انسداد السفينتين الماوس النموذجي لضخه الاسكيمية الدماغي

Summary

نموذج الفأر من ضخه الاسكيمية الدماغي أنشئت للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية. ونحن ديستالي سد الشريان الدماغي الأوسط الحق والشريان السباتي المشترك الحق واستعادة تدفق الدم بعد 10 أو 40 دقيقة من الاسكيمية.

Abstract

في هذه الدراسة، يستخدم نموذج ماوس انسداد شريان دماغي الأوسط (MCA) لدراسة ضخه الاسكيمية الدماغي. مفيد نموذجا ماوس استنساخه وموثوق بها للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية لضخه الاسكيمية الدماغي وتحديد الاستراتيجيات العلاجية المحتملة بالنسبة للمرضى الذين يعانون من السكتة الدماغية. الاختلافات في التشريح لدائرة ويليس C57BL/6 الفئران يؤثر على حجم احتشاء بعد الإصابة الدماغية الاسكيمية--المستحثة. أشارت الدراسات إلى أن انسداد MCA القاصي (ماكاو) يمكن التغلب على هذه المشكلة ويؤدي إلى حجم احتشاء مستقرة. في هذه الدراسة، ونحن إنشاء نموذج ماوس انسداد السفينتين من ضخه الاسكيمية الدماغي عن طريق انقطاع تدفق الدم إلى MCA الحق. ونحن ديستالي اضطر MCA الأيمن والشريان السباتي المشترك الحق (CCA) واستعادة تدفق الدم بعد فترة معينة من الاسكيمية. هذه الإصابة ضخه الاسكيمية يستحث احتشاء حجم ثابت وعجز سلوكية. الخلايا المناعية المحيطية التسلل الدماغ الدماغية ضمن فترة تسلل ح 24. بالإضافة إلى ذلك، يتم فقدان الخلايا العصبية في منطقة القشرية أقل لمدة أطول من ضخه. ولذلك، هذا النموذج انسداد السفينتين مناسبة للتحقيق في الاستجابة المناعية والعصبية الانتعاش خلال فترة ضخه بعد الاسكيمية الدماغي.

Introduction

الطراز الماوس ضخه الاسكيمية الدماغي أحد النهج التجريبي الأكثر استخداماً للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية ل الإصابات الناجمة عن الاسكيمية الدماغ¹. لأنه ينشط ضخه الاسكيمية الدماغي المناعي المحيطية، الخلايا المناعية المحيطية التسلل إلى الدماغ الدماغية ويسبب تلف الخلايا العصبية². وهكذا، نموذجا لماوس موثوقة واستنساخه يحاكي ضخه الاسكيمية الدماغي مطلوب لفهم الفسيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية.

الفئران (B6) C57BL/6J هي سلالة الأكثر استخداماً في التجارب السكتة الدماغية نظراً لأنها يمكن بسهولة أن يكون وراثيا معالجته. تتوفر نماذج مشتركة اثنين من ماكاو/الاكسجينيه التي تحاكي حالة ضخه الاسكيمية الدماغي. الأول هو نموذج الشعيرة intraluminal الدانية ماكاو، حيث يعمل خيوط المغلفة بالسيليكون إينترافاسكولارلي أوككلودي تدفق الدم في هيئة مكافحة الاحتكارات؛ بعد ذلك يتم إزالة خيوط أوككلودينج لاستعادة تدفق الدم³. مدة قصيرة انسداد يؤدي آفة من منطقة subcortical، بينما أطول مدة انسداد يسبب الاحتشاءات في المناطق القشرية وسوبكورتيكال. النموذج الثاني هو نموذج ربط مكاو القاصي، الذي ينطوي على ربط اكسترافاسكولار MCA والتقييم القطري المشترك للحد من تدفق الدم من خلال هيئة مكافحة الاحتكارات، بعدها يتم استعادة تدفق الدم عن طريق إزالة مقطع خياطة الجروح والأوعية الدموية⁴. في هذا النموذج، بسبب احتشاء في المناطق القشرية، ومعدل وفيات منخفض. لأنه يتطلب ربط نموذج ماكاو/ضخه كرانيكتومي لفضح موقع MCA القاصي، يمكن تأكيد الموقع بسهولة، ودراسة ما إذا كان تدفق الدم في MCA القاصي تتعطل أثناء الإجراء واضح ومباشر.

B6 الفئران تظهر اختلافات كبيرة في التشريح لدائرة ويليس؛ وهذا قد يؤثر على حجم احتشاء بعد ضخه الاسكيمية الدماغي^5،،من⁶⁷. حاليا، يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق ربط MCA القاصي⁸. في هذه الدراسة، علينا أن ننشئ أسلوب أوككلودينج تدفق الدم MCA وتمكين ضخه بعد فترة محددة سلفا من الاسكيمية. انسداد السفينتين من طراز ضخه الاسكيمية الدماغي يستحث الاسكيمية العابرة لإقليم اتحاد الماليزيين الصينيين من خلال ربط MCA القاصي الحق والحق التقييم القطري المشترك، مع تدفق الدم المستعادة بعد فترة معينة من الاسكيمية. يدفع هذا النموذج ماكاو/ضخه احتشاء حجم مستقر، والجزء الأكبر من التسلل إلى الدماغ الخلايا المناعية في الدماغ الدماغية، وعجز سلوكية بعد الاسكيمية الدماغي – ضخه⁴.

Protocol

رعاية الحيوان المؤسسية واللجان استخدام سينيكا وجامعة الطب تايبيه أقرت هذا البروتوكول لاستخدام الحيوانات التجريبية.

1-نموذج مكاو/ضخه

1. توفر الفئران مع حرية الوصول إلى المياه وتشو حتى الجراحة.
2. اﻷوتوكﻻف الجراحية أدوات وتطهير الجدول جراحة ومعدات استخدام الإيثانول 70%. ارتداء قناع جراحي والقفازات المعقمة. استخدام معقم جاف حبة إلى ريستيريليزي الأدوات الجراحية إذا كان سيجري عملية جراحية الماوس متعددة في تجربة واحدة.
3. تخدير ماوس 8-12 أسبوع (الشامل: ز 25 – 30) باستخدام نسبة 0.8% كلورال هيدرات، عن طريق حقنه داخل. تأكد من أن الماوس أنيسثيتيزيد ليس لديه منعكس دواسة (كاختبار باستخدام قرصه إصبع القدم ثابت) بعد أنيسثيتيزيشن.
4. استخدم مرهم البيطرية لمنع جفاف العين للماوس في حين أنها تحت التخدير.
5. استخدام نظام موسع من ضغط الدم لمراقبة ضغط الدم للماوس.
6. استخدام نظام رصد فسيولوجية لرصد درجة حرارة المستقيم وغازات الدم الشرياني. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 36.5 ± 0.5 درجة مئوية.
7. حقن تحت الجلد الماوس مع المضادات الحيوية الاتقائية (سيفازولين 25 مغ/كغ)⁸.
8. ضع الماوس في موقف ضعيف على منصة التدفئة.
9. استخدام مقص كهربائي لفضح الجلد قبل الحلاقة الفراء الماوس على منطقة الرقبة البطني، وكذلك في المنطقة بين العين اليمنى والإذن اليمنى.
10. استخدم كريم نتف الشعر لمسح الفراء من الهيئة للماوس وتطهير الموقع الجراحي بالتناوب سكربوس مع بوفيديوني-اليود وايثانول 70%.
11. استخدام قزحية مقص لقص شق 1 سم طوله خط الوسط في الرقبة.
12. استخدام الملقط آيريس بعناية تشريح التقييمات القطرية المشتركة خالية من الأعصاب المبهم دون التسبب في إصابات جسدية.
13. استخدام خيوط الحرير 5-0 لعزل التقييم القطري المشترك.
14. جعل شق 0.3 سم في فروة الرأس في نقطة الوسط بين العين اليمنى والإذن اليمنى.
15. استخدم ميكروسسيسورس لقطع العضلات temporalis لفضح عظم زيجوماتيك وسكواموسال.
16. تحت مجهر تشريح ستيريو، استخدام ميكرودريل لإنشاء حفرة قطرها مم 2 مباشرة عبر MCA القاصي في الجانب الأيمن.
17. اضطر جذع MCA القاصي الجانب الأيمن باستخدام خياطة 10-0.
18. أوككلودي الجانب الأيمن التقييم القطري المشترك باستخدام مقطع الأوعية الدموية نونتروماتيك.
19. بعد 10 أو 40 دقيقة من الاسكيمية، إزالة مقاطع تمدد الأوعية الدموية وخياطة لاستعادة تدفق الدم لاتحاد الماليزيين الصينيين، والتقييم القطري المشترك.
20. استخدام قصاصة خياطة لختم شق الجلد على رأسه.
21. ختم شقوق الجلد سرطان عنق الرحم باستخدام خياطة واحد متبوعاً بإغلاق الجلد العنق بخياطة أو دبوس⁹.
22. تحت الجلد حقن البوبرينورفين (0.1 مغ/كغ) ل تخفيف الألم⁹.
23. الحفاظ على درجة حرارة الجسم للماوس عند 36.5 ± 0.5 درجة مئوية على لوحة تدفئة حتى أنه تعافي تماما من التخدير. لا يعود الحيوان الذي خضع لجراحة لشركة الحيوانات الأخرى حتى أنه تعافي تماما. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى أنه يستعيد وعيه كافية.
24. ضع الماوس في قفص يعقم كيما يمكن بحرية الوصول إلى المياه وتشو بعد قد تعافي تماما.

2-تلوين مع كلوريد 2,3,5-تريفينيلتيترازوليوم

1. تخدير الماوس مع 0.8% كلورال هيدرات عن طريق حقنه داخل.
2. استخدام مقص التشغيل لقطع رأس الحيوان.
3. كشف الجمجمة باستخدام مقص آيريس جعل شق في جلد الرأس.
4. استخدام مقص التشغيل لقطع الأمامي لعظم جبهي.
5. استخدام قزحية مقص لقص الجمجمة على طول خياطة السهمي.
6. استخدام رونجيور العظام دفع جانبا أمامي والعظم الجداري وفضح الدماغ.
7. استخدام الملقط آيريس لتشريح الدماغ.
8. استخدام مصفوفة الدماغ ماوس وشفرات الحلاقة للحصول على شرائح الاكليلية 2 مم.
9. وصمة عار المخ الشرائح من 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع كلوريد 2% 2,3,5-تريفينيلتيترازوليوم (TTC) في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة.
10. شطف الدماغ 2 x مع الفورمالين 10%.
11. إصلاح الدماغ في الفورمالين 10% في درجة حرارة الغرفة ح 24.

3-قياس حجم احتشاء

1. ترتيب الأقسام على شريحة بلاستيكية نظيفة وتوجيه الفروع من روسترال إلى والذيلية.
2. تفحص الشريحة باستخدام ماسح ضوئي. ضع مسطرة مترية وتأكد من أنها تظهر في الصورة الممسوحة ضوئياً. اقلب الشريحة وتفحص الجانب المعاكس.
3. حساب مساحة احتشاء كل مقطع باستخدام البرمجيات إيماجيج.
   1. افتح ملف الصورة، وقم بإعداد جدول للصورة.
   2. استخدام التحديد اليدوي لتحديد منطقة احتشاء.
   3. استخدام مناطق مدير مصلحة (ROI) لقياس مجال الاهتمام.
4. مجموع المناطق احتشاء لكل قسم وضرب الناتج في سمك الفرع لتقدير حجم احتشاء الكلية.

4. تحليل إحصائي

1. استخدام 6 بريزم جرافباد لتحديد الدلالة الإحصائية مع الطالب t-اختبار.
   ملاحظة: تمثل مجالات الخطأ على الرسوم البيانية بار الأخطاء المعيارية للوسط (SEMs).
2. استخدام ز * 3.1 السلطة لحساب حجم العينة المناسب وإجراء تحليل طاقة¹⁰.

النتائج

تنتج من احتشاء القشرية محيط MCA الحق هذا الإجراء ماكاو/ضخه وتسبب عجزا سلوكية. درجات مختلفة من حجم احتشاء المستحثة الاسكيمية (الشكل 1 أ، ب) وفقدان الخلايا العصبية (الشكل 1، د) تم إنشاؤها في قشرة الدماغ من منطقة MCA الحق عن طريق ...

Discussion

نموذج الماوس ماكاو/ضخه نموذج حيوانية المستخدمة عادة لتقليد الاسكيمية العابرة في البشر. يمكن تطبيق هذا النموذج الحيواني لسلالات الفئران المحورة وراثيا والضربة القاضية للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية. عدة خطوات في البروتوكول أهمية خاصة. (1 ميكرودريل) يجب أن تستخدم بعناية عن...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone rongeur	Diener		Friedman
Buprenorphine	Sigma	B-044
Cefazolin	Sigma	1097603
Chloral hydrate	Sigma	C8383
Dissection microscope	Nikon	SMZ-745
Electric clippers	Petpro
10% formalin	Sigma	F5304
Germinator dry bead sterilizer	Braintree Scientific
Iris Forceps	Karl Klappenecker		10 cm
Iris Scissors	Diener		9 cm
Iris Scissors STR	Karl Klappenecker		11 cm
Microdrill	Stoelting	FOREEDOM K.1070
Micro-scissors-Vannas	HEISS	H-4240	blade 7mm, 8 cm
Mouse brain matrix	World Precision Instruments
Non-invasive blood pressure system	Muromachi	MK-2000ST
Operating Scissors STR	Karl Klappenecker		14 cm
Physiological Monitoring System	Harvard Apparatus
Razor blades	Ever-Ready
Stoelting Rodent Warmers	Stoelting	53810	Heating pad
Suture clip	Stoelting
Tweezers	IDEALTEK		No.3
Vetbond	3M	15672	Surgical glue
10-0 suture	UNIK	NT0410
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877