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  • Riepilogo
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  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per caratterizzare le particelle nucleosoma a livello di singola molecola tramite microscopia a forza atomica statico e time-lapse (AFM) tecniche di imaging. Il metodo di funzionalizzazione superficiale descritto consente per la cattura della struttura e dinamica dei nucleosomi in alta risoluzione nanometrica.

Abstract

Cromatina, che è una lunga catena di subunità nucleosoma, è un sistema dinamico che permette tali processi critici come replicazione del DNA e la trascrizione di prendere posto nelle cellule eucariotiche. La dinamica dei nucleosomi fornisce l'accesso al DNA di replicazione e trascrizione macchinari e criticamente contribuisce ai meccanismi molecolari sottostanti le funzioni della cromatina. Studi di singola molecola come microscopia a forza atomica (AFM) imaging hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione corrente del ruolo del nucleosoma struttura e dinamica. L'attuale protocollo viene descritta la procedura di attivazione di tecniche di imaging ad alta risoluzione AFM studiare le proprietà strutturali e dinamiche di nucleosomi. Il protocollo è illustrato dai dati AFM ottenuti per i nucleosomes centromero in cui istone H3 è sostituito con proteina di sua controparte centromero (CENP-A). Il protocollo inizia con l'Assemblea del mono-nucleosomi utilizzando un metodo di diluizione di continuo. La preparazione del substrato mica funzionalizzato con amminopropil silatrane (APS-mica) che viene utilizzato per l'imaging del nucleosoma è critica per la visualizzazione di AFM dei nucleosomi descritto e viene fornita la procedura per preparare il substrato. Nucleosomi depositati sulla superficie della APS-mica sono prima Imaging utilizzando statico AFM, che cattura un'istantanea della popolazione nucleosoma. Dall'analisi di queste immagini, parametri quali la dimensione del DNA avvolto intorno i nucleosomes possono essere misurate e questo processo è anche dettagliato. Il time-lapse AFM procedura nel liquido di imaging è descritto per l'alta velocità AFM time-lapse che può catturare diversi frame delle dinamiche nucleosoma al secondo. Infine, l'analisi delle dinamiche del nucleosoma consentendo la caratterizzazione quantitativa dei processi dinamici è descritta e illustrata.

Introduzione

Nelle cellule eucariotiche, il DNA è altamente condensata e organizzato in cromosomi. 1 il primo livello di organizzazione del DNA all'interno di un cromosoma è l'Assemblea di nucleosomi in cui 147 bp di DNA è strettamente avvolto intorno ad un nucleo istonico istone. 2 , 3 particelle nucleosome montare su una lunga molecola di DNA che formano una matrice di cromatina che viene organizzata fino a formare un'unità estremamente compatta del cromosoma. 4 il disassemblaggio della cromatina fornisce l'accesso per liberare il DNA richiesto dalla critici processi cellulari quali la replica di genoma e trascrizione genica, suggerendo che quella della cromatina è un sistema altamente dinamico. 5 , 6 , 7 comprendere le proprietà dinamiche del DNA a vari livelli di cromatina è criticamente importante per il delucidamento processi genetici a livello molecolare, dove gli errori possono portare alla morte delle cellule o lo sviluppo di malattie come il cancro. 8 una proprietà della cromatina di grande importanza è la dinamica dei nucleosomi. 9 , 10 , 11 , 12 l'alta stabilità di queste particelle ha permesso per la caratterizzazione strutturale mediante tecniche cristallografiche. 2 quali mancanza di questi studi sono unwrapping dal nucleo dell'istone; i dettagli dinamici di nucleosomi come il meccanismo del DNA il percorso dinamico di cui è necessario per i processi di trascrizione e replicazione. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 inoltre, speciali proteine chiamate fattori di rimodellamento sono stati indicati per facilitare lo smontaggio di particelle nucleosomal17; Tuttavia, la dinamica intrinseca dei nucleosomi è il fattore critico in questo processo che contribuisce al processo intero smontaggio. 14 , 16 , 18 , 19

Tecniche di singola molecola come singola molecola fluorescenza19,20,21, intrappolamento ottico (pinzette)13,18,22,23 e AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 sono stati strumentale nella comprensione delle dinamiche di nucleosomi. Tra questi metodi, AFM beneficia di diverse caratteristiche uniche e interessanti. AFM permette di visualizzare e caratterizzare singoli nucleosomi, nonché il più lungo di matrici27. Dalle immagini AFM, caratteristiche importanti della struttura del nucleosoma ad esempio la lunghezza del DNA avvolto intorno al nucleo dell'istone possono essere misurati 10,14,26,28; un parametro fondamentale per la caratterizzazione della dinamica unwrapping nucleosoma. Passato AFM studi hanno rivelato nucleosomi per essere sistemi altamente dinamici e che il DNA può spontaneamente unwrap dal nucleo dell'istone14. L'unwrapping spontanea del DNA da nucleosomi direttamente è stato visualizzato da AFM di funzionamento in modalità Time-lapse quando l'imaging avviene in soluzioni acquose 14,26,29.

L'avvento della strumentazione ad alta velocità Time-lapse AFM (HS-AFM) ha permesso di visualizzare il processo unwrapping nucleosoma al millisecondo scala tempo 14,15,24. Recenti studi di30 16,HS-AFM di nucleosomi specifico centromero ha rivelato parecchie caratteristiche romanzo dei nucleosomes rispetto al tipo canonico. Nucleosomi centromero si costituiscono di un centromero, una piccola parte del cromosoma criticamente importante per cromosoma segregazione31. A differenza dei nucleosomi canonici nella cromatina di massa, il nucleo dell'istone di nucleosomi centromero contiene istone CENP-A invece di istone H332,33. A seguito di questa sostituzione dell'istone, avvolgimento del DNA in nucleosomi centromero è ~ 120 bp invece la 147 ~ bp per canoniche nucleosomi; una differenza che può portare a diverse morfologie del centromero e canonici nucleosomi matrici34, suggerendo che cromatina centromero subisce dinamica superiore confrontato con la maggior parte uno. La dinamica romanzo visualizzata da nucleosomi centromero negli studi di30 16,HS-AFM esemplificano l'opportunità unica fornita da questa tecnica di singola molecola di visualizzare direttamente le proprietà strutturali e dinamiche di nucleosomi. Esempi di queste funzionalità saranno brevemente discusso e illustrati alla fine del libro. Questo progresso è stato effettuato a causa dello sviluppo di nuovi protocolli per formazione immagine AFM di nucleosomi, nonché le modifiche dei metodi esistenti. L'obiettivo del protocollo descritto qui è di rendere questi entusiasmanti progressi negli studi di singola molecola AFM nucleosoma accessibile a chiunque abbia voglia di utilizzare queste tecniche nelle loro indagini della cromatina. Molte delle tecniche descritte sono applicabili a problemi oltre lo studio dei nucleosomi e può essere utilizzati per indagini di altre proteine e DNA sistemi di interesse. Alcuni esempi di tali applicazioni possono essere trovati in pubblicazioni35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 e prospettive di AFM studi di vari sistemi biomolecolari sono date in recensioni29,50,51,53,54.

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Protocollo

1. continuo diluizione Assemblea del Mono-nucleosomi

  1. Generare e purificare un substrato di DNA bp circa 400 che contiene un decentrato Widom 601 nucleosoma sequenza di posizionamento. 55
    Nota: Per limitare la formazione indesiderata di-nucleosomi, ogni 'braccio' che fiancheggiano la sequenza di posizionamento non deve superare ~ 150 bp.
    1. Utilizzare il plasmide pGEM3Z-601 insieme con gli iniettori progettati e amplificare il DNA substrato usando la PCR. Per il substrato 423 bp con lunghezze di braccio di 122 e 154 bp usato qui, utilizzare avanti (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') e inversa (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') primer.
    2. Aggiungere le provette contenenti la miscela di reazione di un termociclatore preriscaldato a 95 ° C. Eseguire il seguente programma per 33 cicli dopo una denaturazione iniziale per 5 min a 95 ° c: 30 s denaturazione a 95 ° C, 30 s ricottura a 49 ° C, 35 estensione s a 72 ° C. Impostare un'estensione finale a 72 ° C per 10 min seguendo i cicli di 33.
    3. Purificare il DNA dalla miscela PCR utilizzando un Kit di purificazione di PCR commercialmente disponibile. Quando eluizione del DNA dalla colonna di pulizia PCR, utilizzare tampone Tris 10 mM (pH 7,5) al posto del kit fornito tampone di eluizione.
      Nota: Prestare particolare attenzione non al buffer di trasferimento tra le fasi di purificazione. Un eluente contaminata può causare problemi a valle quando misura la concentrazione di DNA e/o può alterare la concentrazione di sale partenza della miscela Assemblea nucleosoma.
  2. Determinare la concentrazione di DNA misurando l'assorbanza del DNA purificato a 260 nm.
    1. Raccogliere un vuoto su UV VIS spettrofotometro utilizzando solo il buffer di eluizione 7.5 per 10 mM Tris pH. Raccogliere una misurazione del DNA purificato.
  3. Con la concentrazione determinata, aliquota 25 pmol del DNA purificato in una provetta di microfuge 0,6 mL e posizionarlo in una centrifuga vuoto fino a quando la soluzione è a malapena visibile; si tratta in genere di 30 min a 1 h.
    Nota: Il substrato di DNA è ora pronto per l'assemblaggio del nucleosoma. In caso contrario, il protocollo può essere messo in pausa qui e il DNA conservato a-20 ° C fino all'utilizzo.
  4. Collocare la provetta microfuge contenente il 25 pmol DNA sul ghiaccio e aggiungere i componenti di assemblaggio del nucleosoma in tabella 1, nell'ordine indicato. Quando tutti i componenti sono stati aggiunti, togliere il composto dal ghiaccio e incubare a temperatura ambiente (TA) per 30 min.
    Nota: È fondamentale che il contenuto di sale del buffer stock istone è considerato quando il NaCl di calcolo necessari per ottenere la concentrazione finale di 2 M. 15 , 56
  5. Assemblare i nucleosomes riducendo la concentrazione di sale 2 M della miscela a 200 mM utilizzando una diluizione di tasso di continuo. 57
    1. Riempire una siringa con 100 µ l di tampone di diluizione contenente Tris 10 mM pH 7.5 e posizionarlo su una pompa a siringa.
    2. Diretto l'ago della siringa attraverso un foro pre-forato nel tappo del tubo microfuge, assicurando un contatto è fatto con la miscela di montaggio (Figura 1).
    3. Eseguire la pompa a siringa ad un tasso di 0,75 µ l/min per 120 min.
      Nota: La risultante 100 µ l di soluzione contiene 250 nucleosomi nM e 200 mM NaCl.
    4. Trasferire il composto in un pulsante di dialisi MWCO 10K e Dializzare contro 200 mL di un tampone salino basso di pre-freddo (4 ° C) contenente Tris 10 mM pH 7.5, EDTA di 0,25 mM e 2,5 mM NaCl, 1 ora a 4 ° C.
  6. Per valutare il contenuto di istone dell'Assemblea nucleosoma, preparare un gel di SDS-PAGE discontinuo con un 15% che separa e 6% accatastamento come descritto in precedenza30.
    1. Aliquotare 10-20 µ l del nucleosoma stock ad un tubo di microfuge e aggiungere 4 x Laemmli Buffer del campione ad una concentrazione di lavoro di 1-2 x. 58
    2. Come controllo, ripetere questa preparazione in un tubo separato microfuge per 1-2 µ g dello stock dell'istone. Riscaldare i campioni a 95 ° C per ~ 5 min.
    3. Caricare i campioni nelle corsie adiacenti uno a altro sul gel. Aggiungere tampone del campione per i vicoli non utilizzati per promuovere la migrazione anche band.
    4. Esegua il gel a 65 V fino a quando la parte anteriore del colorante si muove attraverso il gel d'impilamento. Quando viene raggiunto il gel di separazione, aumentare a 150 V ed eseguire fino a quando la parte anteriore della tintura ha varcato completamente il gel.
    5. Smontare l'unità di elettroforesi e delicatamente trasferisca il gel ad un colorazione contenitore riempito con dd H2O. Lasciate il gel riposare per 5 minuti con agitazione delicata. Ripetere questo processo due volte più con dd fresco H2O usato ogni volta.
      Nota: La macchia di Coomassie utilizzata nel presente protocollo non richiede i passaggi tipici di fissaggio necessari per le macchie di Coomassie (Vedi Tabella materiali). Se viene utilizzata un'altra preparazione di Coomassie, regolare le operazioni di fissaggio.
    6. Rimuovere l'acqua dal risciacquo finale e aggiungere appena sufficiente macchia per coprire il gel. Sieda il gel con movimentazione delicata per almeno 1 h.
      Nota: Per l'agitazione, il contenitore di colorazione può essere collocato su qualsiasi apparato che promuove il movimento della macchia sopra il gel, anche mantenendo il gel coperto in liquido.
    7. Rimuovere la macchia dal contenitore e risciacquare il gel con dd H2O. sostituire il dd H2O e immergere il gel per 30 min con agitazione delicata. (Il gel dovrebbe apparire come quello illustrato nella Figura 2, con la netta separazione delle bande dell'istone).
  7. Memorizzare i nucleosomes a 4 ° C fino all'utilizzo.
    Nota: Se conservati in queste condizioni, nucleosomi rimangono stabili per diversi mesi. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. funzionalizzazione della superficie di Mica per l'Imaging AFM statico dei nucleosomi

  1. Preparare una soluzione 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS stock in acqua deionizzata come descritto. Aliquote a 30 store 1 mL di questa soluzione a 4 ° C fino all'utilizzo.
    Nota: Le aliquote possono essere conservate per più di un anno a 4 ° C. 59
  2. Preparare una soluzione di 1: 300 APS di lavoro per la modifica di mica sciogliendo 50 µ l dello stock APS 50 mM in 15 mL dd H2O.
    Nota: Questa soluzione di lavoro può essere conservata a temperatura ambiente per diversi giorni.
  3. Tagliare le strisce di 1 x 3 cm di mica da fogli di mica di alta qualità (Vedi Tabella materiali per mica usato qui).
    1. Controllare che il pezzo si inserisce quando posizionati in diagonale in una cuvetta. Usare la punta di pinzette taglienti, una lama di rasoio o nastro adesivo, per fendere strati della mica fino a quando entrambi i lati sono appena spaccati e il pezzo è sottile come ~0.1 mm (Figura 3A). Immediatamente posto il pezzo mica nella cuvetta APS riempito e incubare per 30 min (Figura 3B).
  4. Trasferire il pezzo mica una cuvetta riempita con dd H2O e ammollo per 30 s (Figura 3). Asciugare completamente entrambi i lati della striscia APS-mica sotto un flusso di argon.
    Nota: Un tessuto non tessuto cellulosa e poliestere cleanroom wipe (consigliato pulire dettagliate nei materiali) può essere utilizzati per facilitare la traspirazione dell'acqua dal bordo della mica durante l'asciugatura.
  5. Utilizzare il nastro di mica asciutto è ora per la preparazione del campione. In caso contrario, è possibile memorizzare il pezzo in una cuvetta pulita e asciutta (Figura 3D).
    Nota: Ulteriore spazio di archiviazione in un vuoto per 1-2 h è consigliabile quando l'ambiente è umido. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. preparazione dei campioni Nucleosome su APS-Mica per l'Imaging AFM statico

  1. Applicare il nastro biadesivo per diversi dischi magnetici e metterli al lato.
  2. Tagliare il substrato APS-mica fino alla dimensione desiderata (quadrati di 1 x 1 cm per lo strumento AFM MM utilizzato qui). Mettere questi pezzi in una capsula Petri pulita e tenere coperto.
  3. Preparare tre diluizioni dei nucleosomes assemblati (finale nucleosoma concentrazioni di 0.5, 1.0 e 2.0 nM) utilizzando un 0,22 µm filtrata tampone contenente 10 mM HEPES pH 7.5 e 4 mM MgCl2.
    Nota: Per limitare la perdita di nucleosomi presso la bassa concentrazione finale, le diluizioni dovrebbero essere fatto uno alla volta, immediatamente prima della deposizione su APS-mica.
  4. 5-10 µ l del campione diluito nucleosoma di deposito presso il centro del pezzo APS-mica e lasciare Incubare per due minuti. Sciacquare delicatamente il campione con 2-3 mL di dd H2O per rimuovere tutti i componenti di buffer. Dopo ogni mL di ~0.5 di dd H2O utilizzato, agitare delicatamente la mica per rimuovere l'acqua in eccesso.
    Nota: Si raccomanda una siringa monouso per questa fase di risciacquo.
  5. Essiccare il campione depositato sotto un leggero flusso di gas argon pulito.
    Nota: Il campione è pronto per essere imaged o possa essere memorizzato in un armadietto vuoto o un essiccatore riempito con argon. Campioni preparati e conservati come descritto sono stato ripreso un anno dopo la preparazione senza perdita di qualità. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. statico AFM Imaging dei nucleosomi

  1. Montare una punta AFM sul supporto della punta. Utilizzare una punta che ha una costante di primavera di ~ 40 N/m e una frequenza di risonanza tra 300 e 340 kHz (Vedi la Tabella materiali per il cantilever usato qui).
  2. Montare il campione preparato nella sezione 3 sul palco AFM facendo attenzione a non entrare in contatto la superficie del campione.
  3. Posizionare il laser sopra la trave a mensola fino a quando la somma è al massimo e regolare i valori di deflessione verticale e laterale per quasi a zero.
  4. Sintonizzare la sonda AFM per trovare la propria frequenza di risonanza e regolare l'ampiezza del disco e impostare le dimensioni dell'immagine a 100 x 100 nm. Fare clic sul pulsante impegnare per iniziare l'approccio.
  5. Una volta che si avvicinava, ottimizzare gradualmente il Setpoint di ampiezza fino a quando la superficie del campione è chiaramente visibile. Aumentare la dimensione di scansione a 1 x 1 µm e la risoluzione di 512 x 512 pixel. Fare clic sul pulsante cattura seguito dal pulsante impegnare per iniziare l'acquisizione di immagini.
    Nota: Le immagini nella Figura 4 mostrano lo sfondo liscio che può essere previsto quando questi campioni di imaging.
  6. Per analizzare il campione nucleosoma, aprire le immagini acquisite utilizzando il software di analisi di strumenti AFM.
    1. Appiattire l'immagine utilizzando una linea polinomiale sottrazione o funzionalità simili.
    2. Impostare la tabella dei colori per riflettere il valore minimo per il minimo e il valore più alto per massimo. Tenere un registro di questi valori per ogni immagine come saranno necessari in un passaggio successivo.
      Nota: Se questi valori non vengono utilizzati, i dati di altezza sarà corretti in analisi successive come sezioni trasversali di core nucleosoma apparirà come altipiani di altezza uguale, piuttosto che varia.
    3. Esportare l'immagine come TIFF immagine alle dimensioni originali. De-selezionare le opzioni per salvare l'immagine con un bordo o scala bar.
    4. Aprire l'immagine nel software di analisi capace di misurazioni di lunghezza contorno.
    5. Impostare x, y e z scale per abbinare l'immagine.
    6. Come una calibrazione lunghezza interna, misurare e registrare la lunghezza del contorno di DNA libero da un'estremità a altra. Per questo fattore di taratura, è necessario utilizzare le misure per generare un istogramma e montarla con una distribuzione normale (gaussiana). Dividere il centro di picco (xc) per la lunghezza di substrato in coppie di basi.
      Nota: Questo valore è il fattore di immagine specifico conversione da nanometri a coppie di base del DNA.
    7. Misurare e registrare la lunghezza del contorno di entrambe le braccia per ogni nucleosoma dall'estremità libera del braccio al centro del nucleo, per coerenza (Figura 5A).
    8. Per ciascun core del nucleosoma, raccogliere due full larghezza a metà massimi valori (FWHM) da una coppia perpendicolare del nucleo misure di sezioni trasversali (figura 5B media delle due misurazioni di FWHM e sottrarre la metà del valore risultante da ciascun braccio nucleosoma a corretto per la lunghezza misurata dall'uscita/entrata del DNA al centro del nucleo che non fa parte della lunghezza del braccio.
    9. Dividere ogni lunghezza di braccio per il fattore di calibrazione calcolata (passo 4.5.6) per ottenere lunghezze del braccio in coppie di basi del DNA.
    10. Calcolare la misura del DNA avvolgimento sottraendo la somma di braccio nucleosoma dalla lunghezza totale coppia di basi del substrato non imbustato. Tracciare questi valori come un istogramma e forma il peak(s) con una distribuzione normale (gaussiana) per ottenere la medie avvolte paia di basi del DNA per la popolazione di nucleosomi.
    11. Calcolare l'altezza media nucleosoma da sezioni trasversali misurate. Tracciare questo come un istogramma e forma il peak(s) con una distribuzione normale (gaussiana) per ottenere l'altezza della popolazione nucleosoma.

5. la formazione immagine AFM time-lapse del nucleosoma Dynamics

  1. Montare la punta AFM sul supporto della punta. Può essere utilizzata una sonda con una molla di costante di circa 0.1 N/m e una frequenza di risonanza di 7-10 kHz (vedere la lista di materiali per il cantilever usato qui).
  2. Fissare un pezzo di 1 x 1 cm di APS-mica per un disco magnetico con biadesivo e montare il puck sullo strumento AFM.
  3. Diluire i nucleosomes ad una concentrazione di 1 nM in un buffer di formazione immagine filtrata da 0,22 µm contenenti 10 mM HEPES pH 7.5 e 4 mM MgCl2.
  4. Deposito 5-10 µ l del nucleosoma diluito al centro del pezzo mica per 2 min risciacquo il campione depositato con 20 µ l di buffer di imaging due volte. Dopo il secondo risciacquo, mantenere una goccia di tampone sulla superficie di imaging.
  5. Utilizzare la fotocamera vista dall'alto per trovare la punta e l'approccio alla superficie manualmente fino a quando la punta è ~ 100-500 µm dalla superficie.
  6. Aggiungere ulteriori buffer imaging per colmare il divario tra la punta e la superficie. In questo esempio, circa 50 µ l di tampone imaging è sufficiente a colmare la lacuna. Trovare un picco di risonanza per la punta.
  7. Iniziare l'approccio computerizzato alla superficie. Quando si avvicinò, iniziare la formazione immagine con un'area di 1-2 µm per selezionare un'area di nm ~ 500 di interesse. Con questa area di interesse selezionata, regolare la densità di acquisizione dati a 512 x 512 pixel.
  8. Regolare la tensione del set-point e guidare i parametri di ampiezza per migliorare la qualità dell'immagine. Un'ampiezza libera di 10 nm o meno e una velocità di scansione di ~ 2 Hz può essere utilizzata per catturare immagini di qualità. Nella Figura 6è riportato un esempio delle dinamiche nucleosoma acquisiti mediante AFM time-lapse.

6. alta velocità Time-lapse AFM Imaging del nucleosoma Dynamics

Nota: Il protocollo sottostante viene fornito per lo strumento di HS-AFM sviluppato dal gruppo Ando (Università di Kanazawa, Kanazawa, Giappone). 60

  1. Preparare APS-mica per l'imaging liquido.
    1. Fissare la bacchetta di vetro alla fase dello scanner AFM utilizzando la bacchetta di vetro - colla dello scanner (Vedi Tabella materiali). Lasciare che questo secco per un minimo di 10 min.
    2. Rendere ~0.1 mm spessore circolare pezzi di mica con un diametro di 1,5 mm di punzonatura loro da una grande lastra di mica. Utilizzare la colla di canna di vetro mica HS-AFM (Vedi Tabella materiali) per collegare questo pezzo di mica per la bacchetta di vetro sulla HS-AFM e a secco, intatta per un minimo di 10 minuti. Cleave strati utilizzando un nastro sensibile alla pressione, fino a quando uno strato ben fenduto è visto sul nastro.
    3. Diluire 1 µ l di brodo APS 50 mM in 99 µ l di dd H2O per ottenere una soluzione APS 500 µM. Deposito 2,5 µ l di questa soluzione sulla superficie appena fenduti mica e lasciate funzionalizzare per 30 min.
      Nota: Per evitare l'essiccazione della superficie mentre funzionalizzazione, il tappo di una provetta conica per centrifuga da 50 mL può essere in forma con un umido pezzo di carta da filtro e posizionato sopra lo scanner. Lo stock APS è diluito 3 volte meno per l'imaging liquido rispetto per imaging statico per controllare le dinamiche con una frequenza che può essere osservata con AFM.
    4. Sciacquare la mica con 20 µ l di dd H2O applicando diversi risciacqui di ~ 3 µ l. Rimuovere l'acqua completamente dopo ogni risciacquo mettendo un panno di tessuto non tessuto al bordo della mica. Dopo il risciacquo finale, mettere ~ 3 µ l di dd H2O sulla superficie e lasciare riposare per un minimo di 5 min per rimuovere qualsiasi APS non specifico associato.
  2. Posizionare la sonda nel supporto HS-AFM e posizionare il supporto sul palco AFM con la punta rivolta verso l'alto. Sciacquare il titolare utilizzando ~ 100 µ l di dd H2O seguito da risciacqui due ~ 100 µ l di 0,22 µm filtrata nucleosomi imaging del buffer che contiene 10 mM HEPES pH 7.5 e 4 mM MgCl2.
  3. Con i risciacqui fatto, riempire la camera con ~ 100 µ l del nucleosoma buffer, sommergendo la punta di imaging. Regolare la posizione a sbalzo fino a quando non viene colpito con il laser. Sciacquare la APS-mica con 20 µ l di filtrato nucleosoma buffer, di imaging utilizzando ~ 4 µ l per risciacquo.
  4. Diluire 1 µ l dello stock di assemblaggio del nucleosoma in 250 µ l di filtrato nucleosoma imaging buffer per una concentrazione finale nucleosoma di 1 nM. 2,5 µ l di questa diluizione di depositarsi sulla superficie e lasciare riposare per 2 min. Risciacquare la superficie con ~ 4 µ l di nucleosomi imaging buffer due volte. Dopo il risciacquo finale, lasciare la superficie coperta in buffer di imaging.
    Nota: Se la superficie non viene risciacquata dopo aver depositato il campione nucleosoma, la superficie rapidamente diventa affollata.
  5. Impostare lo scanner e il campione sopra il titolare di punta in modo che il campione è volto verso il basso. Per iniziare l'approccio, è possibile utilizzare la funzione di auto-approccio con un'ampiezza di set-point, uns vicino l'oscillazione libera ampiezza A0.
    Nota: Idealmente, unas = 0,95 un0, tuttavia, operativo al 82% di0 funzionerà anche se state attenti.
  6. Regolare il set point fino a quando la superficie è ben monitorata.
    Nota: Per ridurre al minimo il trasferimento di energia dalla punta AFM al campione nucleosoma, mantengono l'ampiezza dello sbalzo deve essere piccolo, con ampiezze basse quanto 1 nm ottimale.
  7. Impostare l'area di immagine circa 150 x 150 nm a 200 x 200 nm con velocità di acquisizione dati di ~ 300 ms per ogni fotogramma di imaging.
    Nota: Questa dimensione dell'immagine è in genere sufficiente per catturare le dinamiche dei nucleosomi diversi contemporaneamente. Una superficie meno popolata può richiedere modifiche a questi parametri. La frequenza fotogrammi suggerito è sufficiente a catturare nucleosoma dinamiche come loop, scorrevole e scartare, tra gli altri (Vedi sezione rappresentante risultati di sotto).

7. analisi delle dinamiche di Nucleosome acquisiti mediante AFM time-lapse

  1. Convertire le immagini dal tipo di dati di HS AFM (ASD) in immagini TIFF.
    1. Appiattire le immagini utilizzando software di analisi del sistema AFM con funzioni sia in aereo o in linea fino a quando lo sfondo è uniforme di contrasto.
    2. Impostare il contrasto dell'immagine (scala di colore) su automatico.
      Nota: Il contrasto può essere regolato manualmente per scopi di presentazione, ma non per l'analisi. In questo modo dettaglio di altezza per essere perso nelle immagini convertite.
    3. Salvare l'intervallo selezionato di immagini come un file con estensione MOV. Deseleziona la barra della scala e bordo opzioni prima di salvare.
      Note: Non fare analisi sulle immagini che contengono le barre di scala nel telaio. Questi modificare le dimensioni dell'immagine e si tradurrà in false misurazioni.
    4. Convertire il file. MOV in immagini tiff utilizzando un software adatto (Vedi Tabella materiali). Utilizzare lo stesso frame rate per la conversione è stato utilizzato quando si crea il file. MOV.
  2. Per misurazioni contorno di lunghezza del braccio, aprire le immagini in un software di misurazione capace di questa misura tipo (Vedi Tabella materiali).
    1. Impostare le dimensioni dell'immagine affinché corrispondano a quelle in cui è stato catturato.
    2. Misurare la lunghezza del contorno di ogni braccio nucleosoma dall'estremità del braccio al centro del nucleo nucleosoma e registrare le misurazioni in un foglio di calcolo (Figura 4A).
    3. Misurare la lunghezza del substrato del DNA non incapsulato nei fotogrammi dopo un nucleosoma scarta. Utilizzare questa opzione per una taratura specifica film del rapporto nm/bp che è usato per nucleosoma avvolgimento calcoli
    4. Raccogliere due profili di sezioni trasversali per il nucleo di nucleosomi e due per il DNA nudo (Figura 4B).
    5. Importare i profili di sezione trasversale di un software di foglio di calcolo e normalizzare le trame sottraendo il valore più basso di z da tutti i punti nel profilo.
    6. Calcolare l'altezza e la larghezza a metà altezza (FWHM) per ogni sezione trasversale e media dei valori dei due profili per ogni fotogramma.
  3. Sottrarre la metà del valore FWHM da ciascuno del nucleosoma braccia sono trama come un grafico a dispersione con la somma calcolata delle braccia.
    1. Calcolare la lunghezza media di contorno da misurazioni del DNA effettuate per il DNA in fotogrammi dopo il nucleosoma scartato.
    2. Determinare il fattore di calibrazione nm/bp dividendo la lunghezza media di contorno del DNA libero dalla lunghezza del substrato DNA base pair. Utilizzare questo valore per calcolare avvolgimento nucleosoma in ogni fotogramma, come descritto nella sezione 5.12.

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Risultati

Mono-nucleosomi sono stati preparati prima per AFM imaging esperimenti utilizzando un metodo di assemblaggio di continuo diluizione (Figura 1). I nucleosomes preparati erano poi controllati mediante SDS-PAGE discontinua (Figura 2). Una superficie di mica era successiva funzionalizzata con APS, che cattura nucleosomi alla superficie pur mantenendo un fondo liscio per imaging ad alta risoluzione (Figura 3). Nucleosomi sono stati depos...

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Discussione

Il protocollo descritto sopra è piuttosto semplice e fornire risultati altamente riproducibili, anche se alcuni problemi importanti possono essere enfatizzati. Funzionalizzati APS-mica è un substrato fondamentale per ottenere risultati affidabili e riproducibili. Un'elevata stabilità di APS-mica è una delle caratteristiche importanti di questo substrato che permette di preparare il substrato imaging in anticipo per l'uso che può essere utilizzato almeno due settimane dopo la fase di preparazione. 5...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Riconoscimenti

Autore di contributi: YLL e MSD progettato il progetto; MSD assemblati nucleosomi. MSD e ZS eseguite analisi di esperimenti e dati AFM. Tutti gli autori ha scritto e modificato il manoscritto.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Plasmid pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MA26656
PCR PrimersIDT, Coralville, IACustom Order(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymeraseThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701Catalog number for 200 units
PCR purification kitQiagen, Hilden, Germany 28104Catalog number for 50 units
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001Catalog number for 250 g
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant humanEpiCypher, Durham, NC16-0010Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant humanEpiCypher, Durham, NC15-0311Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant humanEpiCypher, Durham, NC16-0001Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574Catalog number for 10 devices
Sodium ChlorideSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500GCatalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008Catalog number for 8 devices
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLCatalog number for 25 mL
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25GCatalog number for 25 g
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS) Bio-Rad, Hercules, CA1610700Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158Catalog number for 500 mL
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747Catalog number for 10 mL
2-MESigma-Aldrich, St. Louis, MOM6250-10MLCatalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA1610786Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Muscovite Block MicaAshevilleMica, Newport News, VAGrade-1
Aminopropyl silatrane (APS)Synthesized as described in 22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25GCatalog number for 25 g
Scotch TapeScotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging)Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA480Catalog number for 2 g tube
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100GCatalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µmSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP05010Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force MicroscopeBruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force MicrosocopyToshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

Riferimenti

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