Bio-energética investigación de Candida albicans utilizando en tiempo real extracelular flujo análisis

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para investigar la respiración mitocondrial y la función glucolisis en Candida Albicans utilizando un analizador de flujo adicional.

Resumen

Las mitocondrias son organelos esenciales para el metabolismo celular y la supervivencia. Una variedad de eventos clave llevará a cabo en la mitocondria, como la respiración celular, metabolismo oxidativo, transduction de la señal y la apoptosis. En consecuencia, la disfunción mitocondrial se divulga a jugar un papel importante en la tolerancia de antimicóticos y la virulencia de hongos patógenos. Datos recientes también han contribuido al reconocimiento de la importancia de la mitocondria como un contribuyente importante para la patogénesis fúngica. A pesar de la importancia de la mitocondria en biología fúngica, métodos estandarizados para entender su función están poco desarrollados. Aquí, presentamos un procedimiento para estudiar la tasa de consumo de oxígeno basal (OCR), una medida de la respiración mitocondrial y las tasas de acidificación extracelular (ECAR), una medida de la función glucolisis en cepas de C. albicans . El método descrito en este documento puede aplicarse a cualquier Candidaspp. cepas sin la necesidad de purificar las mitocondrias de las células fúngicas intactas. Además, este protocolo puede también ser modificado para requisitos particulares para detectar inhibidores de la función mitocondrial en cepas de C. albicans .

Introducción

Las infecciones fúngicas invasivas mata a más 1,5 millones de personas al año en todo el mundo. Este número va en aumento debido a un aumento en el número de personas con inmunidad comprometida, incluyendo los bebés prematuros, ancianos, trasplantados y cáncer pacientes¹. C. albicans es un hongo patógeno humano oportunista que es una parte de la microflora humana. También habita las superficies mucosas y el tracto gastrointestinal como un organismo comensal. C. albicans produce enfermedad sistémica seria en personas con inmunodeficiencias, que han sometido a cirugía o que han sido tratados con cursos largos de antibióticos. El rango de especies de Candida entre las causas de la tapa tres de las enfermedades infecciosas nosocomiales (NID) en los seres humanos^2,3,4,5,6,7. Se estima el número global de infecciones de la sangre de Candida ~ 400.000 casos, con mortalidad asociada de 46-75%¹. La mortalidad anual a causa de la candidiasis es de aproximadamente 10.000 en los Estados Unidos. El grado de NID causada por hongos también se refleja en gastos astronómicos de paciente⁵. En los Estados Unidos, el gasto anual para el tratamiento de las infecciones fúngicas invasivas supera los $ 2 billones, añadiendo una gran tensión al sistema de salud ya sobrecargado. En la actualidad, terapias antihongos estándar disponibles son limitadas debido a toxicidad, resistencia a los medicamentos cada vez más frecuentes y las interacciones de fármacos. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de identificar nuevas dianas de antimicóticos que se traducirá en mejores opciones de tratamiento para pacientes de alto riesgo. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos fármacos que actúan sobre dianas fúngicas es complicado porque los hongos son eucariotas. Grandemente, esto limita el número de dianas farmacológicas de fungicidas específicos.

Estudios recientes han indicado que las mitocondrias son un contribuyente fundamental a la virulencia de hongos y la tolerancia a drogas antihongos ya que las mitocondrias son importantes para la respiración celular, metabolismo oxidativo, transduction de la señal y la apoptosis^{8 ,9,10,11}. Metabolismo glicolítico y no glucolisis son esenciales para la supervivencia de C. albicans en el huésped mamífero^{12,13,14,15,16}. Además, varios mutantes de C. albicans que carece de proteínas mitocondriales, como la Goa1, Srr1, Gem1, Sam37 etc. han demostrado ser defectuoso en la filamentación, un factor importante de virulencia de C. albicans^{17, 18 , 19 , 20 , 21 , 22}. Además, estos mutantes también fueron demostrados para ser atenuada para difusión de virulencia en un modelo murino de candidiasis^{17,18,19,20,21 ,22}. Así, las mitocondrias hongos representan un atractivo destino para el descubrimiento de medicamentos. Sin embargo, el estudio de la función mitocondrial en C. albicans es difícil debido a que C. albicans es petite negativa²³, que significa que no puede sobrevivir sin el genoma mitocondrial.

Aquí, describimos un protocolo que puede utilizarse para investigar la función mitocondrial y glucolisis en C. albicans sin necesidad de purificar las mitocondrias. Este método también se puede optimizar para investigar el efecto de la manipulación genética o moduladores químicos en las vías mitocondriales y glucolisis en C. albicans.

Protocolo

Nota: El protocolo paso a paso detallado del análisis se describe a continuación, y el protocolo esquemático se muestra en la figura 1.

1. las cepas de C. albicans y condiciones de crecimiento

1. Crecen las cepas de C. albicans en medio líquido de la dextrosa-peptona-Extracto de levadura (YPD) a 30 °C en un agitador incubador durante la noche.
   Nota: Mantener cepas de Candida como acción congelada y crecen en agar YPD (Extracto de levadura 1%, 2% peptona, 2% dextrosa y agar al 2%).

2. preparación de reactivos

1. Preparar el medio de ensayo como sigue:
   1. Para análisis de la función mitocondrial, disolver el polvo de 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1,04 g y 2 g de glucosa (2%) en 90 mL de agua estéril y caliente los medios a 37 ° C. Ajustar el pH a 7.4 con 5 M NaOH y enrasar a 100 mL con agua estéril.
   2. Para análisis de estrés de glucolisis, disolver 1,04 g 1640 RPMI polvo en 90 mL de agua estéril, caliente los medios a 37 ° C y ajustar el pH a 7.4. Enrasar a 100 mL con agua estéril. RPMI 1640 polvo no tiene bicarbonato, que es fundamental para monitorear el cambio de pH como una medida de la glucólisis durante el ensayo.
2. Compuestos de la inyección.
   1. Preparar caldo de glucosa de 1 M en agua estéril y almacenar a-20 ° C.
   2. Preparar 100 mM oligomycin stock en dimetil sulfóxido (DMSO), alícuota en volúmenes pequeños y almacenar a-20 ° C.
   3. Preparar acciones 100 mM antimicina en DMSO, alícuota en volúmenes pequeños y almacenar a-20 ° C.
   4. Preparar 100 mM stock SHAM (ácido salicylhydroxamic) en el etanol en el día del ensayo.
   5. Preparar 1 M KCN en agua estéril en el día del ensayo.

3. capa de la placa de ensayo con Poly-D-lisina (PDL)

Nota: Realice todos los pasos en una campana laminar.

1. D poli lisina en agua de calidad de cultivo de tejidos para hacer la concentración final de 50 μg/mL se disuelven. Mezclarlo bien y alícuota en un tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a-20 ° C a largo plazo.
   Nota: se necesita 50 μL por pocillo, y 24 pozos, 1,2 mL se requiere. Por lo tanto, alícuota mínimo 1.3 mL por tubo de microcentrífuga.
2. Añadir 50 μL por pocillo e incubar a temperatura ambiente con la tapa cubierta para 1-2 h.
3. Aspirar la solución y enjuague una vez con agua de calidad de cultivo estériles para tejidos de 500 μl.
4. Abra la tapa y deje que se sequen los pozos de aire. Utilizar la placa en el mismo día o a 4 ° C por un máximo de 2-3 días.

4. hidratación de cartucho de sensor

Nota: Realice este paso un día antes del experimento.

1. Abrir el flujo adicional Kit de ensayo y retire el contenido. Coloque el cartucho de sensor boca abajo al lado de la placa de utilidad (figura 2).
2. Llene cada uno bien de la placa de utilidad con 1 mL de calibrant y coloque el cartucho de sensor nuevo. Asegúrese de que los sensores que contengan fluoróforos (para medir el oxígeno y el pH) se introducen en el calibrant.
3. Incubar el cartucho sensor durante la noche en una incubadora sin CO₂ a 37 ° C.

5. cultivo y siembra de células en las placas recubiertas de PDL

1. Inocular de C. albicans en el caldo YPD y crecer durante la noche a 30 ° C en un agitador a 200 rpm.
   Nota: Basado en el diseño del ensayo y el interés, C. albicans puede también cultivarse en YPG o medio mínimo.
2. En el día del ensayo, diluir un número apropiado de células en el medio de ensayo para obtener una concentración final de 100.000 células por μl 100.
3. Añada 100 μl de las células diluidas en cada pocillo de la placa de ensayo excepto pozos A1, B4, C3 y D6, en el que añadir 100 μl del medio de ensayo para la corrección de fondo (figura 3).
4. Transferir la placa a una incubadora sin CO₂ a 37 ° C e incubar durante 60 minutos, lo que permitirá que las células se adhieren a la superficie de la placa.

6. Protocolo

Nota: El protocolo descrito aquí es para el formato de 24 pocillos del instrumento. Volúmenes tendrá que ajustarse si se utiliza otro formato.

1. Análisis de la función mitocondrial
   1. Preparación de compuestos
      1. Preparar compuestos en concentración de 10 x para análisis de la función mitocondrial: preparar 20 mM farsa, 100 μm Oligomycin, KCN, de 100 mM y μm Antimycin A 20 en el medio de ensayo correspondiente.
      2. Añadir 50 μl de simulacro en el puerto A, 55 μl Oligomycin en Puerto B, 62 μl de KCN al puerto C y μl Antimycin A 68 en Puerto D (figura 4).
2. Ensayo de tensión glucolisis
   1. Preparación de compuestos
      1. Preparar compuestos en concentración de 10 x para el ensayo de tensión glucolisis. Preparar 100 mM glucosa, 100 μm Oligomycin, 500 mM 2-deoxi glucosa (2DG) y 20 μm Antimycin A en el medio de ensayo correspondiente.
      2. Añadir glucosa μl 50 en Puerto A, 55 μl Oligomycin en Puerto B, 62 μl 2-DG en el puerto C y μl Antimycin A 68 en Puerto D.
3. Utilizar el analizador de flujo extra, el cual mide la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de células vivas en un formato de placa de 24 pozos. Configurar el protocolo de ensayo de antemano.
4. Abra el analizador de flujo adicional y configurar la plantilla de ensayo mediante la ficha de asistente de análisis y seguir las instrucciones paso a paso para completar toda la información que sale durante la instalación. Generar el diseño de grupo como similar al mostrado en la figura 5. Configure el protocolo como se muestra en la tabla 1. Configurar estas plantillas bien adelante antes del ensayo y guardar en el ordenador. En el momento de análisis, restablecer el protocolo guardado abriendo el archivo correspondiente en la opción Abrir archivo en la pestaña Asistente de ensayo (figura 5).
5. Carga de los compuestos de 10 x en los puertos respectivos del cartucho sensor hidratado que contiene el calibrant y cargue en la bandeja portadora del analizador de flujo extra. Comenzar la calibración pulsando el botón Start en la pantalla.
6. Añadir 350 μl del medio de ensayo suavemente a la placa celular en el lado de los pozos para minimizar la alteración de la célula para llevar el volumen final a 450 μl.
7. Vuelva a colocar la placa de utilidad que contienen calibrant con la placa de ensayo y continuar.
8. Quite el cartucho de sensor y la placa una vez terminado el ensayo. Guarde el archivo en la carpeta de destino apropiado.

7. Análisis de datos

1. Utilice el área bajo la curva - análisis de varianza (ANOVA-AUC) análisis ficha en el software para calcular la diferencia significativa entre los grupos, seleccionando los parámetros respectivos (OCR o ECAR) como se muestra en la figura 6.
2. Seleccione los grupos que deban compararse.
3. Agregar a los grupos de análisis de ANOVA y haga clic en Aceptar.
   Nota: Este análisis ANOVA AUC agregará una nueva hoja para el archivo en el que las AUC es calculada para cada grupo y compara entre ellos por ANOVA. Esto le dará una tabla de valores de p para mostrar la importancia.

Resultados

El objetivo de este protocolo es determinar las funciones bioenergéticas de C. albicans por analizador de flujo adicional. Un mutante de C. albicans que carece de proteína mitocondrial Mam33 también está incluido junto con su variedad de complemento, mam33Δ/Δ::MAM33 para el estudio de los efectos de la eliminación de una proteína mitocondrial en OCR y ECAR. MAM33 codifica para una proteína supuesta matriz mitocondrial de ácidos y su función e...

Discusión

La bioenergética análisis de flujo extra sirven como una excelente herramienta para leer la función mitocondrial mediante la medición de fosforilación oxidativa (OXPHOS)-consumo de oxígeno dependiente en tiempo real. Además, una función de glucolisis que es medida como una tasa de acidificación extracelular (cambio en el pH extracelular) también se puede investigar al mismo tiempo en el análisis en tiempo real.

Exitosa siembra de C. albicans en la placa de ensayo es uno de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
Antimycin A	Sigma	A8674
KCN
Mito stress kit	Agilent	103015-100
Oligomycin	Calbiochem	495455
pH meter	Accumet	AR20
Phenol red	Sigma	P5530
Poly-D lysine	Sigma	P6407
Rotenone	Santa cruz	203242
Seahorse XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
Sodium Chloride	Amresco	241
Sodium hydroxie pellets	J.T Baker	3722
Tissue culture grade water	Gibco	1523-0147
XF assay calibrant solution	Agilent	100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose	Fisher scientific,	BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar	Sigma	A1296
Yeast extract Peptone Glycerol	Sigma	G2025