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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Einleitung
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  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Charakterisierung von Nukleosom Partikel auf der Einzelmolekül-Ebene mit statischen und Zeitraffer Rasterkraftmikroskopie (AFM) bildgebende Verfahren. Die Oberfläche Funktionalisierung beschriebene Methode ermöglicht die Erfassung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen in hoher Auflösung im Nanobereich.

Zusammenfassung

Chromatin, die eine lange Kette von Nukleosom Untereinheiten ist, ist ein dynamisches System, das für solche kritischen Prozesse ermöglicht, als DNA-Replikation und Transkription, nehmen in eukaryotischen Zellen. Die Dynamik der Nukleosomen ermöglicht den Zugriff auf die DNA von Replikation und Transkription Maschinen und kritisch zu den molekularen Mechanismen Chromatin Funktionen trägt. Einzelmolekül-Studien wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) imaging trugen erheblich zur unser gegenwärtiges Verständnis der Rolle der Nukleosom Struktur und Dynamik. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Schritte, die es ermöglicht hochauflösende AFM bildgebende Verfahren, die strukturelle und dynamische Eigenschaften der Nukleosomen zu studieren. Das Protokoll wird illustriert durch AFM Daten für das Zentromer Nukleosomen bei denen Histon H3 mit seinen Amtskollegen Zentromer Protein A (CENP-A) ersetzt wird. Das Protokoll beginnt mit der Montage der Mono-Nukleosomen mit einer kontinuierlichen Verdünnungsmethode. Die Vorbereitung des Glimmer Substrats funktionalisiert mit Aminopropyl Silatrane (APS-Glimmer), die für das Nukleosom-Bildgebung verwendet wird ist von entscheidender Bedeutung für die AFM-Visualisierung von Nukleosomen beschrieben und das Verfahren, das Substrat vorzubereiten wird erläutert. Nukleosomen hinterlegt auf der APS-Glimmer-Oberfläche werden zuerst abgebildet mit statischen AFM, die eine Momentaufnahme der Nukleosom Bevölkerung erfasst. Aus Analysen dieser Bilder Parameter wie die Größe der DNA umwickelt die Nukleosomen gemessen werden und dieser Prozess ist auch detailliert. Die Time-Lapse AFM bildgebende Verfahren in der Flüssigkeit ist für die High-Speed-Zeitraffer-AFM, die mehrere Frames erfassen können beschrieben Nukleosom Dynamik pro Sekunde. Schließlich ist die Analyse der Nukleosom Dynamik ermöglicht die quantitative Charakterisierung der dynamischen Prozesse beschrieben und illustriert.

Einleitung

In eukaryotischen Zellen ist DNA hoch verdichteten und in Chromosomen organisierte. 1 die erste Ebene der DNA-Organisation innerhalb eines Chromosoms ist die Versammlung der Nukleosomen welche 147 bp DNA ist ein Histon Octamer Kern fest umwickelt. 2 , 3 Nukleosom Partikel montieren auf einem langen DNA-Molekül bilden ein Chromatin-Array, dann organisiert wird, bis eine kompakte Chromosom Einheit gebildet wird. 4 die Demontage des Chromatins Zugriff auf kostenlose DNS durch wichtige zelluläre Prozesse wie gen-Transkription und Genom-Replikation, was darauf hindeutet, dass das Chromatin ist ein sehr dynamisches System. 5 , 6 , 7 die dynamischen Eigenschaften der DNA auf verschiedenen Ebenen von Chromatin zu verstehen ist von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung der genetischen Prozesse auf molekularer Ebene, wo Fehler zu Zelltod oder die Entstehung von Krankheiten wie Krebs führen kann. 8 eine Chromatin-Eigenschaft von großer Bedeutung ist die Dynamik der Nukleosomen. 9 , 10 , 11 , 12 die hohe Stabilität dieser Teilchen hat für die strukturelle Charakterisierung von kristallographischen Techniken erlaubt. 2 was diese Studien-Mangel sind die dynamischen Details der Nukleosomen wie der Mechanismus der DNA aus dem Histon-Kern Auspacken; der dynamische weg davon ist erforderlich für die Transkription und Replikation. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 darüber hinaus sind spezielle Proteine bezeichnet umgestaltet Faktoren gezeigt worden, die Demontage der nucleosomal Partikel17zu erleichtern; die innere Dynamik der Nukleosomen ist jedoch der entscheidende Faktor in diesem Prozess, der zur gesamten Demontage beiträgt. 14 , 16 , 18 , 19

Einzelmolekül-Techniken wie Einzelmolekül-Fluoreszenz19,20,21, optische fallen (Pinzette)13,18,22,23 und AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 haben maßgeblich für das Verständnis der Dynamik der Nukleosomen. Unter diesen Verfahren profitiert AFM mehrere einzigartige und attraktive Features. AFM erlaubt es, zu visualisieren und zu charakterisieren, individuelle Nukleosomen sowie längere Arrays27. Von AFM Bilder können wichtige Merkmale der Nukleosom Struktur wie die Länge der DNA um die Histon-Kern gewickelt gemessenen 10,14,26,28; ein Parameter, der die Charakterisierung der Nukleosom Auspacken Dynamik im Mittelpunkt steht. Vorbei an AFM haben Studien ergeben Nukleosomen hochdynamische Systeme und DNA spontan aus dem Histon Kern14auspacken kann. Die spontane Auspacken der DNA von Nukleosomen wurde direkt von AFM Betrieb im Zeitraffer-Modus, wenn die Bildgebung in wässrigen Lösungen 14,26,29 erfolgtvisualisiert.

Das Aufkommen der High-Speed-Zeitraffer AFM (HS-AFM) Instrumentierung ermöglichte es den Nukleosom Auspacken Prozess um die Millisekunde Zeitskala 14,15,24zu visualisieren. HS-AFM 16,30 Studien von spezifischen Nukleosomen Zentromer offenbart einige Neuerungen die Nukleosomen im Vergleich mit den kanonischen Typ. Zentromer Nukleosomen bilden der Zentromer, ein kleiner Teil des Chromosoms für Chromosom Abtrennung31von entscheidender Bedeutung. Im Gegensatz zu kanonischen Nukleosomen in loser Schüttung Chromatin enthält der Histon-Kern des Centromers Nukleosomen CENP-A Histon statt Histon H332,33. Als Folge dieser Histon-Substitution ist DNA-Verpackung in Zentromer Nukleosomen ~ 120 bp statt der ~ 147 bp für kanonische Nukleosomen; ein Unterschied, der zu verschiedenen Morphologien der Zentromer und kanonische Nukleosomen führen kann arrays34, was darauf hindeutet, dass das Zentromer Chromatin höhere Dynamik im Vergleich mit der Masse eines erfährt. Die neuartige Dynamik angezeigt durch Zentromer Nukleosomen in HS-AFM16,30 Studien veranschaulichen die einmalige Gelegenheit von dieser Einzelmolekül-Technik zur Verfügung gestellt, die strukturelle und dynamische Eigenschaften direkt sichtbar zu machen Nukleosomen. Beispiele für diese Features werden kurz diskutiert und am Ende des Papiers dargestellt. Diese Fortschritte wurden durch die Entwicklung von neuartigen Protokolle für AFM Bildgebung der Nukleosomen sowie Änderungen bestehender Methoden. Das Ziel des hier beschriebenen Protokolls soll diese spannende Fortschritte in Einzelmolekül-AFM Nukleosom Studien für jedermann zugänglich zu machen, die diese Techniken in ihrer Chromatin-Untersuchungen nutzen möchten. Viele der beschriebenen Techniken gelten für Probleme über das Studium der Nukleosomen und eignet sich für Untersuchungen von anderen Proteinen und DNA-Systeme von Interesse. Ein paar Beispiele für solche Anwendungen finden Sie in Publikationen35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 und Perspektiven von AFM Studien verschiedene Biomolekulare Systeme gegeben in29,50,51,53,54Bewertungen.

Protokoll

1. kontinuierliche Verdünnung Montage von Mono-Nukleosomen

  1. Generieren und reinige ein ca. 400 bp DNA Substrat, das ein-zentrierten Widom 601 Nukleosom Positionierung Sequenz enthält. 55
    Hinweis: Um die unerwünschten Bildung von di-Nukleosomen beschränken, jede 'Arm' flankieren die Positioniervorgang sollte nicht mehr als ~ 150 bp.
    1. Verwenden Sie Plasmid pGEM3Z-601 sowie die gestalteten Primer und verstärken Sie die Substrat-DNA mittels PCR. Für die 423 bp-Substrat mit 122 und 154 bp Armlängen hier verwendet, verwenden Sie vorwärts (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3 ") und rückwärts (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3") Primer.
    2. Fügen Sie Röhrchen mit dem Reaktionsgemisch zu einem Thermocycler bis 95 ° c vorgewärmt Führen Sie das folgende Programm für 33 Zyklen nach einer anfänglichen Denaturierung für 5 min bei 95 ° C: 30 s Denaturierung bei 95 ° C, 30 s Glühen bei 49 ° C, 35 s-Erweiterung bei 72 ° C. Legen Sie eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 10 min nach der 33 Zyklen.
    3. Reinigen Sie die DNA aus der PCR Mischung mit einem handelsüblichen PCR-Reinigung-Kit. Wenn die DNA aus der PCR Bereinigung Spalte eluierenden, verwenden Sie 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5) anstelle des Kits zur Verfügung gestellt Elution Puffer.
      Hinweis: Seien Sie besonders vorsichtig nicht zu Puffer zwischen den Reinigungsschritten übertragen. Eine kontaminierte Elutionsmittels kann Probleme verursachen flussabwärts als DNA-Konzentration zu messen und/oder verändern die Start Salzkonzentration das Nukleosom-Montage-Gemisch.
  2. Die DNA-Konzentration zu bestimmen, durch Messung der Extinktion der gereinigte DNA bei 260 nm.
    1. Sammeln Sie eine leere auf den UV-VIS Spektralphotometer mit nur 10 mM Tris pH 7,5 Elution Puffer. Eine Messung der gereinigte DNA zu sammeln.
  3. Mit der Konzentration bestimmt, aliquoten 25 Pmol der gereinigte DNA in ein 0,6 mL Microfuge Gefäß und legen Sie sie in einer Vakuum-Zentrifuge, bis die Lösung kaum sichtbar ist; Dies ist in der Regel 30 min bis 1 h.
    Hinweis: Die DNA-Substrat ist jetzt Nukleosom montagebereit. Andernfalls kann das Protokoll hier angehalten werden und die DNA gespeichert bei-20 ° C bis zur Verwendung.
  4. Das Microfuge Rohr mit 25 Pmol DNA auf dem Eis geben Sie und die Nukleosom Baugruppenkomponenten in Tabelle 1, in der angegebenen Reihenfolge. Wenn alle Komponenten hinzugefügt haben, entfernen Sie die Mischung aus dem Eis und bei Raumtemperatur (RT) für 30 min inkubieren.
    Hinweis: Es ist wichtig, dass der Salzgehalt des Puffers Lager Histon gilt als Berechnung der NaCl musste die Endkonzentration von 2 M zu erreichen. 15 , 56
  5. Montieren Sie die Nukleosomen durch die Reduzierung der 2 M Salzkonzentration des Gemisches bis 200 mM mit einer kontinuierlichen Preis-Verdünnung. 57
    1. Füllen Sie eine Spritze mit 100 µL Verdünnungspuffer mit 10 mM Tris pH 7,5 und legen Sie es auf eine Spritzenpumpe.
    2. Direkt ist die Nadel der Spritze durch ein Pre durchbohrte Loch in der Kappe des Microfuge Rohres, Kontakt mit der Montage-Mischung (Abbildung 1) gemacht.
    3. Laufen Sie die Spritzenpumpe mit einer Rate von 0,75 µL/min für 120 min.
      Hinweis: Die resultierende 100 µL Lösung enthält 250 nM Nukleosomen und 200 mM NaCl.
    4. Übertragen Sie die Mischung auf Knopfdruck 10 K MWCO Dialyse und Dialyse gegen 200 mL ein vorab gekühlt (4 ° C) niedrige Salz Puffer mit 10 mM Tris, pH 7,5, 0,25 mM EDTA und 2,5 mM NaCl, 1 Std. bei 4 ° C.
  6. Zur Beurteilung des Histon-Inhalts der Assemblée Nukleosom bereiten Sie eine diskontinuierliche SDS-PAGE-Gel mit 15 % trennen und 6 % als zuvor beschriebenen30stapeln.
    1. Aliquoten 10-20 µL das Nukleosom Lager zu einem Microfuge Schlauch und eine arbeiten-Konzentration von 1-2 X 4 x Laemmli Probenpuffer hinzufügen. 58
    2. Als Kontrolle wiederholen Sie dieses Präparat in einer separaten Microfuge Röhre für 1-2 µg der Histon-Aktie. Die Proben bei 95 ° C erwärmen ~ 5 Minuten.
    3. Laden Sie die Proben auf benachbarten Fahrspuren miteinander auf dem Gel. Die ungenutzten Fahrspuren sogar Band Migration fördern fügen Sie Probenpuffer hinzu.
    4. Führen Sie das Gel bei 65 V bis die Farbstoff-Front durch das Stapeln Gel bewegt. Wenn das Trennende Gel erreicht ist, steigt auf 150 V und laufen, bis die Farbstoff-Front aus dem Gel vollständig migriert hat.
    5. Die Elektrophorese Gerät zerlegen und das Gel sanft auf eine Färbung mit Dd H2O. gefüllten Behälter übertragen Lassen Sie das Gel für 5 min mit sanften Agitation zu sitzen. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal mit frischem Dd H2O benutzt jedes Mal.
      Hinweis: In diesem Protokoll verwendeten Coomassie-Fleck erfordert nicht die typische Befestigung Schritte für Coomassie Flecken (siehe Tabelle der Materialien). Wenn eine andere Coomassie Zubereitung verwendet wird, passen Sie die Befestigung Schritte nach Bedarf an.
    6. Entfernen Sie das Wasser aus der Nachspülung und fügen Sie nur genügend Fleck um das Gel zu decken. Lassen Sie das Gel mit sanften Agitation für mindestens 1 h sitzen.
      Hinweis: Für die Agitation kann die Färbung Container auf jedes Gerät platziert werden, die Bewegung des Flecks über das Gel fördert, wobei auch das Gel bedeckt in Flüssigkeit.
    7. Entfernen Sie den Fleck aus dem Behälter und spülen Sie das Gel mit Dd H2O. ersetzen Dd H2O und genießen Sie das Gel für 30 min mit sanften Agitation. (Das Gel sollte wie in gezeigt Abbildung 2, mit klaren Trennung der Histon-Bands angezeigt.)
  7. Speichern Sie die Nukleosomen bei 4 ° C bis zur Verwendung.
    Hinweis: Wenn unter diesen Bedingungen gelagert, Nukleosomen stabil bleiben für mehrere Monate. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

2. die Funktionalisierung der Glimmer-Oberfläche für statische AFM Imaging der Nukleosomen

  1. Bereiten Sie eine 50 mM 1-(3-Aminopropyl) Silatrane APS-Stammlösung in entionisiertem Wasser, wie beschrieben. 30 Speicher 1 mL Aliquots dieser Lösung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
    Hinweis: Der Aliquote können mehr als ein Jahr bei 4 ° c aufbewahrt werden 59
  2. Glimmer-Modifikation durch Auflösen von 50 µL der 50 mM APS bestand auf 15 mL Dd H2O. bereiten Sie 1: 300 Arbeitslösung APS vor
    Hinweis: Diese funktionierende Lösung kann für mehrere Tage bei Raumtemperatur gelagert werden.
  3. Schneiden Sie 1 x 3 cm Streifen von Glimmer aus hochwertigen Glimmer Platten (siehe Tabelle der Materialien für Glimmer verwendet hier).
    1. Überprüfen Sie, dass das Stück passt, wenn in einer Küvette schräg gestellt. Mit der Spitze eines scharfen Pinzette, einer Rasierklinge oder Tesafilm, um Schichten des Glimmers zu Spalten, bis beide Seiten frisch gespalten sind und das Stück so dünn wie ~0.1 mm (Abb. 3A ist). Sofort legen Sie die Glimmer-Stück in die Küvette gefüllt APS und inkubieren Sie für 30 min (Abb. 3 b).
  4. Übertragen der Glimmer-Stück auf eine Küvette gefüllt mit Dd H2O und Tränken für 30 s (Abbildung 3). Vollständig trocken Streifen beidseitig der APS-Glimmer unter einem Argon-Fluss.
    Hinweis: Ein Vlies Cellulose und Polyester Reinraum wischen (empfohlene wischen Materialien detailliert) lässt sich in Wasser von der Kante des Glimmers Feuchtigkeitstransport, beim Trocknen zu helfen.
  5. Verwendung der trockenen Glimmer Strip ist nun für die Probenvorbereitung. Andernfalls lagern Sie das Stück in einem sauberen, trockenen Küvette (Abbildung 3D).
    Hinweis: Zusätzliche Lagerung in einem Vakuum für 1-2 h wird empfohlen, wenn die Umgebung feucht ist. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

3. Vorbereitung der Nukleosom Proben auf APS-Glimmer für statische AFM Imaging

  1. Doppelseitige Klebeband für mehrere magnetische Pucks und legen Sie sie auf der Seite.
  2. Schneiden Sie die APS-Glimmer-Substrat auf die gewünschte Größe (ca. 1 x 1 cm Quadrate für das hier verwendete MM AFM-Instrument). Legen Sie diese Stücke in einer sauberen Petrischale und halten Sie bedeckt.
  3. Bereiten Sie drei Verdünnungen der montierten Nukleosomen (endgültige Nukleosom Konzentrationen von 0,5, 1,0 und 2,0 nM) mit 0,22 µm Puffer mit 10 mM HEPES pH 7,5 und 4 mM MgCl2gefiltert.
    Hinweis: Um den Verlust der Nukleosomen bei niedrigen Endkonzentration zu begrenzen, sollte die Verdünnungen jeweils unmittelbar vor der Ablagerung auf dem APS-Glimmer erfolgen.
  4. Hinterlegen Sie 5-10 µL der Probe verdünnt Nukleosom in der Mitte des Stückes APS-Glimmer zu, und lassen Sie für zwei Minuten inkubieren. Spülen Sie sanft die Probe mit ca. 2-3 mL Dd H2O, alle Puffer-Komponenten zu entfernen. Nach jeder ~0.5 mL Dd H2O verwendet vorsichtig schütteln der Glimmer um das überschüssige Wasser zu entfernen.
    Hinweis: Eine Einmalspritze empfiehlt sich für diese Spülung Schritt.
  5. Trocknen Sie die hinterlegte Probe unter eine leichte Strömung von sauber Argon-Gas.
    Hinweis: Die Probe ist nun bereit, abgebildet werden oder in einem Vakuum Schrank verstaubar oder Exsikkator mit Argon gefüllt. Proben vorbereitet und gespeichert wie beschrieben haben ein Jahr nach der Zubereitung ohne Qualitätsverlust abgebildet worden. Das Protokoll kann hier angehalten werden.

4. statische AFM Imaging der Nukleosomen

  1. Eine AFM-Spitze auf dem Tipp-Halter zu montieren. Verwenden Sie eine Spitze, die eine Federkonstante von ~ 40 N/m und eine Resonanzfrequenz zwischen 300 und 340 kHz hat (siehe die Tabelle der Materialien für die Kragarme verwendet hier).
  2. Montieren Sie das Beispiel in Abschnitt 3 auf der AFM-Bühne, wobei Sie darauf achten, nicht an der Oberfläche der Probe vorbereitet.
  3. Positionieren Sie den Laser über der Cantilever, bis die Summe maximal ist und passen Sie die vertikale und seitliche Auslenkung Werte beinahe auf Null.
  4. Stimmen die AFM-Sonde, um seine Resonanzfrequenz zu finden und stellen die Laufwerk-Amplitude und legen Sie die Bildgröße auf 100 x 100 nm. Klicken Sie auf die Schaltfläche einbinden, um den Ansatz zu beginnen.
  5. Sobald sich näherte, optimieren Sie allmählich die Amplitude Sollwert, bis die Oberfläche der Probe deutlich zu erkennen ist. Erhöhen Sie die Scangröße, 1 x 1 µm und die Auflösung auf 512 x 512 Pixel. Klicken Sie auf die Schaltfläche "aufzeichnen" gefolgt von der Schaltfläche einbinden Bildaufnahme zu beginnen.
    Hinweis: Die Bilder in Abbildung 4 zeigen die glatten Hintergrund, der erwartet werden kann, wenn diese Proben imaging.
  6. Um das Nukleosom Probe zu analysieren, öffnen Sie die aufgenommenen Bilder mit dem AFM-Instrumente-Analyse-Software.
    1. Glätten Sie das Bild mit einem Polynom Linie Subtraktion oder ähnliche Funktion.
    2. Festlegen der Farbtabelle, den niedrigsten Wert für das Minimum und der höchste Wert für Maximum zu reflektieren. Notieren Sie sich diese Werte für jedes Bild, da sie in einem späteren Schritt benötigt werden.
      Hinweis: Wenn diese Werte nicht verwendet werden, Höhenangaben in der späteren Analyse werden falsche wie Querschnitte der Nukleosom Kerne als Hochebenen gleich, anstatt unterschiedlicher Höhe angezeigt werden.
    3. Exportieren Sie das Bild als TIFF-Bild in der Originalgröße. Deaktivieren Sie alle Optionen zum Speichern des Bildes mit einer Grenze oder Skala Bars.
    4. Öffnen Sie das Bild im Analyse-Software in der Lage, Kontur Längenmessungen.
    5. Legen Sie die X, y und Z Skalen, mit dem Bild überein.
    6. Als eine Innenlänge Kalibrierung Messung und Aufzeichnung der Konturen Länge der freie DNA von einem Ende zum anderen. Verwenden Sie für diese Kalibrierfaktor Messungen, um ein Histogramm zu generieren und befestigen Sie es mit einer normalen (Gaußsche) Verteilung. Teilen Sie die Höhepunkt Mitte (x-c) durch die Substrat-Länge in Basenpaaren.
      Hinweis: Dieser Wert ist das Bild bestimmten Umrechnungsfaktor von Nanometern auf Basis Paare DNA.
    7. Messung und Aufzeichnung der Konturen Länge beider Arme für jedes Nukleosom aus das freie Ende des Armes in die Mitte des Kerns, die Konsistenz (Abbildung 5A).
    8. Für jeden Kern Nukleosom sammeln zwei volle Breite am halben Maximalwerte (FWHM) von einem senkrechten Paar Kern Querschnitt Messungen (Abb. 5 b Durchschnitt der beiden FWHM-Messungen und subtrahieren Sie die Hälfte der Ergebniswert aus jedem Nukleosom-Arm stimmt für die gemessene Länge vom Ausgang/Eingang DNA in der Mitte des Kerns, die nicht Bestandteil der Armlänge.
    9. Teilen Sie jede Armlänge von der berechneten Kalibrierfaktor (Schritt 4.5.6), Armlängen in DNA-Basenpaare zu erhalten.
    10. Berechnen Sie das Ausmaß der DNA, die Umhüllung durch Subtraktion der Nukleosom Arm Summe von insgesamt Basenpaaren Länge des Substrats ausgepackt. Diese Werte als ein Histogramm des Grundstückes und passen die Peak(s) mit einer normalen (Gaußsche) Verteilung der mittleren eingewickelt Basenpaare der DNA für die Nukleosom Bevölkerung zu erhalten.
    11. Berechnen Sie die Höhe des durchschnittlichen Nukleosom von gemessenen Querschnitte. Dies als ein Histogramm des Grundstückes und passen die Peak(s) mit einer normalen (Gaußsche) Verteilung, die Höhe der Nukleosom Bevölkerung zu erhalten.

(5) Zeitraffer AFM Imaging Nukleosom Dynamik

  1. Die AFM-Spitze auf dem Tipp-Halter zu montieren. Eine Sonde mit einer Federkonstante von ca. 0,1 N/m und eine Resonanzfrequenz von 7 bis 10 kHz verwendet werden (siehe die Materialliste für die Kragarme verwendet hier).
  2. Bringen Sie ein 1 x 1 cm Stück APS-Glimmer zu einem magnetischen Puck mit doppelseitiges Klebeband und montieren Sie den Puck auf dem AFM-Instrument.
  3. Verdünnen Sie die Nukleosomen zu einer 1 nM-Konzentration in einem 0,22 µm gefilterte bildgebenden Puffer mit 10 mM HEPES pH 7,5 und 4 mM MgCl2.
  4. Zahlen Sie 5-10 µL verdünnter Nukleosom in der Mitte des Stückes Glimmer für 2 min. Spülen die hinterlegte Probe mit 20µL des Puffers bildgebenden zweimal ein. Halten Sie nach dem zweiten Spülen ein Tröpfchen von imaging-Puffer auf der Oberfläche.
  5. Verwenden Sie die Draufsicht Kamera erst finden, Tip und Herangehensweise an die Oberfläche manuell die Spitze ist ~ 100-500 µm von der Oberfläche.
  6. Fügen Sie zusätzliche bildgebende Puffer, um die Lücke zwischen der Spitze und der Oberfläche. In diesem Beispiel ist etwa 50 µL der bildgebenden Puffer ausreicht, um die Lücke zu füllen. Finden Sie eine Resonanzspitze für den Tipp.
  7. Beginnen Sie die computergesteuerte Annäherung an die Oberfläche. Als sich näherte, beginnen Sie Bildgebung mit einem 1-2 µm Bereich ~ 500 nm Bereich auswählen. Einstellen Sie mit diesem Interessengebiet ausgewählt Erwerb Datendichte auf 512 x 512 Pixel.
  8. Passen Sie die Sollwert-Spannung und fahren Sie Amplitude Parameter zur Verbesserung der Bildqualität zu. Eine kostenlose Amplitude von 10 nm oder weniger und eine Scan-Rate von ~ 2 Hz einsetzbar, hochwertige Bilder zu erfassen. Ein Beispiel für Nukleosom Dynamik mit Zeitraffer AFM erfasst ist in Abbildung 6dargestellt.

6. High-Speed-Zeitraffer AFM Imaging Nukleosom Dynamik

Hinweis: Das folgende Protokoll sorgt für die HS-AFM-Instrument von Ando-Gruppe (Universität Kanazawa, Kanazawa, Japan) entwickelt. 60

  1. APS-Glimmer für flüssige Imaging vorzubereiten.
    1. Der AFM-Scanner-Bühne mit der Glasstab - Scanner Kleber der Glasstab zuordnen (siehe Tabelle der Materialien). Lassen Sie diese trocknen für ein Minimum von 10 Minuten.
    2. Machen Sie ~0.1 mm Dicke Runde Stücke von Glimmer mit einem Durchmesser von 1,5 mm durch Stanzen sie aus einem größeren Blatt Glimmer. Die HS-AFM Glimmer-Glas-Stab Kleber verwenden (siehe Tabelle der Materialien), dieses Stück Glimmer zuordnen der Glasstab auf HS-AFM und trocken, unberührte für mindestens 10 Minuten. Cleave Schichten mit einem druckempfindlichen Band, bis eine gut gespalten Schicht auf dem Band zu sehen ist.
    3. Verdünnen Sie 1 µL 50 mM APS Lager in 99 µL Dd H2O, eine 500 µM APS-Lösung zu machen. Hinterlegen Sie 2,5 µL dieser Lösung auf die frisch gespalten Glimmer-Oberfläche und lassen Sie für 30 min zu funktionalisieren.
      Hinweis: Um zu verhindern, während der Funktionalisierung der Oberfläche trocknen, die Kappe des einen konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL passen mit einem feuchten Stück Filterpapier und werden über den Scanner gelegt. Die APS-Aktie wird verdünnt 3 mal weniger für flüssige Darstellung als für statische Bildgebung zur Steuerung der Dynamik zu einer Rate, die mit AFM beobachtet werden können.
    4. Spülen Sie die Glimmer mit 20 µL Dd H2O durch die Anwendung mehrere ~ 3 µL Spülungen. Entfernen Sie Wasser vollständig nach jedem spülen indem man ein Vlies-Tuch am Rand des Glimmers. Nach der Nachspülung ~ 3 µL Dd H2O auf der Oberfläche und lassen Sie es sich für ein Minimum von 5 min, nonspecifically gebundenen APS zu entfernen.
  2. Setzen Sie die Sonde in den HS-AFM-Halter und positionieren Sie den Halter auf der AFM-Bühne mit der Spitze nach oben. Spülen Sie den Halter mit ~ 100 µL der Dd H2O, gefolgt von zwei ~ 100 µL Spülungen von 0,22 µm filtriert Nukleosomen imaging Puffern die enthält 10 mM HEPES pH 7,5 und 4 mM MgCl2.
  3. Füllen Sie mit den Spülungen gemacht die Kammer mit ~ 100 µL Nukleosom imaging-Puffer, die Spitze eintauchen. Passen Sie die Cantilever-Position, bis er mit dem Laser getroffen wird. Spülen Sie die APS-Glimmer mit 20 µL des gefilterten Nukleosom imaging-Puffer, mit ~ 4 µL pro Spülgang.
  4. Verdünnen Sie 1 µL Nukleosom-Montage-Lager in 250 µL des gefilterten Nukleosom imaging Puffer für eine endgültige Nukleosom-Konzentration von 1 nM. 2.5 µL dieser Verdünnung zu hinterlegen, auf der Oberfläche und lassen Sie es für 2 min. Spülen Sie die Oberfläche mit ~ 4 µL Nukleosom imaging Puffer zwei Mal. Verlassen Sie nach der Nachspülung die Oberfläche bedeckt Imaging-Puffer.
    Hinweis: Wenn die Oberfläche nicht gespült wird, nach Hinterlegung der Nukleosom-Probe, die Oberfläche wird schnell überfüllt geworden.
  5. Legen Sie die Scanner und Probe auf die Tipp-Halter, so dass die Probe Gesicht nach unten. Um den Ansatz zu beginnen, die Funktion Auto-Ansatz mit einem Sollwert Amplitude, eins in der Nähe der freien Schwingung Amplitude A0.
    Hinweis: Im Idealfall eins = 0.950, jedoch zu 82 % eine0 wird so gut funktionieren, wenn Sie vorsichtig.
  6. Stellen Sie den Sollwert, bis die Oberfläche gut nachverfolgt wird.
    Hinweis: Um die Übertragung von Energie von der AFM-Spitze auf das Nukleosom-Sample zu minimieren, die Amplitude des Nadelträgers sollte klein gehalten werden, mit Amplituden so niedrig wie 1 nm optimal.
  7. Legen Sie den Bildbereich ca. 150 x 150 nm bis 200 x 200 nm mit Erwerb Datenrate von ~ 300 ms pro Frame imaging.
    Hinweis: Diese Bildgröße ist in der Regel ausreichend, um die Dynamik der mehrere Nukleosomen gleichzeitig erfassen. Eine weniger besiedelte Fläche kann für Änderungen an diesen Parametern aufrufen. Die vorgeschlagenen Frame-Rate ist ausreichend, um Nukleosom Dynamik wie Schleifen, Gleit- und Auspacken, unter anderem (siehe Vertreter Resultate unter Abschnitt) zu erfassen.

7. Analyse der Nukleosom Dynamik mit Zeitraffer AFM erfasst

  1. Konvertieren Sie die Bilder von HS AFM-Datentyp (.asd) in TIFF-Bilder.
    1. Glätten Sie die Bilder mit dem AFM-System-Analyse-Software mit Flugzeug oder Linie Funktionen, bis der Hintergrund einheitlichen Kontrast hat.
    2. Den Kontrast des Bildes (Farbskala) auf automatisch eingestellt.
      Hinweis: Der Kontrast manuell zu Präsentationszwecken, aber nicht für die Analyse einstellbar. Dies bewirkt, dass Höhe Detail verloren in die konvertierten Bilder.
    3. Speichern Sie die Auswahl der Bilder als eine MOV-Datei. Deaktivieren Sie die Maßstabsleiste und Grenze Optionen vor dem speichern.
      Hinweise: Nicht Analyse auf Bilder, die Maßstabsleisten im Rahmen haben. Diese verändern die Größe des Bildes und führt zu Fehlmessungen.
    4. TIFF-Bilder mit einer geeigneten Software die MOV-Datei umwandeln (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie die gleiche Frame-Rate für die Konvertierung, wie verwendet wurde, wenn Sie die MOV-Datei erstellen.
  2. Für Arm Kontur Längenmessungen, öffnen Sie die Bilder in einem Mess-Software in der Lage, diese Messung (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Legen Sie die Bildabmessungen mit denen übereinstimmen, an denen es aufgenommen wurde.
    2. Messen Sie die Konture Länge der einzelnen Nukleosom-Bügel aus dem Ende des Armes in die Mitte des Kerns Nukleosom und notieren Sie die Messungen in einer Tabelle (Abb. 4A).
    3. Messen Sie die Länge des Substrats ausgepackt DNA in den Frames, nachdem ein Nukleosom packt. Verwenden Sie diese Option für einen Film Kalibrierung der nm/bp-Verhältnis das Nukleosom Umhüllung Berechnungen dient
    4. Sammeln Sie zwei Querschnittsprofile für das Nukleosom-Kern und zwei für die nackte DNA (Abbildung 4 b).
    5. Importieren Sie die Querschnittsprofile in ein Tabellenkalkulationsprogramm und normalisieren Sie die Grundstücke durch Subtraktion den niedrigsten Z-Wert von allen Punkten im Profil.
    6. Berechnen Sie die Höhe und die volle Breite am halben Maximum (FWHM) für jeden Querschnitt und Mittelwerte aus den beiden Profilen für jeden Frame.
  3. Subtrahieren Sie die Hälfte des Wertes aller das Nukleosom FWHM Arme sind Plot als ein Streudiagramm zusammen mit der berechneten Summe der Arme.
    1. Berechnen Sie die mittlere Konture Länge aus den DNA-Messungen für die DNA in Bildern gemacht, nachdem das Nukleosom ausgepackt.
    2. Der Kalibrierfaktor nm/bp dividiert die mittlere Konture Länge der freie DNA durch die Länge der Basenpaare der DNA Substrat zu bestimmen. Verwenden Sie diesen Wert Nukleosom Umhüllung in jedem Frame zu berechnen, wie im Abschnitt 5.12 beschrieben.

Ergebnisse

Mono-Nukleosomen wurden zunächst für AFM vorbereitet bildgebende Untersuchungen mit einer kontinuierlichen Verdünnungsmethode der Montage (Abbildung 1). Die vorbereiteten Nukleosomen wurden dann überprüft mit diskontinuierlichen SDS-PAGE (Abbildung 2). Eine Glimmer-Oberfläche wurde als nächstes funktionalisiert mit APS, die Nukleosomen an der Oberfläche erfasst und gleichzeitig einen reibungslosen Hintergrund für hochauflösende Bildgebung (

Diskussion

Das oben beschriebene Protokoll ist eher einfach und hoch reproduzierbare Ergebnisse liefern, obwohl ein paar wichtige Themen hervorgehoben werden können. Funktionalisierten APS-Glimmer ist ein wichtiger Substrat für immer zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse. Eine hohe Stabilität der APS-Glimmer ist eines der wichtigsten Merkmale dieses Substrat, das ermöglicht eine bildgebende Substrat für den Einsatz vorbereiten, die mindestens zwei Wochen nach Zubereitung verwendet werden können. 59

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Beiträge Autor: YLL und MSD entwickelt das Projekt; MSD montiert Nukleosomen. MSD und ZS durchgeführt AFM-Experimente und Daten-Analysen. Alle Autoren schrieb und das Manuskript bearbeitet.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Plasmid pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MA26656
PCR PrimersIDT, Coralville, IACustom Order(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymeraseThermoFischer Scientific, Waltham, MAEP0701Catalog number for 200 units
PCR purification kitQiagen, Hilden, Germany 28104Catalog number for 50 units
Tris baseSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001Catalog number for 250 g
EDTAThermoFischer Scientific, Waltham, MA15576028Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant humanEpiCypher, Durham, NC16-0010Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant humanEpiCypher, Durham, NC15-0311Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant humanEpiCypher, Durham, NC16-0001Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MA69574Catalog number for 10 devices
Sodium ChlorideSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500GCatalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters Millipore-sigma, Burlington, MOUFC501008Catalog number for 8 devices
HClSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLCatalog number for 25 mL
TricineSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25GCatalog number for 25 g
SDSSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS) Bio-Rad, Hercules, CA1610700Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1Bio-Rad, Hercules, CA1610158Catalog number for 500 mL
TEMEDBio-Rad, Hercules, CA1610800Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGEBio-Rad, Hercules, CA1610747Catalog number for 10 mL
2-MESigma-Aldrich, St. Louis, MOM6250-10MLCatalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder ThermoFischer Scientific, Waltham, MA26616Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie StainBio-Rad, Hercules, CA1610786Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, NCTX604
Muscovite Block MicaAshevilleMica, Newport News, VAGrade-1
Aminopropyl silatrane (APS)Synthesized as described in 22
HEPESSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25GCatalog number for 25 g
Scotch TapeScotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging)Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing)Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy GlueToagosei America, West Jefferson, OHAA480Catalog number for 2 g tube
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOM8266-100GCatalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µmSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP05010Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM)Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force MicroscopeBruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force MicrosocopyToshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

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