Candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi

Özet

Burada, mitokondrial solunum ve Candida Albicans glycolytic işlevinde araştırmak için kademeli bir protokol bir ilave akı çözümleyicisini kullanarak mevcut.

Özet

Mitokondri temel organellerin hücre metabolizması ve hayatta kalmak için vardır. Önemli olaylar çeşitli hücresel solunum, oksidatif metabolizma, sinyal iletimi ve Apoptozis gibi mitokondri içinde yer alır. Sonuç olarak, mitokondrial disfonksiyon antifungal ilaç hoşgörü ve patojenik mantar virülans önemli bir rol oynamaya bildirilmektedir. Son veri mitokondri önemini mantar patogenezinde önemli bir katkı olarak tanınması da açmıştır. Mitokondri mantar Biyolojide önemini rağmen onun işlevini anlamak için standartlaştırılmış yöntemler kötü geliştirilir. Burada, çalışma Bazal oksijen tüketim oranını (OCR), bir ölçü mitokondrial solunum ve ekstraselüler asitleştirme oranları (D.H.T.), C. albicans suşları glycolytic işlevinde bir ölçü için bir yordam mevcut. Burada açıklanan yöntemi herhangi bir soy Candidaspp. mitokondri sağlam mantar hücrelerden arındırmak için gerek kalmadan uygulanabilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı Ayrıca özelleştirilebilir için C. albicans suşları mitokondriyal işlevde inhibitörleri ekran.

Giriş

İnvazif mantar enfeksiyonları yılda dünya çapında 1,5 milyonun üzerinde kişi öldür. Yaşlı, prematüre bebeklerde, organ nakli alıcılar ve kanser hastaları¹de dahil olmak üzere tehlikeye dokunulmazlık ile yaşayan insanların sayısında bir artış nedeniyle yükselişte sayıdır. C. albicans insan mikrofloranın parçasıdır fırsatçı bir insan mantar patojen var. Bu da Mukozal yüzeyler ve gastrointestinal sistem komensal bir organizma olarak yaşıyor. C. albicans bağışıklık eksiklikler, kim cerrahi undergone ya da kim uzun kursları antibiyotik ile tedavi edilmiş olan kişilerde ciddi sistemik hastalık üretir. Candida türleri sırası Nozokomiyal enfeksiyon hastalıkları (NID) insanlar^2,3,4,5,6,7ilk üç-dört nedenleri arasında. Candida kan dolaşımına enfeksiyonların yıllık genel sayısı ~ 400.000 talepleriyle ilişkili Scotlan 46-%75¹olduğu tahmin edilmektedir. Kandidiyazis nedeniyle yıllık mortalite yaklaşık 10.000 ABD tek başına olduğunu. NID mantarlar tarafından neden olduğu ölçüde astronomik hasta giderleri⁵' da yansıtılır. Amerika Birleşik Devletleri'nde, yıllık masraf invazif mantar enfeksiyonları tedavisi için $2 milyar, zaten aşırı yüklenmiş sağlık sistemi için çok büyük bir yük ekleyerek aşan. Şu anda, mevcut standart antifungal tedavilerin toksisite, giderek yaygın ilaç direnci ve ilaç-ilaç etkileşimleri nedeniyle sınırlıdır. Bu nedenle, yüksek riskli hastalar için daha iyi tedavi seçenekleri neden olur yeni antifungal ilaç hedefler belirlemek için acil bir ihtiyaç vardır. Ancak, yeni ilaçlar mantar hedef üstünde hareket keşfi mantarlar ökaryotlarda olduğundan karmaşıktır. Bu büyük ölçüde özel mantar uyuşturucu hedef sayısını sınırlar.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda mitokondri hücresel solunum, oksidatif metabolizma, sinyal iletimi ve apoptosis^{8 için önemli olduğundan mitokondri mantar virülans için önemli bir katkı ve antifungal ilaçlar için hoşgörü olduğunu belirttiler ,9,10,11}. Glycolytic ve glycolytic metabolizma C. albicans hayatta memeli ev sahibi^{12,13,14,15,16}için önemlidir. Ayrıca, birkaç C. albicans mutantlar mitokondrial proteinler, Goa1 gibi eksik Srr1, Gem1, Sam37 vb filamentation, bir önemli virülans faktörü C. albicans^17, arızalı olduğu gösterilmiştir ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22}. buna ek olarak, bu mutant Ayrıca, bir fare modeli virülans kandidiyazis^{17,18,19,20,21 Dissemine için zayıflatılmış gösterildi ,22}. Böylece, mantar mitokondri ilaç keşfi için cazip bir hedef gösterir. C. albicans mitokondrial genom yaşayamaz anlamına gelir petite negatif²³, çünkü ancak, C. albicans mitokondriyal işlevde çalışmanın meydan okuyor.

Burada, biz C. albicans mitokondrial ve glycolytic işlevinde mitokondri arındırmak için gerek kalmadan araştırmak için kullanılan bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem aynı zamanda genetik manipülasyon veya kimyasal modülatörler C. albicansmitokondrial ve glycolytic yollar üzerindeki etkisini araştırmak için optimize edilebilir.

Protokol

Not: Testin detaylı kademeli Protokolü aşağıda anlatılan ve şematik protokolü şekil 1' de gösterilen.

1. C. albicans suşları ve büyüme koşulları

1. C. albicans suşları sıvı Maya özü-pepton-dekstroz (YPD) orta 30 °C bir kuluçka shaker gecede büyümek.
   Not: Candida suşları donmuş hisse senetleri olarak korumak ve YPD agar (% 1 Maya ekstresi, % 2 pepton, %2 dekstroz ve %2 agar) büyümek.

2. reaktifler hazırlanması

1. Tahlil Orta şekilde hazırlayın:
   1. 1,04 g Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 tozu ve 2 gr glukoz (% 2) mitokondriyal işlev tahlil için çözmek 90 mL steril su ve sıcak ortam ile 37 ° c PH 5 M NaOH kullanarak 7.4 için ayarlamak ve ses seviyesi açma 100 mL steril su ile yapın.
   2. Glycolytic stres tahlil için 1,04 g RPMI 1640 toz 90 mL steril su yalnız dağıtılması, 37 ° C ortam sıcak ve pH 7.4 için ayarlayın. Sesini 100 mL steril su ile yapın. RPMI 1640 toz pH değişikliği sırasında tahlil Glikoliz bir ölçüsü olarak izlemek için önemlidir yok bikarbonat vardır.
2. Enjeksiyon bileşikler.
   1. Steril su ve mağaza-20 ° C'de 1 M glikoz hisse senedi hazırlamak
   2. 100 mM oligomycin stok Dimetil sülfoksit (DMSO), küçük miktarlar aliquot hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın
   3. 100 mM antimycin A stok DMSO, küçük miktarlar aliquot hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın
   4. 100 mM SHAM (salicylhydroxamic asit) stokta etanol tahlil gününde hazır olun.
   5. Testin gün 1 M KCN steril su hazırlamak.

3. kaplama tahlil plaka ile Poly-D-lizin (PDL)

Not: tüm yerine aşağıdaki adımları Laminer Hood.

1. Poly-D 50 µg/mL nihai toplama yapmak için lisin doku kültürü sınıf suda çözülür. İyi ve aliquot bir 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine karıştırın ve uzun vadede-20 ° C'de depolayın.
   Not: iyi başına 50 µL gereklidir ve 24 kuyular için 1.2 mL gereklidir. Bu nedenle, aliquot en az 1.3 mL microcentrifuge tüp başına.
2. İyi ücret 50 µL ekleyin ve 1-2 h için kapalı kapak ile oda sıcaklığında kuluçkaya.
3. Çözüm Aspire edin ve bir kez 500 µL steril doku kültürü sınıf su ile durulayın.
4. Kapağı açın ve hava Kuyu kuru izin. Plaka aynı gün veya mağaza 4 ° C'de en fazla 2-3 gün için kullanın.

4. hidrasyon sensör kartuş

Not: bir gün deneme önce bu adımı gerçekleştirin.

1. İlave akı tahlil Kit açın ve içeriğini kaldırın. Baş aşağı yanında yardımcı programı plaka (Şekil 2) sensör kartuşu yerleştirin.
2. Dolgu her yardımcı programı saçtan calibrant 1 mL ile iyi ve sensör kartuş geri yerleştirin. Fluorophores (oksijen ve pH ölçmek için) içeren sensörler içinde calibrant batık emin olun.
3. Sensör kartuşta gecede bir sigara-CO₂ kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya

5. büyüyen ve PDL kaplı plakalar hücrelerde tohumlama

1. C. albicans YPD et suyu içinde aşılamak ve gecede 200 devirde bir shaker 30 ° C'de büyür.
   Not: tahlil tasarım ve faiz dayanarak, C. albicans Ayrıca YPG veya en az orta yetiştirilir.
2. Tahlil günde 100 µL başına 100.000 hücre son bir konsantrasyon verim için tahlil orta hücrelerde uygun sayıda sulandırmak.
3. Tahlil plaka wells A1, B4, C3 ve hangi tahlil orta arka plan düzeltme (şekil 3) için sadece 100 µL eklemek D6 dışında her kuyuya seyreltilmiş hücre 100 µL ekleyin.
4. 60 dk, plaka yüzeyine bağlı hücreler olanak vermek için kuluçkaya ve sigara-CO₂ kuluçka 37 ° C'de plaka transfer.

6. tahlil Protokolü

Not: Burada özetlenen araç 24-şey biçimi için iletişim kuralıdır. Birimleri başka bir biçimde kullanılırsa ayarlanması gerekir.

1. Mitokondriyal işlev tahlil
   1. Bileşikler hazırlanması
      1. Bileşikleri, 10 x konsantrasyon mitokondriyal işlev tahlil için hazırlamak: 20 mM SHAM, 100 µM hazırlamak Oligomycin, 100 mM KCN ve 20 µM Antimycin A karşılık gelen tahlil orta.
      2. 50 µL SHAM A bağlantı noktası 55 µL içine eklemek Oligomycin bağlantı noktasına B, 62 µL C ve bağlantı noktasına KCN 68 µL Antimycin A D bağlantı (şekil 4).
2. Glycolytic stres tahlil
   1. Bileşikler hazırlanması
      1. Bileşikleri, 10 x konsantrasyon glycolytic stres tahlil için hazırlayın. 100 mM glikoz, 100 µM hazırlamak Oligomycin, 500 mM 2-Deoksi glikoz (2DG) ve 20 µM Antimycin A karşılık gelen tahlil orta.
      2. Bağlantı noktası A, 55 µL 50 µL glikoz Ekle Oligomycin bağlantı noktasına B, 62 µL 2-DG bağlantı noktasına C ve 68 µL Antimycin A bağlantı noktasına ö.
3. Hangi oksijen tüketim oranını (OCR) ve ekstraselüler asitleştirme oranı (D.H.T.) 24-şey plaka kartvizitlere canlı hücrelerin ilave akı Analyzer'ı kullanır. Tahlil Protokolü önceden ayarlayın.
4. İlave akı Analyzer'ı açın ve tahlil Sihirbazı sekmesini kullanarak tahlil şablon ayarlama ve kurulum sırasında pops dışarı tüm bilgileri doldurmak için adım adım talimat izleyin. Grup düzeni benzer olarak şekil 5' te gösterilen oluşturur. Protokolü Tablo 1' de gösterildiği gibi ayarlayın. Bu düzenleri önde önce tahlil ayarlayın ve bilgisayara kaydedin. Tahlil zaman kaydedilmiş Protokolü tahlil Sihirbazı sekmesinde (şekil 5) dosyasını açın seçeneğine karşılık gelen dosya açarak geri yükleyin.
5. Calibrant içeren sulu sensör kartuş ilgili bağlantı noktalarından 10 x bileşikler yük ve ilave akı analyzer taşıyıcı tepsisine yükleyin. Kalibrasyon ekranda Start düğmesine basarak başlatın.
6. Tahlil orta 350 µL yavaşça hücre plakasına son hacim 450 µL getirmek için hücre rahatsızlık en aza indirmek için kuyu tarafındaki ekleyin.
7. Calibrant tahlil plakalı içeren yeni plaka değiştirmek ve devam edin.
8. Bir kez tahlil tam sensör kartuş ve plaka çıkarın. Dosyayı uygun hedef klasöre kaydedin.

7. veri analizi

1. Eğri - Varyans analizi (AUC-ANOVA) analiz sekmesi yazılım alanında ilgili parametre (OCR veya D.H.T.) şekil 6' da gösterildiği gibi seçerek gruplar arasında anlamlı bir fark hesaplamak için kullanın.
2. Karşılaştırılacak grupları seçin.
3. İçin ANOVA analizi gruplara ekleyin ve Tamam' ı tıklatın.
   Not: Bu AUC ANOVA analizi hangi AUC her grup için hesaplanan ve ANOVA tarafından aralarında karşılaştırıldığında dosya yeni bir sayfa ekler. Bu önemini göstermek için p değerlerinin bir tablosu verecektir.

Sonuçlar

C. albicans ilave akı Çözümleyicisi tarafından değerlendirildi biyo-enerjetik işlevlerini belirlemek için bu iletişim kuralını odak noktasıdır. Mitokondrial protein Mam33 eksik bir C. albicans mutant Ayrıca onun tamamlayıcı zorlanma, mitokondriyal bir protein silme etkilerini OCR ve D.H.T. çalışmaya mam33Δ/Δ::MAM33 ile birlikte bulunur. MAM33 için sözde mitokondrial asidik matris protein kodlar ve Candida onun işlevinde ...

Tartışmalar

Bioenergetics mitokondriyal işlev oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ölçerek okumak için mükemmel bir araç olarak hizmet veren ilave akı tahlil-bağımlı oksijen tüketimi içinde gerçek-zaman. Buna ek olarak, bir hücre dışı asitleştirme oranı (ekstrasellüler pH değişikliği) olarak ölçülen glycolytic bir fonksiyonu da aynı anda gerçek zamanlı analiz soruşturma olmaktır.

PDL kaplamalı plakalar hücrelerde kuluçka izin verdiğinden tahlil plakasına uygun hücrelere

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Corning	MT50020PB
Antimycin A	Sigma	A8674
KCN
Mito stress kit	Agilent	103015-100
Oligomycin	Calbiochem	495455
pH meter	Accumet	AR20
Phenol red	Sigma	P5530
Poly-D lysine	Sigma	P6407
Rotenone	Santa cruz	203242
Seahorse XF24 FluxPak	Agilent	100850-001
SHAM
Sodium Chloride	Amresco	241
Sodium hydroxie pellets	J.T Baker	3722
Tissue culture grade water	Gibco	1523-0147
XF assay calibrant solution	Agilent	100840-000
Yeast extract Peptone Dextrose	Fisher scientific,	BP2469
Yeast extract Peptone Dextrose Agar	Sigma	A1296
Yeast extract Peptone Glycerol	Sigma	G2025