Два судна окклюзии модель мыши церебральной ишемии-реперфузии

Резюме

Для расследования патофизиологии инсульта создана модель мыши церебральной ишемии-реперфузии. Мы дистально перевязать право средней мозговой артерии и правой общей сонной артерии и восстановления кровотока после 10 или 40 мин ишемии.

Аннотация

В этом исследовании модель мыши окклюзии средней мозговой артерии (MCA) используется для изучения церебральной ишемии реперфузии. Воспроизводимость и надежную мышь модель полезна для изучения патофизиологии церебральной ишемии реперфузии и определения потенциальных терапевтических стратегий для больных с инсультом. Вариации в анатомии круг Уиллис C57BL/6 мышей влияет на объем их инфаркте после травмы головного мозга индуцированной ишемии. Исследования показали, что дистального прикуса MCA (СМАо) может преодолеть эту проблему и привести к стабильной инфаркте размер. В этом исследовании мы создать модель мыши двух сосудистой окклюзии церебральной ишемии-реперфузии через прерывание потока крови к правой MCA. Мы дистально перевязать правый MCA и правой общей сонной артерии (ОСО) и восстановление кровообращения после определенного периода ишемии. Эта травма ишемии реперфузии индуцирует инфаркте стабильный размер и поведенческих дефицита. Периферические иммунных клеток проникнуть ишемии мозга в течение периода 24 h инфильтрации. Кроме того нейронов потери в области коры меньше на более длительный срок реперфузии. Таким образом эта модель двух судно окклюзии подходит для исследования иммунного ответа и нейрональных восстановления во время периода реперфузии после церебральной ишемии.

Введение

Церебральной ишемии реперфузии мыши модель является одним из наиболее широко используемых экспериментальных подходов для изучения патофизиологии индуцированной ишемии мозга травмы¹. Потому что церебральной ишемии реперфузии активирует периферийных иммунной системы, периферической иммунные клетки проникнуть в ишемии мозга и вызвать повреждения нейронов². Таким образом надежных и воспроизводимых мыши модель, которая имитирует церебральной ишемии реперфузии требуется понимать патофизиологию инсульта.

Мышей C57Bl/6J (B6) являются наиболее часто используемые штамм в ход экспериментов, потому что они легко могут быть генетически манипулировать. Имеются две общие модели СМАо/реперфузии, которые имитируют состояние церебральной ишемии реперфузии. Во-первых, модель накаливания внутрипросветная проксимальной СМАо, где накаливания с покрытием кремния используется для intravascularly загородить кровотока в МКА; для восстановления крови поток³впоследствии удаляется наложения накаливания. Продолжительность короткого окклюзии приводит поражением подкорковых региона, тогда как продолжительность окклюзии причины инфарктов в корковых и подкорковых областях. Вторая модель является моделью лигирование дистальной СМАо, которая включает внесосудистой лигирование MCA и ОСО, чтобы уменьшить приток крови через MCA, после чего поток крови восстанавливается путем удаления швов и аневризмы клип⁴. В этой модели инфаркте вызывается в корковых областях, и отмечается низкий коэффициент смертности. Потому что перевязка СМАо/реперфузия модели требует Краниэктомия подвергать сайт дистальной MCA, сайт может быть легко подтверждено, и изучения ли поток крови в дистальной MCA нарушается во время процедуры является простым.

B6 мышей демонстрируют значительные вариации в анатомии их круг Уиллис; Это может повлиять на объем инфаркте, после церебральной ишемии реперфузии^5,6,7. В настоящее время этой проблемы могут быть преодолены путем перевязки дистальной MCA⁸. В этом исследовании мы создать метод для поглощения MCA приток крови и позволяет реперфузии после определенного периода ишемии. Два судна окклюзии церебральной ишемии реперфузии модели индуцирует переходных ишемии MCA территории путем перевязки право дистальной MCA и правой ОСО, с потоком крови, восстановлен после определенного периода ишемии. Эта модель СМАо/реперфузия индуцирует инфаркте стабильный размер, основная часть проникают в мозг иммунные клетки в ишемии мозга и поведенческих дефицита после церебральной ишемии реперфузии⁴.

протокол

Институционального ухода за животными и использования комитетов Синика и Тайбэйского медицинского университета одобрил этот протокол для использования экспериментальных животных.

1. СМАо/реперфузия модель

1. Предоставить свободный доступ к вода и Чоу мышей до операции.
2. Автоклав, хирургические инструменты и дезинфицировать хирургии таблицы и оборудования с использованием 70% этиловом спирте. Одежда хирургическая маска и стерильные перчатки. Используйте сухой шарик стерилизатор для resterilize хирургические инструменты, если несколько операций мыши будет проводиться в одном эксперименте.
3. Анестезировать 8 - до 12-недельных мыши (массовые: 25-30 г) с помощью хлораль гидрата 0,8%, через внутрибрюшинной инъекции. Убедитесь, что наркотизированных мышь не имеет педали рефлекс (как испытания с использованием щепотку фирмы мыс) после анестезии.
4. Используйте мазь ветеринар для предотвращения сухости глаз для мыши, в то время как он находится под наркозом.
5. Используйте систему неинвазивного артериального давления для контроля артериального давления мыши.
6. Используйте физиологические системы мониторинга для контроля за его ректальной температуры и газы артериальной крови. Поддержания температуры тела на 36,5 ± 0.5 ° C.
7. Подкожно вводить мышь с профилактического Антибиотик (25 мг/кг Цефазолин)⁸.
8. Поместите указатель мыши в лежачем положении на грелку.
9. Используйте Электрические ножницы подвергать кожу после бритья меха мыши на области брюшной шеи, а также в регионе между правым глазом и правого уха.
10. Используйте крем эпиляции чтобы очистить мех от мыши тело и дезинфекция хирургические сайт, чередуя scrbus с povidione йода и 70% этиловом спирте.
11. Используйте Ирис ножницы, чтобы вырезать 1 см длиной срединной линии разреза на шее.
12. Используйте корнцанг Ирис тщательно анализировать ОСО от блуждающих нервов без причинения телесных повреждений.
13. Используйте шелковыми швами 5-0, чтобы изолировать ОАС.
14. Сделайте надрез 0,3 см в волосистой части головы на середину между правым глазом и правого уха.
15. Используйте microscissors для резки височной мышцы подвергать squamosal и скуловой кости.
16. Под микроскопом стерео рассечения используйте microdrill для создания 2 мм в диаметре отверстия непосредственно над дистальной MCA справа.
17. Перевязать стволе справа дистальной MCA с использованием шва 10-0.
18. Загородить справа ОАС, используя клип нетравматических аневризмы.
19. После 10 или 40 мин ишемии удалите клипов аневризм и шовный материал для восстановления кровотока в MCA и ОАС.
20. Используйте зажим шовный материал для герметизации разрез кожи на голове.
21. Печать разрезов шейки матки кожи, с использованием единого шва после закрытия кожи шеи с швом или основных⁹.
22. Подкожно вводить бупренорфин (0,1 мг/кг) для боли помощи⁹.
23. Поддерживать температуру тела мыши на 36,5 ± 0,5 ° C на грелке, до тех пор, пока он полностью оправился от анестезии. Не вернуть животное, которое претерпел хирургии в компании других животных до тех пор, пока он полностью выздоровел. Не оставляйте животное без присмотра, до тех пор, пока он приходит в сознание достаточно.
24. Поместите курсор мыши в газобетона клетку, так что он может свободно доступ к воде и Чоу после того, как он полностью выздоровел.

2. окрашивание с 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорид

1. Анестезировать мыши с хлораль гидрата 0,8% через внутрибрюшинной инъекции.
2. Использование операционной ножницы, чтобы обезглавить животного.
3. Разоблачить черепа с помощью ножниц Ирис сделать разрез в коже головы.
4. Использование операционной ножницы, чтобы вырезать передней лобной кости.
5. Используйте Ирис ножницы, чтобы вырезать череп вдоль Сагиттальный шов.
6. Использование костей rongeur отодвинуть в сторону лобной и теменной кости и подвергнуть мозг.
7. Используйте корнцанг Ирис вскрыть мозга.
8. Для получения 2 мм корональные срезы можно используйте матрицу мозга мыши и лезвия.
9. Пятно срезы мозга для 10 минут при 37 ° C с 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорид (TTC) в 1 x фосфат амортизированное saline.
10. Промыть мозг 2 x с формалина 10%.
11. Исправьте мозга в формалина 10% при комнатной температуре в течение 24 ч.

3. измерение размер infarct

1. Расположить разделы на слайде чистые пластиковые и ориентировать разделы с ростральной хвостовой.
2. Сканирование слайдов с использованием сканера. Место метрические линейки и убедитесь, что она видна в отсканированного изображения. Переверните слайд и сканировать обратную сторону.
3. Вычислите площадь миокарда каждого раздела с помощью ImageJ программного обеспечения.
   1. Открыть файл изображения и настроить масштаб изображения.
   2. Используйте руки выбора для выбора области при инфаркте.
   3. Регионы интереса (ROI) менеджер используйте для измерения области интересов.
4. Сумма области миокарда для каждого раздела и умножьте результат на толщина среза для оценки объема всего миокарда.

4. Статистический анализ

1. Использование GraphPad Призма 6 для определения статистической значимости с студента t-теста.
   Примечание: Погрешностей на гистограммы представляют собой стандартные ошибки среднего (SEMs).
2. Использование G * мощность 3.1 для расчета размера соответствующей выборки и выполнять анализ питания¹⁰.

Результаты

Эта процедура СМАо/реперфузия производства корковых инфаркте вблизи правом MCA и причиной дефицита поведения. Различные степени индуцированной ишемии при инфаркте громкости (рис. 1AB) и нейрональных потери (рис. 1 cD) были...

Обсуждение

СМАо/реперфузия мыши модель является моделью животных обычно используются для имитации переходных ишемии в организме человека. Это животное модель может применяться нокаут и трансгенных мышей штаммов для изучения патофизиологии инсульта. Особенно важны несколько шагов в протоколе. (...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone rongeur	Diener		Friedman
Buprenorphine	Sigma	B-044
Cefazolin	Sigma	1097603
Chloral hydrate	Sigma	C8383
Dissection microscope	Nikon	SMZ-745
Electric clippers	Petpro
10% formalin	Sigma	F5304
Germinator dry bead sterilizer	Braintree Scientific
Iris Forceps	Karl Klappenecker		10 cm
Iris Scissors	Diener		9 cm
Iris Scissors STR	Karl Klappenecker		11 cm
Microdrill	Stoelting	FOREEDOM K.1070
Micro-scissors-Vannas	HEISS	H-4240	blade 7mm, 8 cm
Mouse brain matrix	World Precision Instruments
Non-invasive blood pressure system	Muromachi	MK-2000ST
Operating Scissors STR	Karl Klappenecker		14 cm
Physiological Monitoring System	Harvard Apparatus
Razor blades	Ever-Ready
Stoelting Rodent Warmers	Stoelting	53810	Heating pad
Suture clip	Stoelting
Tweezers	IDEALTEK		No.3
Vetbond	3M	15672	Surgical glue
10-0 suture	UNIK	NT0410
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877