JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لوصف الجسيمات نوكليوسومي على مستوى جزيء مفرد باستخدام مجهر القوة الذرية ثابتة والوقت الفاصل بين (فؤاد) تقنيات التصوير. يسمح أسلوب الروغان السطحية ووصف للقبض على بنية وديناميات nucleosomes في الاستبانة في النانو.

Abstract

الكروماتين، وسلسلة طويلة من مفارز nucleosome، هو نظام ديناميكي الذي يسمح لمثل هذه العمليات الحرجة كتكرار الحمض النووي، والنسخ أخذ مكان في الخلايا حقيقية النواة. ديناميات nucleosomes يوفر الوصول إلى الحمض النووي بالأجهزة النسخ المتماثل، والنسخ، والأهمية يسهم في الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظائف الكروماتين. دراسات جزيء واحد مثل مجهر القوة الذرية (AFM) التصوير ساهمت إلى حد كبير فهمنا الحالي لدور هيكل نوكليوسومي والديناميات. البروتوكول الحالي يصف الخطوات التي تمكن تقنيات التصوير فؤاد عالي الاستبانة لدراسة الخصائص الهيكلية وديناميكية من nucleosomes. ويتجلى في البروتوكول فؤاد البيانات التي تم الحصول عليها ل nucleosomes السنترومير الذي يتم استبداله هيستون H3 نظيره السنترومير البروتين (سينب-أ). يبدأ البروتوكول مع جمعية مونو-نوكليوسوميس باستخدام أسلوب تمييع مستمر. إعداد الركيزة ميكا فونكتيوناليزيد مع سيلاتراني أمينوبروبيل (وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا) الذي يتم استخدامه للتصوير نوكليوسومي أمر حاسم للتصور فؤاد من نوكليوسوميس الموصوفة ويرد الإجراء الذي يعد الركيزة. يتم تصويرها nucleosomes المودعة على سطح APS-ميكا أولاً استخدام فؤاد ثابت، الذي يلتقط لقطة للسكان نوكليوسومي. من تحليل هذه الصور، يمكن أن تقاس هذه المعلمات كحجم الحمض النووي الملتفة حول نوكليوسوميس وهو أيضا تفاصيل هذه العملية. يتم وصف فؤاد الوقت الفاصل بين التصوير الداخلي في السائل لفؤاد الوقت الفاصل بين السرعة التي يمكن التقاط عدة إطارات لديناميات نوكليوسومي في الثانية الواحدة. وأخيراً، تحليل ديناميات nucleosome تمكن الوصف الكمي للعمليات الدينامية الموصوفة والمصور.

Introduction

في الخلايا حقيقية النواة، والحمض النووي مكثف للغاية ومنظم في الكروموسومات. 1 هو المستوى الأول للمنظمة الحمض النووي داخل كروموسوم جمعية نوكليوسوميس في أي 147 شركة بريتيش بتروليوم للحمض النووي هو محكم ملفوفة حول نواة أوكتامير هيستون. 2 , 3 تجميع جزيئات نوكليوسومي في جزيء الحمض النووي طويلة تشكيل مجموعة الكروماتين ثم تنظيمها حتى يتم تشكيل وحدة كروموسوم ضغط عالية. 4 تفكيك الكروماتين وصولاً إلى مجاناً الحمض النووي تتطلبها العمليات الخلوية الحرجة مثل النسخ المتماثل النسخ والجينوم الجينات، مما يوحي بأن الكروماتين نظام شديد حيوية. 5 , 6 , 7 فهم الخصائص الدينامية للحمض النووي الكروماتين على مختلف المستويات من الأهمية بمكان لتوضيح العمليات الوراثية على المستوى الجزيئي حيث الأخطاء يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا أو تطور الأمراض مثل السرطان. 8 خاصية الكروماتين أهمية كبيرة هي ديناميات نوكليوسوميس. 9 , 10 , 11 , 12 الثبات العالي لهذه الجسيمات أتاح لتوصيف الهيكلية بتقنيات بلورية. 2 ما هي الافتقار إلى دراسات هذه هي تفاصيل ديناميكية nucleosomes مثل إليه الحمض النووي إزالة التغليف من صميم هيستون؛ المسار الحيوي الذي مطلوب لعمليات النسخ والنسخ المتماثل. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 وعلاوة على ذلك، خاصة البروتينات ووصف العوامل يعيد أظهرت تيسيرا لتفكيك17من الجسيمات نوكليوسومال؛ غير الجوهرية ديناميات nucleosomes عاملاً حاسما في هذه العملية التي من شأنها أن تساهم في عملية التفكيك الكامل. 14 , 16 , 18 , 19

تقنيات جزيء واحد مثل الأسفار جزيء واحد19،،من2021والبصرية الملائمة (الملقط)13،،من1822،23 وفؤاد 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 كان لها دور أساسي في فهم ديناميات نوكليوسوميس. من بين هذه الأساليب، وفؤاد يستفيد من العديد من ميزات فريدة وجذابة. فؤاد يسمح أحد لتصور وتميز nucleosomes الفردية فضلا عن صفائف أطول27. من صور فؤاد، الخصائص الهامة لهيكل nucleosome مثل طول الحمض النووي ملفوفة حول نواة هيستون يمكن أن يقاس 10،14،،من2628؛ معلمة أساسي لوصف ديناميات إزالة التغليف نوكليوسومي. وأظهرت الدراسات الماضي فؤاد نوكليوسوميس أن تكون نظم ديناميكية للغاية، وأن الحمض النووي يمكن بسط عفويا من هستون الأساسية14. إزالة التغليف عفوية من الحمض النووي من nucleosomes كان تصور مباشرة من فؤاد التشغيل في وضع الوقت الفاصل بين عندما يتم التصوير في المحاليل 14،،من2629.

ظهور الأجهزة فؤاد (HS-فؤاد) الوقت الفاصل بين عالية السرعة جعلت من الممكن تصور عملية إزالة التغليف nucleosome في15،،مقياس الوقت 14مللي ثانية24. وكشفت الدراسات30 16،HS-فؤاد مؤخرا من nucleosomes السنترومير محددة عن العديد من الميزات الجديدة من nucleosomes مقارنة مع نوع متعارف عليه. وتشكل nucleosomes السنترومير من السنترومير، جزء صغير من الكروموسوم ذات أهمية حاسمة كروموسوم الفصل31. على عكس المتعارف عليه نوكليوسوميس في معظم الكروماتين، يتضمن جوهر nucleosomes السنترومير هيستون هيستون سينب-أ بدلاً من هستون H332،33. ونتيجة لهذا الاستبدال هستون، هو التفاف الدنا في nucleosomes السنترومير ~ 120 بي بي بدلاً من ~ 147 bp ل nucleosomes المتعارف عليه؛ فرق يمكن أن تؤدي إلى مورفولوجيس متميزة من السنترومير و nucleosomes الكنسي صفائف34، مما يوحي بأن الكروماتين السنترومير يخضع ديناميات أعلى بالمقارنة مع معظم أحد. ديناميات الرواية المعروضة بواسطة nucleosomes السنترومير في الدراسات30 16،HS-فؤاد مثالاً فرصة فريدة تقدمها هذه التقنية جزيء واحد لتصور الخصائص الهيكلية والديناميكية لمباشرة نوكليوسوميس. ستناقش أمثلة من هذه الميزات بإيجاز ويتضح في نهاية الورقة. هذا التقدم بسبب وضع بروتوكولات جديدة لتصوير فؤاد من nucleosomes، فضلا عن التعديلات المدخلة على الأساليب القائمة. وهدف البروتوكول هو موضح هنا هو جعل هذه التطورات المثيرة في جزيء واحد فؤاد nucleosome الدراسات متاحة لأي شخص الذين يرغبون في الاستفادة من هذه التقنيات في تحقيقاتهم الكروماتين. العديد من التقنيات الموضحة قابلة للتطبيق لمشاكل ما بعد دراسة نوكليوسوميس، ويمكن استخدامها لإجراء تحقيقات أخرى البروتين ونظم الحمض النووي للفائدة. ويمكن الاطلاع على أمثلة لمثل هذه التطبيقات في المنشورات35،36،37،،من3839،،من4041، 42،43،44،45،،من4647،،من4849 وآفاق الدراسات فؤاد يتم إعطاء النظم الجزيئية البيولوجية المختلفة في استعراضات29،،من5051،،من5354.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. الجمعية تمييع المستمر من nucleosomes مونو

  1. توليد وتنقية bp حوالي 400 الركازة الحمض النووي الذي يحتوي على نوكليوسومي 601 اضعيه قبالة محورها التسلسل لتحديد المواقع. 55
    ملاحظة: للحد من تشكيل دي-نوكليوسوميس غير المرغوب فيها، كل 'الذراع' المرافقة تسلسل المواقع لا ينبغي أن تتجاوز ~ 150 شركة بريتيش بتروليوم.
    1. استخدام بلازميد pGEM3Z-601 جنبا إلى جنب مع كبسولة تفجير تصميم وتضخيم الحمض النووي الركيزة باستخدام PCR. للركيزة bp 423 مع أطوال الذراع 122 و 154 bp المستخدمة هنا، استخدم قدما (5 '-كاجتجاتجتاتاكجاكتك-3')، وعكس (5 '-أكاجكتاتجاككاتجاتاك-3') كبسولة تفجير.
    2. إضافة أنابيب تحتوي على خليط رد فعل cycler حرارية يسخن إلى 95 درجة مئوية. تشغيل البرنامج التالي للدورات 33 بعد تمسخ أولى لمدة 5 دقائق في 95 ° c: 30 s تمسخ 95 درجة مئوية، 30 s الصلب في 49 درجة مئوية، 35 s ملحق عند 72 درجة مئوية. تعيين ملحق نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة بعد دورتي 33.
    3. تنقية الحمض النووي من مزيج PCR باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR المتاحة تجارياً. عندما التينج الحمض النووي من العمود تنظيف بكر، استخدام المخزن المؤقت تريس 10 مم (درجة الحموضة 7.5) بدلاً من عدة قدمت شطف المخزن المؤقت.
      ملاحظة: اتخاذ المزيد من الحيطة لا لنقل المخازن المؤقتة بين خطوات تنقية. الوينت ملوثة يمكن أن يسبب مشاكل المصب عند قياس تركيز الحمض النووي و/أو يمكن أن يغير انطلاق تركيز الملح المخلوط الجمعية نوكليوسومي.
  2. تحديد تركيز الحمض النووي عن طريق قياس امتصاص الحمض النووي المنقاة في 260 من شمال البحر الأبيض المتوسط.
    1. جمع فارغ على "جهاز المطياف الضوئي تجاه الأشعة فوق البنفسجية" باستخدام فقط 10 ملم تريس درجة الحموضة 7.5 شطف المخزن المؤقت. جمع مقياسا لتنقية الحمض النووي.
  3. مع التركيز تحديد، بمول 25 اليكووت لتنقية الحمض النووي في أنبوب [ميكروفوج] 0.6 مل ووضعه في أجهزة الطرد مركزي فراغ حتى أن الحل بالكاد مرئية؛ وهذا عادة إلى 1 ساعة و 30 دقيقة.
    ملاحظة: الركيزة الحمض النووي جاهز الآن للجمعية نوكليوسومي. خلاف ذلك، يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا والحمض النووي مخزنة في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على بمول 25 الحمض النووي على الجليد وإضافة مكونات الجمعية نوكليوسومي في الجدول 1، بالترتيب المحدد. عند إضافة كافة المكونات، إزالة الخليط من الجليد واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان أن محتوى الملح من المخزن المؤقت هيستون الأسهم يعتبر عند حساب كلوريد الصوديوم اللازمة لتحقيق تركيز نهائي 2 م. 15 , 56
  5. التجمع في نوكليوسوميس بتقليل تركيز 2 م الملح المخلوط إلى 200 ملم باستخدام إضعاف معدل مستمر. 57
    1. ملء المحاقن مع 100 ميليلتر لتمييع مخزن يحتوي على 10 ملم تريس pH 7.5 ووضعه على مضخة الحقن.
    2. مباشرة إبرة المحقن من خلال ثقب ثقب مسبقاً في الحد الأقصى من [ميكروفوج] أنابيب، ضمان الاتصال تتم مع الخليط الجمعية (الشكل 1).
    3. تشغيل المضخة حقنه بمعدل 0.75 ميليلتر/دقيقة لمدة 120 دقيقة.
      ملاحظة: الحل ميليلتر 100 الناتج يحتوي على 250 نوكليوسوميس شمال البحر الأبيض المتوسط و 200 ملم كلوريد الصوديوم.
    4. نقل الخليط إلى زر الغسيل الكلوي موكو 10 كيلو ودياليزي ضد 200 مل مبردة مسبقاً (4 درجات مئوية) منخفضة الملح المخزن المؤقت الذي يحتوي على 10 ملم تريس درجة الحموضة 7.5، يدتا 0.25 مم و 2.5 ملم كلوريد الصوديوم، للموارد البشرية 1 في 4 درجات مئوية.
  6. تقييم محتوى هستون الجمعية نوكليوسومي، تحضير هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة متقطع مع 15% فصل و 6% التراص كما هو موضح سابقا30.
    1. الكوة 10-20 ميليلتر من نوكليوسومي الأسهم إلى [ميكروفوج] أنابيب وإضافة 4 × لايملي عينة المخزن المؤقت إلى تركيز عامل العاشر 1-2. 58
    2. كعنصر تحكم، كرر هذا الإعداد في أنبوب منفصلة [ميكروفوج] 1-2 ميكروغرام المخزون هيستون. الحرارة في العينات من 95 درجة مئوية ل ~ 5 دقائق.
    3. تحميل العينات في الممرات المجاورة لبعضها البعض في الهلام. إضافة عينة المخزن المؤقت للممرات غير المستخدمة لتعزيز الفرقة حتى الهجرة.
    4. تشغيل الهلام على 65 الخامس حتى الجبهة صبغ ينتقل عن طريق التراص هلام. عندما يتم التوصل إلى جل الفاصل، تزيد على 150 الخامس وتشغيل حتى تم ترحيل الجبهة صبغ تماما من الجل.
    5. تفكيك وحدة التفريد ولطف نقل الهلام المصبوغة حاوية مليئة دد ح2o. السماح للهلام الجلوس لمدة 5 دقائق مع الانفعالات لطيف. كرر هذه العملية أكثر من مرتين مع الطازجة دد ح2س استخدامها في كل مرة.
      ملاحظة: لا تتطلب وصمة عار أخذ المستخدمة في هذا البروتوكول النموذجي تحديد الخطوات اللازمة لأخذ البقع (انظر الجدول للمواد). إذا كان يتم استخدام آخر أخذ إعداد، ضبط خطوات تحديد حسب الحاجة.
    6. إزالة الماء من الشطف النهائي، وإضافة وصمة عار ما يكفي لتغطية الهلام. السماح للهلام الجلوس مع الانفعالات لطيف ح 1 على الأقل.
      ملاحظة: لإثارة الشغب، يمكن وضع الحاوية المصبوغة على أي جهاز يعزز الحركة وصمة عار على الهلام مع الحفاظ أيضا هلام المشمولة في السائل.
    7. إزالة وصمة عار من الحاوية وشطف الجل مع استبدال O. دد ح2س دد ح2وامتصاص الجل لمدة 30 دقيقة مع الانفعالات لطيف. (الهلام ينبغي أن تظهر مثل هذا هو مبين في الشكل 2، مع فصل واضح للعصابات هيستون).
  7. تخزين نوكليوسوميس في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: عند تخزينها في هذه الظروف، nucleosomes تبقى مستقرة لعدة أشهر. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

2-الروغان سطح ميكا لتصوير فؤاد ثابت من نوكليوسوميس

  1. إعداد 50 مم 1-(3-Aminopropyl) سيلاتراني APS أسهم حلاً في المياه كما هو موضح. 1 مخزن 30 مل مختبرين هذا الحل في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: يمكن تخزين في مختبرين لأكثر من سنة في 4 درجات مئوية. 59
  2. تعد حلاً رافعة APS عامل للتعديل ميكا بإذابة 50 ميليلتر الأسهم الجزائرية 50 مم في 15 مل ح دد2o.
    ملاحظة: يمكن تخزين هذا الحل العمل في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام.
  3. قص شرائط 1 × 3 سم من ميكا من أوراق ميكا عالية الجودة (انظر الجدول للمواد المستخدمة هنا ميكا).
    1. تحقق من أن يناسب القطعة عندما وضعت قطرياً في ومبومو. استخدام تلميح الملقط حادة أو شفرة حلاقة أو اﻻسكتلندي، تنشق طبقات من ميكا حتى كلا الجانبين هي المشقوق طازجة والقطعة رقيقة مثل ~0.1 ملم (الشكل 3A). ضع قطعة ميكا إلى ومبومو APS شغلها على الفور واحتضان لمدة 30 دقيقة (الشكل 3B).
  4. نقل قطعة ميكا ومبومو مليئة دد ح2س ونقع لمدة 30 ثانية (الشكل 3). جاف تماما كلا الجانبين قطاع APS-ميكا بموجب نظام تدفق أرجون.
    ملاحظة: السليلوز غير المنسوجة، وتنظيم البوليستر مسح (مسح الموصى بها بالتفصيل في المواد) يمكن للمعونة في فتل المياه من حافة الميكا عند التجفيف.
  5. استخدام قطاع ميكا الجافة الآن لإعداد نموذج. وبخلاف ذلك، تخزين القطعة في ومبومو نظيفة وجافة (3D الشكل).
    ملاحظة: ينصح بتخزين إضافية في فراغ ح 1-2 عندما تكون البيئة الرطبة. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

3-إعداد العينات نوكليوسومي في وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا لتصوير فؤاد ثابت

  1. تطبيق شريط لاصق الوجهين لعدة كرات الصولجان المغناطيسية ووضعها إلى الجانب.
  2. قص الركيزة APS-ميكا إلى الحجم المطلوب (1 × 1 سم مربعات للصك فؤاد ملم المستخدمة هنا). ضع هذه القطع في طبق بتري نظيفة وتبقى مغطاة.
  3. إعداد تخفيف ثلاثة من nucleosomes المجمعة (تركيزات نوكليوسومي النهائية من 0.5، 1.0 و 2.0 شمال البحر الأبيض المتوسط) استخدام مكم 0.22 المصفاة العازلة التي تحتوي على 10 ملم حبيس الرقم الهيدروجيني 7.5 و 4 مم مجكل2.
    ملاحظة: للحد من الخسائر في نوكليوسوميس بتركيز نهائي منخفضة، تخفيف وينبغي أن يتم واحدة في كل مرة، مباشرة قبل ترسب في وكالة الأنباء الجزائرية-الميكا.
  4. إيداع 5-10 ميليلتر من العينة المخففة نوكليوسومي في وسط قطعة APS-ميكا، والسماح لاحتضانها لمدة دقيقتين. بلطف شطف العينة مع 2-3 مل من دد ح2س إزالة كافة مكونات المخزن المؤقت. بعد كل مل ~0.5 دد ح2س المستخدمة، بلطف يهز ميكا لإزالة ماء الشطف الزائد.
    ملاحظة: يوصي بحقنه المتاح لهذه الخطوة الشطف.
  5. الجاف للعينة المودعة تحت ضوء تدفق غاز الأرجون نظيفة.
    ملاحظة: النموذج جاهز الآن ليتم أخذ صورة عنه أو يمكن تخزينها في فراغ مجلس الوزراء أو مجففة مليئة الأرجون. وقد تم تصويرها عينات إعدادها وتخزينها كما هو موضح سنة واحدة بعد إعداد مع عدم فقدان جودة. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

4. تصوير فؤاد ثابت من نوكليوسوميس

  1. جبل نصيحة فؤاد على حامل تلميح. استخدام تلميح له ثابت ربيع ~ 40 ن/م وتردد صدى بين 300 و 340 كيلو هرتز (انظر الجدول للمواد التي كانتيليفيرس المستخدمة هنا).
  2. تحميل نموذج إعداد في المقطع 3 في مرحلة فؤاد مع الحرص على عدم الاتصال بسطح العينة.
  3. ضع الليزر ناتئ حتى يصل المجموع الحد الأقصى وضبط قيم الانحراف الرأسي والأفقي القرب من الصفر.
  4. لحن فؤاد التحقيق للعثور على تردد صدى وضبط سعة محرك الأقراص وتعيين حجم الصورة إلى 100 × 100 نانومتر. انقر فوق الزر المشاركة للبدء في هذا النهج.
  5. بمجرد اقتراب تدريجيا تحسين Setpoint السعة حتى ينظر على سطح العينة بشكل واضح. زيادة حجم المسح الضوئي إلى 1 x 1 ميكرومتر والقرار إلى 512 × 512 بكسل. انقر فوق الزر التقاط متبوعاً بزر الدخول لبدء الحصول على الصور.
    ملاحظة: الصور في الشكل 4 إظهار الخلفية السلسة التي يمكن توقعها عند تصوير هذه العينات.
  6. لتحليل العينة نوكليوسومي، فتح الصور التي تم التقاطها باستخدام برمجيات تحليل الصكوك فؤاد.
    1. تسطيح الصورة باستخدام خط متعدد الحدود الطرح أو ميزة مشابهة.
    2. تعيين جدول الألوان تعكس أدنى قيمة للحد الأدنى وأعلى قيمة للحد الأقصى. الاحتفاظ بسجل لهذه القيم لكل صورة كما أنها ستكون ضرورية في خطوة لاحقة.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام هذه القيم، بيانات الارتفاع غير صحيحة في تحليل لاحق كما سوف تظهر المقاطع العرضية للنوى nucleosome كهضاب ارتفاع متساو، بدلاً من أن تكون متفاوتة.
    3. تصدير الصورة كصورة.tiff بالحجم الأصلي. إلغاء تحديد أية خيارات لحفظ الصورة مع بارات الحدود أو مقياس.
    4. فتح الصورة في تحليل البرامج القادرة على قياس طول كفاف.
    5. تعيين x و y و z جداول لمطابقة الصورة.
    6. معايرة طول داخلية، قياس وتسجيل طول كفاف الحمض الحر واحدة من نهاية إلى أخرى. لهذا العامل المعايرة، استخدام القياسات لإنشاء مدرج تكراري وأنها تناسب مع توزيع عادي (ضبابي). تقسيم مركز الذروة (سج) بطول الركيزة في زوج قاعدي.
      ملاحظة: هذه القيمة هو معامل تحويل الصور المحددة من نانومتر لأزواج قاعدة الحمض النووي.
    7. قياس وتسجيل كفاف طول ذراعيه لكل نوكليوسومي من نهاية الذراع مجاناً إلى مركز الأساسية، لاتساق (الشكل 5A).
    8. لكل نواة نوكليوسومي، جمع اثنين من كامل العرض في نصف الحد الأقصى للقيم (فوم) من زوج عمودي الأساسية قياسات المقطع العرضي (الشكل 5B متوسط القياسات فوم اثنين وطرح نصف القيمة الناتجة من كل ذراع نوكليوسومي إلى الصحيح لطول يقاس من الدخول/الخروج الحمض النووي للمركز الأساسية التي ليست جزءا من طول الذراع.
    9. تقسيم كل الأغيار بمعامل المعايرة المحسوبة (الخطوة 4.5.6) للحصول على أطوال الذراع في أزواج قاعدة الحمض النووي.
    10. حساب مدى الالتفاف بطرح مجموع الذراع نوكليوسومي من طول إجمالي قاعدة زوج من الركازة ملفوف الحمض النووي. ارسم هذه القيم كالرسم بياني وتناسب peak(s) مع توزيع عادي (ضبابي) للحصول على أزواج قاعدة يعني ملتف من الحمض النووي للسكان نوكليوسومي.
    11. حساب ارتفاع متوسط نوكليوسومي من المقاطع العرضية المقاسة. ارسم هذا كالرسم بياني وتناسب peak(s) بتوزيع (ضبابي) عادي للحصول على ارتفاع السكان نوكليوسومي.

5-تصوير فؤاد الوقت الفاصل بين الديناميات نوكليوسومي

  1. جبل نصيحة فؤاد على حامل تلميح. يمكن استخدام إجراء تحقيق مع ثابت ربيع من حوالي 0.1 N/m، وتردد صدى من 7-10 كيلو هرتز (انظر قائمة المواد كانتيليفيرس المستخدمة هنا).
  2. إرفاق قطعة 1 × 1 سم من وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا عفريت مغناطيسي باستخدام شريط مزدوج-عصا وجبل عفريت على الصك فؤاد.
  3. تمييع nucleosomes إلى تركيز 1 نانومتر في مخزن تصوير التي تمت تصفيتها 0.22 ميكرومتر التي تحتوي على 10 ملم حبيس الرقم الهيدروجيني 7.5 و 4 مم مجكل2.
  4. إيداع 5-10 ميليلتر من nucleosome المخفف في وسط قطعة ميكا للحد الأدنى 2 شطف العينة المودعة مع 20µL المخزن المؤقت التصوير مرتين. بعد الشطف الثانية، تبقى معالجة تجميعية للتصوير على السطح المخزن المؤقت.
  5. استخدام الكاميرا عرض أعلى للعثور على تلميح والنهج إلى السطح يدوياً حتى يتم التلميح ~ 100-500 ميكرون من على سطح الأرض.
  6. إضافة المخزن المؤقت التصوير الإضافي لسد الفجوة بين الطرف والسطح. في هذا المثال، ما يقرب من 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للتصوير يكفي لسد هذه الفجوة. تجد ذروتها صدى لهذه المعلومة.
  7. يبدأ نهج الكمبيوتر التي تسيطر عليها إلى السطح. عندما اقترب، يبدأ التصوير مع منطقة ميكرومتر 1-2 لتحديد منطقة شمال البحر الأبيض المتوسط ~ 500 من الفائدة. مع هذه المنطقة من الفائدة المحددة، قم بضبط كثافة اقتناء البيانات إلى 512 × 512 بكسل.
  8. ضبط الجهد تعيين نقطة ومحرك سعة المعلمات لتحسين جودة الصورة. سعة مجاناً من 10 نيوتن متر أو أقل ومعدل المسح الضوئي ~ 2 هرتز يمكن استخدامها لالتقاط صور ذات جودة. ويرد مثال على ديناميات nucleosome القبض على استخدام الوقت الفاصل بين فؤاد في الشكل 6.

6-تصوير فؤاد الوقت الفاصل بين عالية السرعة لديناميات Nucleosome

ملاحظة: يتم توفير بروتوكول أدناه للصك HS-فؤاد الذي وضعه فريق إندو (جامعة كانازاوا، كانازاوا، اليابان). 60

  1. تعد وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا لتصوير السائل.
    1. إرفاق قضيب الزجاج إلى مرحلة الماسح الضوئي فؤاد استخدام قضيب الزجاج-الغراء الماسح الضوئي (انظر الجدول للمواد). واسمحوا هذا الجاف للحد أدنى من 10 دقيقة.
    2. جعل ~0.1 مم قطعة دائرية سميكة من ميكا يبلغ قطرها 1.5 مم باللكم لهم من ورقة ميكا أكبر. استخدام الغراء قضيب الزجاج والميكا HS-فؤاد (انظر الجدول للمواد) لإرفاق هذه القطعة ميكا بقضيب الزجاج على النظام المنسق-فؤاد والجاف، لم يمسها لمدة 10 دقائق على الأقل. تنشق الطبقات باستخدام شريط حساسة للضغط حتى ينظر إلى طبقة جيدا ملصوق على الشريط.
    3. تمييع 1 ميليلتر 50 مم APS المخزون في ميليلتر 99 دد ح2س جعل حل APS 500 ميكرومتر. إيداع 2.5 ميليلتر لهذا الحل على سطح ميكا ملصوق طازجة والسماح فونكتيوناليزي لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: لمنع جفاف السطح بينما فونكتيوناليزينج، الحد الأقصى من أنبوب الطرد المركزي المخروطية 50 مل يمكن تتناسب مع قطعة رطبة من الورق تصفية ووضعها فوق الماسح الضوئي. هو إضعاف الأسهم الجزائرية 3 مرات أقل لتصوير السائلة من أجل التصوير ثابتة لمراقبة ديناميات إلى معدل التي يمكن ملاحظتها مع فؤاد.
    4. شطف الميكا مع 20 ميليلتر من س دد ح2عن طريق تطبيق عدة يشطف ميليلتر ~ 3. إزالة الماء تماما بعد كل شطف بوضع مسح غير منسوجة على حافة الميكا. بعد الشطف النهائي، ضع ميليلتر ~ 3 س دد ح2على السطح والسماح لها الجلوس لمدة 5 دقائق لإزالة أي وكالة الأنباء الجزائرية ملزمة نونسبيسيفيكالي.
  2. وضع المسبار في حامل HS-فؤاد وموقف الحائز على المسرح فؤاد مع تلميح مواجهة. شطف صاحب استخدام ~ 100 ميليلتر من دد ح2س تليها يشطف اثنين ~ 100 ميليلتر من 0.22 ميكرومتر تصفية nucleosomes التصوير المخزن المؤقت الذي يحتوي على 10 مم هيبيس درجة الحموضة 7.5 و 4 مم مجكل2.
  3. مع يشطف به، ملء الدائرة مع ~ 100 ميليلتر من nucleosome التصوير المخزن المؤقت، وغمر التلميح. ضبط الموضع ناتئ حتى أنها ضربت بالليزر. شطف APS الميكا مع 20 ميليلتر من المصفاة nucleosome التصوير المخزن المؤقت، واستخدام ميليلتر ~ 4 الواحدة والشطف.
  4. تمييع 1 ميليلتر من رصيد الجمعية نوكليوسومي إلى 250 ميليلتر من المصفاة nucleosome التصوير المخزن المؤقت لتركيز نوكليوسومي نهائية من 1 نانومتر. إيداع ميليلتر 2.5 من هذا التخفيف على السطح، والسماح لها الجلوس للحد الأدنى 2 شطف السطح مع ~ 4 ميليلتر من nucleosome التصوير المخزن المؤقت مرتين. وبعد الشطف النهائي، ترك السطح المشمولة في التصوير المخزن المؤقت.
    ملاحظة: إذا لم يتم تشطف السطح بعد إيداع عينة nucleosome، السطح سوف سرعة تصبح مكتظة.
  5. تعيين الماسح الضوئي وعينه على رأس صاحب نصيحة حيث أن العينة هو الوجه لأسفل. للبدء النهج، استخدم الدالة السيارات-النهج مع سعة تعيين نقطة،s قريبة من السعة بالتذبذب الحر0.
    ملاحظة: من الناحية المثالية،s = 0.950، ومع ذلك، تعمل نسبة 82 في المائة من0 ستعمل كذلك إذا كان حذراً.
  6. ضبط النقطة المحددة حتى يتم تعقب السطح جيدا.
    ملاحظة: لتقليل نقل الطاقة من طرف فؤاد إلى عينة nucleosome، السعة ناتئ ينبغي أن تظل صغيرة، مع الاتساع منخفضة 1 نانومتر الأمثل.
  7. تعيين مساحة الصورة حوالي 150 × 150 نانومتر إلى 200 × 200 نانومتر مع معدل اقتناء البيانات ms ~ 300 كل التصوير الإطار.
    ملاحظة: هذا حجم الصورة عادة كافية لالتقاط ديناميات nucleosomes عدة في أن واحد. سطح الأقل سكانا قد تستدعي إدخال تغييرات على هذه المعلمات. معدل الإطار المقترح كافية لالتقاط ديناميات nucleosome مثل انزلاق حلقات، وإزالة التغليف، بين أمور أخرى (انظر نتائج ممثل الفرع أدناه).

7-تحليل ديناميات Nucleosome القبض على استخدام الوقت الفاصل بين فؤاد

  1. تحويل الصور من نوع البيانات فؤاد HS (.asd) للصور.tiff.
    1. تسطيح الصور باستخدام برمجيات تحليل النظام فؤاد استخدام وظائف الطائرة أو الخط حتى الخلفية على النقيض موحدة.
    2. ضبط تباين الصورة (مقياس اللون) إلى تلقائي.
      ملاحظة: التباين يمكن تعديلها يدوياً لأغراض العرض ولكن ليس من أجل التحليل. يؤدي هذا الارتفاع من التفصيل تضيع في الصور المحولة.
    3. حفظ مجموعة مختارة من الصور كملف موف. قم بإلغاء تحديد شريط مقياس والحدود خيارات قبل الحفظ.
      ملاحظات: لا تحليل الصور التي تحتوي على أشرطة الجدول في الإطار. هذه تغيير حجم الصورة، وسيؤدي إلى قياسات خاطئة.
    4. تحويل ملف موف إلى صور tiff باستخدام برمجيات مناسبة (انظر الجدول للمواد). استخدام نفس معدل الإطار للتحويل كما تم استخدامه عند إنشاء ملف موف.
  2. لقياسات كفاف طول الذراع، فتح الصور في برنامج قياس قادرة على قياس هذا اكتب (انظر الجدول للمواد).
    1. تعيين أبعاد الصورة بحيث تتطابق مع تلك التي تم القبض على.
    2. قياس طول كل ذراع نوكليوسومي من نهاية الذراع إلى وسط كور nucleosome كفاف وتسجيل القياسات في جدول بيانات (الشكل 4 أ).
    3. قياس طول الركيزة الحمض النووي ملفوف في الإطارات بعد حيث نوكليوسومي. استخدم هذا لمعايرة محددة فيلم نسبة nm/bp الذي يستخدم nucleosome التفاف العمليات الحسابية
    4. جمع اثنين التشكيلات الجانبية للمقطع العرضي لنواة نوكليوسومي، واثنان للحمض النووي العارية (الشكل 4 باء).
    5. استيراد ملفات المقطع العرضي لبرامج جداول بيانات وتطبيع المؤامرات بطرح أقل قيمة z من جميع النقاط في التشكيل الجانبي.
    6. حساب الارتفاع والعرض الكامل في نصف الحد الأقصى (فوم) لكل مقطع عرضي ومتوسط القيم من اثنين التشكيلات الجانبية لكل إطار.
  3. طرح نصف قيمة فوم من كل من نوكليوسومي الأسلحة مؤامرة كمؤامرة مبعثر جنبا إلى جنب مع المجموع المحسوب للأسلحة.
    1. حساب متوسط طول كفاف من القياسات الحمض النووي التي أجريت على الحمض النووي في الإطارات بعد نوكليوسومي غير ملفوف.
    2. تحديد عامل المعايرة nm/bp بقسمة طول الحمض النووي مجاناً كفاف يعني بطول زوج قاعدي الركيزة الحمض النووي. استخدم هذه القيمة لحساب التفاف nucleosome في كل إطار، كما هو موضح في المقطع 5.12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تعد نوكليوسوميس مونو أولاً لفؤاد التصوير تجارب باستخدام أسلوب الجمعية تمييع مستمر (الشكل 1). تم فحص nucleosomes استعداد ثم استخدام متقطع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الشكل 2). وكان فونكتيوناليزيد على سطح ميكا التالية استخدام وكالة الأنباء الجزائرية، الذي يلتقط ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

مباشرة بدلاً من ذلك البروتوكول، المذكورة أعلاه وتقديم النتائج استنساخه بدرجة عالية، على الرغم من أن يمكن التركيز على عدد قليل من القضايا الهامة. وكالة الأنباء الجزائرية-ميكا فونكتيوناليزيد ركيزة رئيسية للحصول على نتائج موثوقة واستنساخه. استقرار عالية لوكالة الأنباء الجزائرية-ميكا هي و?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

الكاتب الاشتراكات: سنوات العمر المفقودة و MSD تصميم المشروع؛ نوكليوسوميس MSD تجميعها. MSD وزينب صالح إجراء تحليلات فؤاد التجارب والبيانات. وكتب جميع المؤلفين وتحرير المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Plasmid pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MA26656
PCR PrimersIDT, Coralville, IACustom Order(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymeraseThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701Catalog number for 200 units
PCR purification kitQiagen, Hilden, Germany 28104Catalog number for 50 units
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001Catalog number for 250 g
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant humanEpiCypher, Durham, NC16-0010Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant humanEpiCypher, Durham, NC15-0311Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant humanEpiCypher, Durham, NC16-0001Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574Catalog number for 10 devices
Sodium ChlorideSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500GCatalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008Catalog number for 8 devices
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLCatalog number for 25 mL
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25GCatalog number for 25 g
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS) Bio-Rad, Hercules, CA1610700Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158Catalog number for 500 mL
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747Catalog number for 10 mL
2-MESigma-Aldrich, St. Louis, MOM6250-10MLCatalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA1610786Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Muscovite Block MicaAshevilleMica, Newport News, VAGrade-1
Aminopropyl silatrane (APS)Synthesized as described in 22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25GCatalog number for 25 g
Scotch TapeScotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging)Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA480Catalog number for 2 g tube
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100GCatalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µmSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP05010Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force MicroscopeBruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force MicrosocopyToshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178(2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. ophieE., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840(2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, https://www.nature.com/articles/ncomms13337 - supplementary-information 13337(2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. eetaJ., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103(2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960(1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Chromatin Protocols. Chellappan, S. P. , Springer New York. 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299(2011).
  29. Lyubchenko, Y. L. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. Lyubchenko, Y. L. , Springer. New York. 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8(2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7(2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. "Antiparallel" DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648(2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625(2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322(2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , Chapter 8 Unit 8.4 (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. Braga, P. C., Ricci, D. , Humana Press. 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , Foundation Fourmentin-Guilbert. 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354(2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 histones

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved