدات التي لها تسلسل الحمض النووي الريبي دليل المستنسخة لمرة واحدة في بسمبي قطع الموقع عند-20 درجة مئوية.

2-تصميم وإنشاء قالب إصلاح

1. إدراج كودون توقف طريق رهانك في التسلسل الجيني وإضافة النيوكليوتيدات التي ترميز توقف كودون وتقييد هضم موقع (الشكل 1، الجدول 1).
   ملاحظة: سيتم تعطيل الإدراج بالتسلسل بام.
   ملاحظة: وستدرج موقع هضم تقييد في تسلسل إصلاح القالب لتسهيل فحص كفاءة من الحيوانات المستنسخة (الشكل 1).
2. Left-click 10 قواعد المصب التي سيجري فيها الطفرة واسحب المؤشر 60 قواعد المنبع. الأيسر من علامة التبويب التمهيدي لإضافة التمهيدي. سيقوم هذا بإضافة إصلاح قالب Forward_3. Left-click 10 قواعد المنبع حيث سيجري الطفرة واسحب المؤشر 60 قواعد المصب. الأيسر من علامة التبويب التمهيدي لإضافة التمهيدي. سيقوم هذا بإضافة 3 عكس قالب إصلاح. (الشكل 1)
3. إجراء تمديد التمهيدي لإنشاء قالب إصلاح.
   1. إضافة ميكروليتر 1.2 100 ميكرومتر إلى الأمام إصلاح قالب التمهيدي، ميكروليتر 1.2 من 100 ميكرومتر إصلاح قالب عكس التمهيدي، ميكروليتر 6 من ديوكسينوكليوتيدي تريفوسفاتيس (دنتبس) (مجموع تركيز 40 مم)، 6 ميكروليتر من المخزن المؤقت وميكروليتر 0.6 من [تق] [بولمرس] (3 وحدات) ميكروليتر 45 ح₂س إلى كل من بكر 4 أنابيب.
   2. إجراء تمديد التمهيدي بتشغيل بين 20 و 30 طلقة من بكر. شروط تمديد المثال: 2 دقيقة عند 95 درجة مئوية، (30 ثانية عند 95 درجة مئوية، 1 دقيقة عند 50 درجة مئوية، 1 دقيقة في 68 درجة مئوية) x 34، 10 دقيقة في 68 درجة مئوية.
   3. دمج محتويات كافة أنابيب PCR 4 في أنبوب 1.5 مل واستخدام أدوات تنقية PCR لتنقية المنتجات في 50 ميكروليتر من H₂o.
   4. كوانتيتاتي منتجات تمديد التمهيدي لكفالة كافية من الحمض النووي من خلال تحديد امتصاص في 260 نيوتن متر.
      ملاحظة: التركيز النهائي نموذجي المنتج تمديد التمهيدي هو ~ 200-300 نانوغرام/ميليلتر.

3-تحويل المبيضة مع إصلاح القالب وبلازميد

1. جعل خلات الليثيوم/الشركة المصرية للاتصالات.
   1. ميكس 10 مم تريس Cl يدتا 1 مم، خلات الليثيوم 100 مم وح₂س (جميع الأسهم الحل pH 7.5) لتحقيق إجمالي حجم 50 مل.
2. جعل لوحة
   1. مزيج 40% 3350 ربط خلات الليثيوم 100 مم، 10 مم تريس Cl، 1 مم يدتا وح₂س (جميع الأسهم الحل pH 7.5) لتحقيق إجمالي حجم 50 مل.
3. هضم والبلازميدات المستنسخة بشكل صحيح من الخطوة 1، 9.
   1. إضافة 10 ميكروغرام بلازميد، 4 ميليلتر من المخزن المؤقت 10 x ميليلتر 0.4 من 10 ملغ/مل ألبومين المصل البقري (BSA)، 0.5 ميليلتر كبني و 0.5 ميليلتر من مبادرة ح₂0 إلى 40 ميكروليتر إجمالي حجم في أنبوب 1.5 مل. احتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (الشكل 1).
4. تنمو ثقافة بين عشية وضحاها من المبيضة SC5314، بروتوتروف البرية من نوع، عند 25 درجة مئوية في سكر العنب ببتون الخميرة تكملها 0.27 ملم أردين (YPD + أوري)، من الناحية المثالية ل التطوير التنظيمي₆₀₀ أقل من 6.
   1. بيليه OD 5₆₀₀ وحدات الخلايا في التحول من الغزل لمدة 5 دقائق في 2,348 س ز وتعليق OD 5₆₀₀ من الخلايا الأعلاف في 100 خلات الليثيوم TE/ميليلتر.
5. يضاف ما يلي إلى أنبوب 1.5 مل في الترتيب المسرود: 1) 100 ميليلتر من الخلايا في خطوة 3.4.1، ميليلتر 2) 40 الحيوانات المنوية السلمون مسلوق وتبريد سريع الحمض النووي (10 مغ/مل)، 3) 10 ميكروغرام الهضم بلازميد من الخطوة 3.3.1، 4) 6 ميكروغرام من قالب إصلاح المنقي ، و 5) 1 مل لوحة.
6. يضاف ما يلي إلى أنبوب 1.5 مل في الترتيب المسرود: 1) 100 ميليلتر من الخلايا، ميليلتر 2) 40 من الحيوانات المنوية السلمون مسلوق وتبريد سريع الحمض النووي (10 مغ/مل)، 3) ح₂س حجم مساو لتحويل الحمض النووي في الخطوة 3، 5، و 4) 1 مل من لوحة.
   ملاحظة: هذا سيكون بمثابة عنصر تحكم سلبية.
7. مزج التحولات بلطف بيبيتينج، والسماح لاحتضان عند 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
8. صدمة الحرارة الخلايا بوضعها في حمام مائي 44 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
9. تدور لمدة 5 دقائق في 2,348 س ز في أجهزة الطرد مركزي benchtop وإزالة الخليط لوحة طافية. أغسل مرة واحدة عن طريق إضافة 1 مل من YPD + أوري والطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في س 2,348 ز.
10. تعليق الخلايا في 0.1 مل من YPD + أوري، واحتضان على اسطوانة الاسطوانة أو شاكر عند 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
11. لوحة على YPD + أوري مع 200 ميكروغرام/مل نورسيوثريسين. سوف تظهر المستعمرات في 2 – 5 أيام.

4-الشرائط للمستعمرات واحدة

1. تقسم 100 ملم × 15 ملم طبق بيتري إلى أرباع، وتسمية كل رباعي.
   1. لمسة واحدة من المستعمرات من لوحة التحويل مع مسواك العقيمة أو قضيب والانتصارات عبر الجانب الأطول لرباعي.
   2. متتالية للمستعمرات واحدة باستخدام أسلوب العقيم والسماح للمستعمرات أن ينمو بنسبة 30 درجة مئوية لمدة يومين.

5-مستعمرة [بكر]

1. تصميم الأمام الاختيار التمهيدي (FCP) ~ 200 قاعدة أزواج المنبع موقع التقييد الذي استحدث وعكس الاختيار التمهيدي (RCP) ~ 300 قاعدة أزواج المصب.
   1. إضافة ميكروليتر 0.3 من FCP، ميكروليتر 0.3 RCP، 0.3 ميكروليتر من الحرارة بوليميراز (1.5 اكستاق الوحدات)، 3 ميكروليتر من دنتبس (مجموع تركيز 40 مم)، 3 ميكروليتر من المخزن المؤقت اكستاق، وميكروليتر 23 ح₂س إلى أنبوب 1.5 مل.
      ملاحظة: إضافة 0.5 ميكروليتر/تفاعل ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) يمكن أن تحسن الكفاءة PCR.
   2. إضافة 0.25 ميكروليتر من مستعمرة الخميرة واحد من الخطوة 4.1.2 إلى الخليط من الخطوة 5.1.1، استخدام تلميح P10 ماصة، ومع الحرص على عدم تعكير في أجار.
   3. تضخيم الحمض النووي ببكر وتشغيل 5 ميكروليتر من بكر على جل لضمان التضخيم بنجاح، مع الحرص على عدم تعكير بيليه الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب.

6-تقييد الهضم من مستعمرة [بكر]

1. إضافة 10 ميكروليتر المنتج (مع الحرص على عدم عدم الإزعاج بيليه الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب) بكر، 3 ميكروليتر من المخزن المؤقت، 1 ميكروليتر من إنزيم التقييد وميكروليتر 16 ح₂س، ثم احتضان وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وحل على [اغروس] هلام لتحديد corre أظهر الجينوم ct.
   ملاحظة: إنزيم التقييد المستخدم هنا هو موقع المشفرة في قالب محدد إصلاح TPK2 .

7-حفظ سلالات

1. تنمو ثقافة بين عشية وضحاها من المستعمرات التي تم تأكيدها بالهضم التقييد في YPD + أوري في 30 درجة مئوية.
2. أضف 1 مل من الثقافة و 1 مل من والغليسيرول 50% (جلب تركيز والغليسيرول النهائي إلى 25 ٪) إلى أنبوب مناسب للتخزين في-80 درجة مئوية.
3. تخزين النسخ الصحيحة في-80 درجة مئوية.
   ملاحظة: ويمكن تخزين سلالات الصحيح في-80 درجة مئوية لسنوات عديدة.

8-إزالة علامة نات^ص

1. ترانسفورمانت الانتصارات الصحيح على الخميرة ببتون مالتوس (يبمالتوسي) (مالتوس 2%).
2. اختيار مستعمرة من لوحة ستريكيد والثقافة الخميرة ح 48 في 30 درجة مئوية في مالتوس 20 غرام/لتر يبمالتوسي السائلة.
3. لوحة 200 – 400 الخلايا على يبمالتوسي 20 غرام/لتر مالتوس، واحتضان عند 30 درجة مئوية ح 24.
4. تكرار اللوحة على يبمالتوسي ويبمالتوسي 200 ميكروغرام/مل nat.
5. احتضان عند 30 درجة مئوية ح 24.
   ملاحظة: المستعمرات التي لم تعد تنمو على يبمالتوسي 200 ميكروغرام/مل نورسيوثريسين ولكن ينمو في يبمالتوسي قد فقدت علامة^r نات (CaCAS9) ودليل الحمض النووي الريبي.
6. حفظ السلالات التي فقدت نات^ص علامة (CaCAS9) ، ودليل الجيش الملكي النيبالي كما فعلت في خطوات 7.1 – 7.3.
   ملاحظة: ويستخدم بلازميد مماثلة، pV1393، SAP2 بدلاً مروج MAL2 . سوف تحفز النمو في يكب – جيش صرب البوسنة فليباسي وإزالة نات^ص إذا تم استخدام pV1393 لتحرير الجينات.

النتائج

تسلسل من دليل الكشف وإصلاح القوالب التي تستهدف المبيضة TPK2، وحدة فرعية حفاز كيناز ج-أمبير، صممت وفقا للمبادئ التوجيهية المقترحة أعلاه. ويبين تسلسل (الجدول 1، الشكل 1). دليل الكشف المستنسخة في ناقلات التعبير CaCas9 وكوترانسفورميد مع إصلاح القالب في البرية من نوع المبيضة. موقع هضم تقييد الإيكولوجيةري وتعطيل الموقع بام stop codons في قالب إصلاح وتيسير الكشف عن طفرات الصحيح (الشكل 1). كانت السنة اللهب أثناء للمستعمرات واحد ترانسفورمانتس وفرزهم بمستعمرة الهضم بكر وتقييد لإدراج قالب إصلاح (الشكل 2). سرعان ما يميز الهضم تقييد البرية من نوع من تسلسل متحولة.

اسم اليغنوكليوتيد	تسلسل اليغنوكليوتيد
Primer_3 دليل إلى الأمام	أتتتجججتجاكتاتتجتكجككز
Primer_3 دليل عكسي	آآآكجكجاكااتاجتكاكككج
إصلاح القالب Forward_3	تكاجكاتاتكاجكاكاتتكاكاككجكاجكاكاكتتاتتاجاتكجكجا
إصلاح القالب Reverse_3	أتتتتجتككاجتتججكتجكاجكاججتجاكتاتتجتكجككجاتكتاأتااج
إلى الأمام الاختيار التمهيدي	تااجااكتكاكاتكاككاج
عكس الاختيار التمهيدي	أكتتجاتاجكاتاتاتكتاككات
الدليل التمهيدي للتسلسل	جكاتاجكتجااكتكجككك

الجدول 1: قائمة النيوكليوتيدات اليغو المستخدمة لهذه الدراسة. المواقع التي تمت إضافتها لأغراض الاستنساخ ترسمل والغامق في تسلسل الدليل التمهيدي. تسلسل في قالب إصلاح التي تتحول الحمض النووي ترسمل والغامق.

الشكل 1 : مخطط دليل الحمض النووي الريبي وإصلاح قالب تصميم. (أ) التالي جميع التسلسلات بام في النيوكليوتيدات 100 أولاً من TPK2. يتم تمييز التسلسل بام 3 (PAM_3)، كما أن التسلسل المستخدمة في هذه الدراسة. (ب) "دليل الحمض النووي الريبي" تصميم باستخدام PAM_3. 20 كبسولة تفجير قاعدة مصممة باستخدام سنابجيني بأحرف صغيرة والأزرق. القواعد الإضافية المطلوبة للاستنساخ الأحرف الكبيرة والخضراء تظهر الإزاحة. (ج) إصلاح كبسولة تفجير القالب أن إدراج كودون وقف ﻷعمالهم وموقع إيكوري تندس في TPK2 قراءة الإطار. الحمض النووي التي تختلف عن تسلسل البرية من نوع الأحمر والأحرف الكبيرة. (د) مثال على كيفية تصميم دليل على حبلا إيجابية من الحمض النووي باستخدام PAM_4. (ه) رسم تخطيطي من pV1524 بعد استنساخ دليل الحمض النووي الريبي والهضم مع كبني ومبادرة. Neut5L-5 'و Neut5L-3' استهداف متجهة إلى موقع Neut5L في الجينوم المبيضة . CaENO1p هو مروج الذي يدفع بالتعبير عن الخميرة الأمثل CaCas9. هو نات^ص كاسيت المقاومة نورسيوثريسين. CaSNR52p هو مروج القيادة دليل الحمض النووي الريبي التعبير (سجرنا). مواقع FRT المشقوق ومعاد من فليباسي (حزب العمل الفيجي) إزالة كاسيت كريسبر عند التعبير فليباسي. تخطيطي مماثلة إلى (ه) نشرته فياس وآخرون. ¹¹- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : مقدمة وتأكيد كودون التوقف وموقع تقييد الإيكولوجيةري إلى TPK2- وترد في الجدول 1الإشعال المستخدمة للتضخيم. فيما يلي تسلسل البرية من نوع ومتحولة الهلام. وقد تم تعديل هذا الرقم من فياس et al.¹¹. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : كارتون وصف إصلاح القوالب التي سوف تولد (أ) عمليات الحذف وعمليات الإدراج (ب)- رمادي شرطات في (أ) تصور تسلسل الفاصلة ليست موجودة في كبسولة تفجير قالب إصلاح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

المبيضة كريسبر أظهر كفاءة الجينوم المبيضة . pV1524 ترميز من خميرة كودون محسن Cas9، وهي مصممة بحيث يمكن بسهولة استنساخ المحققين تسلسل دليل الحمض النووي الريبي المصب المروج (الشكل 1) CaSNR52 ¹¹. يجب التأكد من أن نسخة واحدة فقط من سلسلة الدليل قد تم استنساخ في ناقلات التعبير CaCas9 بالتسلسل، كما نسخ إضافية سوف تعوق تحرير الجينوم. إذا كان يتم عرض عدة نسخ من الدليل دائماً، واحد ينبغي أن انخفاض تركيز الدليل الملدنة المستخدمة في ربط. ناقلات وبروتوكول وصف السماح باستهداف أي الجينات المبيضة . وبالرغم من المبيضة مثنوية، مطلوب تحويل واحد فقط لاستهداف كل الآليلات الجينات. وعلاوة على ذلك، تمكن طبيعة بروسيسيفي CaCas9 كريسبر الجينوم تحرير الباحثين لاستهداف أفراد الأسر الجينات متعددة. العديد من الأسر الجينات مثل أسبارتيل يفرزها البروتياز (برامج التكيف الهيكلي)، وتسلسل أجلوتينين مثل البروتينات (ALS) تعتبر هامة لضراوة المبيضة . تحرير كريسبر الجينوم سيسهل التحقيق هذه الأسر الجينات.

إدخال البروتوكولات المذكورة أعلاه كودون توقف إلى إطار قراءة مفتوحة، أسفر عن المظهرية ما يعادل قيمة خالية null (الشكل 2). يمكن أن تقدمها مجموعة متنوعة واسعة من التغييرات الوراثية متفاوتة إصلاح القالب. يمكن إدراج هراء ومغلطه الطفرات الصامتة عن طريق اقترانها مع قالب إصلاح مناسبة. يبسط إدماج الموقع قيد الفحص ترانسفورمانت، كتلك دون أن يكون صاحبها التسلسل^12،13. وبالإضافة إلى ذلك، تمكن كريسبر المبيضة الباحثين لتوليد عمليات الإدراج وعمليات الحذف، مما يجعل من نظام مثالي إدراج علامات تقارب وأداء بروموتور النهج القطاعية الشاملة، وتوليد بالضربة القاضية (الشكل 3). الكشف عن ترانسفورمانتس الصحيح لهذه الطفرات أكثر شاقة، كما أنه ضروري لتسلسل عمليات التحرير للتأكد من صحة إدراج قوالب إصلاح. وعلاوة على ذلك، قد تكون وصمة عار جنوب اللازمة لضمان عدم تم إدراج نسخ إضافية من الجين في مواقع إضافية في الجينوم. شرط الموقع بام نج يضع القيود طفيف على مناطق الجينوم التي يمكن استهدافها. تطوير نظم كريسبر البديلة التي تستخدم nucleases البديلة مثل Cpf1 أو الاختلافات في Cas9 نظام يكون/سيتم تخفيف كثير من هذه القيود¹⁴. للمعرفة المحققين في هذا الوقت، هذه النظم قد لا يتم تطبيقها بعد المبيضة.

تم تطوير نظام كريسبر الموصوفة في هذا البروتوكول أن يمكن تطبيقها في مجموعة متنوعة واسعة من الأنواع بما في ذلك كاستيلي نومووزيما Saccharomyces cerevisiaeومسببات الأمراض البشرية صناعي المبيضات¹¹ . التحول وتحرير هذه الخميرة فعالة يتطلب تغييرات طفيفة في بروتوكول وصف، ولكن الإطار اللازم لتحرير هذه الجينوم البديل اللافت للنظر مماثلة لتلك المذكورة المبيضة¹². وعلاوة على ذلك، توفر الخميرة إليه ممتازة لوضع الجينوم تحرير الإجراءات. في الخميرة، عندما يتم تحور ADE2 ، تمهيدا للمسار الحيوي الأدنين يتراكم، تحول الخلايا الحمراء. ويسمح هذا النمط الظاهري يمكن ملاحظتها بسهولة المحققين لتحديد الخلايا المحررة وإصلاحها بسرعة الجينوم تحرير البروتوكولات. جنبا إلى جنب مع الأدوات واسعة النطاق في مجال البيولوجيا الجزيئية المتاحة للفطريات، وبروتوكولات لتحرير العديد من أنواع الخميرة قد نمواً^15،16. وقد مثل هذا تطبيق واسع لتكنولوجيا الجينوم التحرير في الفطريات يمكن أن يؤثر تأثيراً كبيرا على طائفة واسعة من التخصصات العلمية.

كريسبر قد تحسن كثيرا من كفاءة هندسة الجينوم في المبيضة، ولكن لا تستخدم حتى الآن كريسبر لأداء شاشات عريضة الجينوم في المبيضة. البروتوكولات الحالية تتطلب إصلاح قالب لاستحداث الطفرات، كما في نهاية نونهومولوجوس الانضمام إلى مسار في المبيضة هو عدم كفاءة¹². يتم توليد إصلاح قالب أوليجوس لكل الجينات حاجزاً كبيرا أمام تنفيذ الشاشات على نطاق الجينوم. الالتقاء لانخفاض تكاليف تركيب الدنا والسلف إلى التكنولوجيات كريسبر سيجعل تطوير المكتبات الحذف أكثر جدوى. على سبيل المثال، التعبير عن قالب إصلاح موجه CaCas9 يمهد الطريق لتطوير المكتبات بلازميد المستدامة التي تستهدف كل الجينات¹¹. وعلاوة على ذلك، كانت المبيضات عابر كريسبر البروتوكولات التي لا تتطلب CaCas9 التعبير ناقلات تدمج في المجين المبيضة المتقدمة¹⁷. وباﻹضافة إلى ذلك، زيادة التعبير دليل الزيادات الجينوم تحرير الكفاءة¹⁸. هذه، وسلف أخرى للتكنولوجيات كريسبر، أمران ضروريان لتطوير الشاشات على نطاق الجينوم في المبيضة^19،20،،من²¹²².

أن الجينوم المبيضة مثنوية، ولكنه أ وب الآليلات ليست دائماً متطابقة⁵. ويوفر مثل هذه هيتيروزيجوسيتي كل من التحديات والفرص. إذا كان أحد يهدف إلى استهداف كل الآليلات، يجب استخدام الموقع بام والدليل تسلسل وإصلاح القالب الذي سيعمل في كلا نسخ من الجينات. ومع ذلك، تبعاً لمجمع الأشكال المتعددة النوكليوتيدات واحدة موجودة في جينات، النظام كريسبر C.albicans تمكن المحققين لاستهداف اليل واحد. وقد مثل هذه الدقة إمكانية السماح للمحققين دراسة الاختلافات الوظيفية بين الآليلات. استهداف الآليلات محددة ويجب أن يتم بعناية، كما لوحظ فقدان هيتيروزيجوسيتي (لوه) في اليل أو كروموسوم كامل. عند تحرير واحد المبيضة الآليلات، واحد يجب أن تدرس المتاخمة تسلسل الحمض النووي لتحديد إذا كان استنساخ حافظت الشخصية SNP مثنوية. وبالإضافة إلى ذلك، آثار خارج الهدف منخفضة جداً كريسبر المبيضة ، ولكن يمكن اعتبار تسلسل الجينوم الكامل لسلالات رئيسية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar	BD Bacto	214010
agarose	amresco	0710-500G
Ampicillan	Sigma-Aldrich	A9518
Bacto Peptone	BD Bacto	211677
Bsmb1	New England Biolabs	R0580L
Calf intestinal phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290L
Cut Smart Buffer	New England Biolabs	B7204S
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
dNTPs	New England Biolabs	N0447L
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	2810000ACS
Glucose	BDH VWR analytical	BDH9230
Glycerol	Sigma-Aldrich	49767
Kpn1	New England Biolabs	R3142L
LB-Medium	MP	3002-032
Lithium Acetate	Sigma-Aldrich	517992
L-Tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254
Maltose	Sigma-Aldrich	M5885
Molecular Biology Water	Sigma-Aldrich	W4502
NEB3.1 Buffer	New England Biolabs	B7203S
Nourseothricin	Werner Bioagents	74667
Poly(ethylene glycol) PEG 3350	Sigma-Aldrich	P4338
Sac1	New England Biolabs	R3156L
Salmon Sperm DNA	Invitrogen	AM9680
T4 Polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L
Taq polymerase	New England Biolabs	M0267X
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
uridine	Sigma-Aldrich	U3750
Yeast Extract	BD Bacto	212750
Equipment
Electrophoresis Appartus
Incubator
Microcentifuge
PCR machine
Replica Plating Apparatus
Rollerdrum or shaker
Spectrophotometer
Waterbath