علم الطاقة الحيوية التحقيق المبيضات البيض "باستخدام" الوقت الحقيقي خارج الخلية التمويه التحليل

Summary

هنا، نقدم بروتوكول التدرجي للتحقيق في التنفس المتقدرية والدالة جليكوليتيك في المبيضات البيض استخدام محلل تدفق إضافي.

Abstract

الميتوكوندريا هي العضيات الضرورية الأيض الخلوية والبقاء على قيد الحياة. مجموعة متنوعة من الأحداث الرئيسية تجري في الميتوكوندريا، مثل التنفس الخلوي والتمثيل الغذائي الأكسدة وتوصيل الإشارة والمبرمج. ونتيجة لذلك، أفيد بخلل mitochondrial تلعب دوراً هاما في التسامح العقاقير المضادة للفطور وضراوة من الفطريات المسببة للأمراض. البيانات الأخيرة أدت أيضا إلى الاعتراف بأهمية الميتوكوندريا بوصفها مساهما هاما في الآلية المرضية الفطرية. وعلى الرغم من أهمية الميتوكوندريا في الأحياء الفطرية، هي بدائية أساليب موحدة لفهم وظيفتها. نقدم هنا، إجراء دراسة معدل استهلاك الأكسجين القاعدية (OCR)، مقياسا للتنفس المتقدرية، ومعدلات تحمض خارج الخلية (عكر)، مقياسا للدالة جليكوليتيك في سلالات المبيضة . يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا لأي ضغوط كانديداسب. دون الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا من الخلايا الفطرية سليمة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تخصيص هذا البروتوكول إلى الشاشة لمثبطات للوظيفة المتقدرية في سلالات المبيضة .

Introduction

الأمراض الفطرية الغازية تقتل ما يزيد على 1.5 مليون شخص سنوياً في جميع أنحاء العالم. هذا الرقم في الارتفاع بسبب زيادة في عدد الأشخاص الذين يعيشون مع حصانة المساس بها، بما في ذلك الرضع المسنين، سابق لأوانه، ومتلقي زرع، و مرضى السرطان¹. المبيضة هو ممرض فطرية بشرية انتهازية التي جزء من النبت البشرية. كما يقطن الأسطح المخاطية والجهاز الهضمي ككائن كومينسال. وتنتج المبيضة الأمراض الجهازية الخطيرة في الأشخاص الذين لديهم أوجه القصور المناعي، الذين خضعوا لعملية جراحية، أو الذين قد تم التعامل مع دورات طويلة من المضادات الحيوية. أنواع المبيضات الرتبة من بين أعلى ثلاثة إلى أربعة أسباب الأمراض المعدية (NID) المستشفيات في البشر^2،3،،من^45،،من⁶⁷. ويقدر عدد العالمية السنوية من التهابات مجرى الدم المبيضات حالات ~ 400,000، مع نفوق المرتبطة بها من 46-75%¹. الوفيات السنوية بسبب داء المبيضات هو تقريبا 10000 في الولايات المتحدة وحدها. مدى NID تسببها الفطريات ينعكس أيضا في نفقات المريض الفلكية⁵. في الولايات المتحدة، تفوق النفقات السنوية لعلاج الأمراض الفطرية الغازية $ 2 بیلیون، مضيفاً سلالة ضخمة لنظام الرعاية الصحية المثقلة بالفعل. العلاجات المضادة للفطور القياسية المتوفرة حاليا محدودة بسبب السمية، ومقاومة المخدرات أكثر انتشارا، والمخدرات-المخدرات التفاعلات. ولذلك، هناك حاجة ملحة لتحديد أهداف العقاقير المضادة للفطور الجديدة التي سوف تسفر عن أفضل خيارات العلاج للمرضى المعرضة للخطر. ومع ذلك، اكتشاف أدوية جديدة تعمل على أهداف الفطرية معقد نظراً للفطريات حقيقيات النوى. وهذا يحد بدرجة كبيرة العدد من الأهداف الفطرية الخاصة بالمخدرات.

قد بينت الدراسات الأخيرة أن الميتوكوندريا هي مساهم حرجة لضراوة الفطرية والتسامح للأدوية المضادة للفطور منذ الميتوكوندريا هامة للتنفس الخلوي والتمثيل الغذائي الأكسدة وتوصيل الإشارة والمبرمج^{8 9، ،،}من¹⁰¹¹. التمثيل الغذائي سواء جليكوليتيك أو غير جليكوليتيك ضرورية لبقاء المبيضة في الثدييات المضيفة^12،،من^1314،،من¹⁵¹⁶. وعلاوة على ذلك، عدة طفرات المبيضة التي تفتقر إلى البروتينات المتقدرية، مثل Goa1، Srr1، Gem1، Sam37 إلخ قد أظهرت أن تكون معيبة في فيلامينتيشن، عامل فوعة هامة من المبيضة^{17، 18 , 19 , 20 , 21 , 22}-وبالإضافة إلى ذلك، عرضت هذه طفرات أيضا أن يخفف لضراوة في نموذج ماوس لنشر داء المبيضات^17،،من^{1819،20،21 ،22}. وهكذا، تمثل الميتوكوندريا الفطرية هدفا جذاباً لاكتشاف المخدرات. ومع ذلك، هو التحدي دراسة الوظيفة المتقدرية في المبيضة سبب المبيضة صغيرتي السلبية²³، مما يعني أنها لا تستطيع أن تعيش دون جينوم المتقدرية.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول التي يمكن استخدامها للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا وجليكوليتيك في المبيضة دون الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا. هذا الأسلوب يمكن أن يكون الأمثل أيضا للتحقيق في تأثير التلاعب بالجينات أو المغيرون الكيميائية على مسارات mitochondrial وجليكوليتيك في المبيضة.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول التدرجي مفصلة المقايسة يرد أدناه، والبروتوكول التخطيطي ويرد في الشكل 1.

1-سلالات المبيضة وظروف النمو

1. تنمو سلالات المبيضة في السائل المتوسطة الخميرة استخراج-ببتون-الدكستروز (YPD) في 30 °مئوية في شاكر حاضنة بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: الحفاظ على سلالات المبيضات الأرصدة المجمدة، وتنمو في أجار YPD (استخراج الخميرة 1% ببتون 2%، 2% سكر العنب واجار 2%).

2-إعداد الكواشف

1. إعداد متوسطة المقايسة كما يلي:
   1. لفحص الوظيفة المتقدرية، يحل الجلوكوز ز 2 (2 في المائة) ومسحوق 1640 معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) ز 1.04 في 90 مل من الماء المعقم والحارة وسائط الإعلام إلى 37 درجة مئوية. ضبط ال pH إلى 7.4 استخدام 5 م هيدروكسيد الصوديوم وتكونها إلى 100 مل بالماء المعقم.
   2. للإجهاد glycolytic المقايسة، حل ز 1.04 مسحوق RPMI 1640 وحدها في 90 مل من الماء المعقم والحارة وسائط الإعلام إلى 37 درجة مئوية وضبط ال pH إلى 7.4. جعل وحدة التخزين إلى 100 مل بالماء المعقم. مسحوق RPMI 1640 قد لا بيكربونات، هو أمر حيوي لرصد تغير درجة الحموضة كمقياس لتحلل خلال المقايسة.
2. حقن مركبات.
   1. إعداد مخزون الجلوكوز 1 متر في الماء المعقم ومخزن في-20 درجة مئوية.
   2. إعداد 100 مم أوليجوميسين الأسهم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، الكوة بكميات صغيرة وتخزينها في-20 درجة مئوية.
   3. إعداد 100 مم أنتيميسين بالأسهم في [دمس]، الكوة بكميات صغيرة وتخزينها في-20 درجة مئوية.
   4. إعداد 100 ملم الشام (حمض ساليسيلهيدروكساميك) المخزون في الإيثانول في اليوم للمقايسة.
   5. تحضير 1 م KCN في الماء المعقم في اليوم من المقايسة.

3-طلاء لوحة المقايسة مع بولي-د-يسين (PDL)

ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات في غطاء الصفحي أدناه.

1. حل "يسين" بولي-د في زراعة الأنسجة الصف المياه لجعل 50 ميكروغرام/مل التركيز النهائي. يخلط جيدا والكوة في أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وتخزينها في-20 درجة مئوية لفترة طويلة.
   ملاحظة: هناك حاجة إلى 50 ميليلتر كل بئر، ومطلوب للآبار 24، 1.2 مل. ولذلك، قاسمة على الأقل 1.3 مل في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
2. إضافة 50 ميليلتر كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة مع غطاء تغطي ح 1-2.
3. نضح الحل وشطف مرة واحدة مع 500 ميليلتر زراعة الأنسجة المعقمة الصف المياه.
4. فتح الغطاء وتسمح الآبار للهواء الجاف. استخدم اللوحة في نفس اليوم أو مخزن في 4 درجات مئوية كحد أقصى من 2-3 أيام.

4-الماء من استشعار خرطوشة

ملاحظة: إجراء هذه الخطوة يوم واحد قبل التجربة.

1. فتح تدفق إضافي "أدوات الفحص" وإزالة المحتويات. ضع خرطوشة استشعار رأسا على عقب بجوار لوحة الأداة المساعدة (الشكل 2).
2. تعبئة كل جيدا للوحة الأداة المساعدة مع 1 مل كاليبرانت ومكان خرطوشة استشعار مرة أخرى. تأكد من أن أجهزة الاستشعار التي تحتوي على فلوروفوريس (لقياس الأوكسجين ودرجة الحموضة) مغمورة في كاليبرانت.
3. احتضان خرطوشة الاستشعار بين عشية وضحاها في حاضنة غير CO₂ في 37 درجة مئوية.

5-تزايد وبذر خلايا في لوحات PDL المغلفة

1. تطعيم المبيضة في مرق YPD وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في شاكر 200 لفة في الدقيقة.
   ملاحظة: استناداً إلى تصميم المقايسة والفائدة، يمكن أيضا زراعة المبيضة في يبج أو المتوسطة الدنيا.
2. في يوم الفحص، تخفف من عدد مناسب من الخلايا على المديين المتوسط ومقايسة تسفر عن تركيز نهائي للخلايا 100,000 الواحد 100 ميليلتر.
3. إضافة 100 ميليلتر من الخلايا المخفف في كل بئر من لوحة الفحص ما عدا الآبار A1، B4، C3، و D6، الذي إضافة فقط 100 ميليلتر من المتوسطة المقايسة لتصحيح الخلفية (الشكل 3).
4. نقل اللوحة لحاضنة غير CO₂ عند 37 درجة مئوية واحتضانها ل 60 دقيقة، التي سوف تسمح للخلايا التمسك بسطح لوحة.

6-فحص بروتوكول

ملاحظة: البروتوكول المبينة هنا للشكل 24-جيدا للصك. وحدات التخزين سوف تحتاج إلى تعديل في حالة استخدام تنسيق آخر.

1. تحليل الوظيفة المتقدرية
   1. إعداد المركبات
      1. إعداد المركبات بتركيز x 10 للوظيفة المتقدرية المقايسة: إعداد 20 مم الشام، 100 ميكرومتر أوليجوميسين، KCN، 100 ملم و 20 ألف أنتيميسين ميكرومتر في المتوسط التحليل المطابق.
      2. إضافة 50 ميليلتر الشام في المنفذ A، ميليلتر 55 أوليجوميسين إلى المنفذ B، 62 ميليلتر KCN إلى ميناء ج و 68 ألف أنتيميسين ميليلتر في منفذ د (الشكل 4).
2. فحص الإجهاد جليكوليتيك
   1. إعداد المركبات
      1. إعداد المركبات في تركيز x 10 لفحص الإجهاد جليكوليتيك. إعداد 100 ملم الجلوكوز، 100 ميكرومتر أوليجوميسين، 500 ملم 2-ديوكسي الجلوكوز (المديرية العامة 2) و 20 ألف أنتيميسين ميكرومتر في المتوسط التحليل المطابق.
      2. إضافة 50 ميليلتر الجلوكوز في المنفذ A، ميليلتر 55 أوليجوميسين منفذ ب، 2 ميليلتر 62-المديرية العامة في ميناء ج و 68 ألف أنتيميسين ميليلتر في منفذ دال
3. توظيف محلل التدفق الإضافي، الذي يقيس معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) ومعدل تحمض خارج الخلية (عكر) من الخلايا الحية في شكل لوحة 24-جيدا. إعداد البروتوكول الفحص مقدما.
4. افتح محلل تدفق إضافي وإعداد قالب الفحص باستخدام علامة التبويب معالج المقايسة واتبع التعليمات خطوة بخطوة ملء جميع المعلومات التي الملوثات العضوية الثابتة أثناء الإعداد. إنشاء تخطيط المجموعة كشبيه هو موضح في الشكل 5. إعداد البروتوكول كما هو مبين في الجدول 1. إعداد هذه التخطيطات مسبقاً قبل الفحص وحفظه في جهاز الكمبيوتر. في الوقت للمقايسة، استعادة بروتوكول المحفوظة عن طريق فتح الملف المطابق في خيار فتح الملف في علامة التبويب معالج بالانزيم (الشكل 5).
5. تحميل المركبات 10 x في موانئ كل خرطوشة استشعار المائية التي تحتوي على كاليبرانت وتحميل في علبة الناقل من محلل تدفق إضافي. بدء المعايرة عن طريق الضغط على زر ابدأ على الشاشة.
6. إضافة 350 ميليلتر من المتوسطة المقايسة بلطف إلى لوحة الخلية على طول الجانب من الآبار للتقليل من اضطرابات الخلية لإحضار وحدة التخزين النهائي إلى 450 ميليلتر.
7. استبدال لوحة الأداة التي تحتوي على كاليبرانت مع لوحة المقايسة والاستمرار.
8. إزالة خرطوشة الاستشعار واللوحة بمجرد اكتمال المقايسة. حفظ الملف في المجلد الوجهة المناسبة.

7-بيانات التحليل

1. استخدام المنطقة تحت منحنى--تحليل التباين (أوك-ANOVA) التبويب تحليل في البرنامج لحساب الفرق الكبير بين المجموعات بتحديد المعلمات الخاصة بكل منها (التعرف الضوئي على الحروف أو عكر) كما هو موضح في الشكل 6.
2. حدد المجموعات التي تحتاج إلى أن تكون المقارنة.
3. إضافة إلى مجموعات تحليل ANOVA وانقر فوق موافق.
   ملاحظة: هذا تحليل ANOVA أوك سيتم إضافة ورقة جديدة إلى الملف الذي يحسب لكل مجموعة أوك والمقارنة بينهما من ANOVA. وهذا سيعطي جدول القيم ف لإظهار الأهمية.

النتائج

ينصب هذا البروتوكول تحديد وظائف الطاقة البيولوجية المبيضة تقييم من قبل محلل تدفق إضافي. ويرد أيضا متحولة المبيضة التي تفتقر إلى البروتين المتقدرية Mam33 جنبا إلى جنب مع سلالة مكملاً لها، mam33Δ/Δ::MAM33 لدراسة آثار حذف البروتين المتقدرية على التعرف الضوئي على الح...

Discussion

الاستقلاب المقايسة الجريان الإضافي بمثابة أداة ممتازة لقراءة وظيفة الميتوكوندريا بقياس الفسفرة (أوكسفوس)-استهلاك الأوكسجين تعتمد في الوقت الحقيقي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا التحقيق دالة glycolytic ويتم قياسه كنسبة تحمض خارج الخلية (التغير في درجة الحموضة خارج الخلية) في نفس الوقت في تحليل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
Antimycin A	Sigma	A8674
KCN
Mito stress kit	Agilent	103015-100
Oligomycin	Calbiochem	495455
pH meter	Accumet	AR20
Phenol red	Sigma	P5530
Poly-D lysine	Sigma	P6407
Rotenone	Santa cruz	203242
Seahorse XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
Sodium Chloride	Amresco	241
Sodium hydroxie pellets	J.T Baker	3722
Tissue culture grade water	Gibco	1523-0147
XF assay calibrant solution	Agilent	100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose	Fisher scientific,	BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar	Sigma	A1296
Yeast extract Peptone Glycerol	Sigma	G2025