JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Serebral iskemi-reperfüzyon bir fare modeli kontur Patofizyoloji araştırmak için kuruldu. Klemple sağ orta serebral arter ve şu ortak Karotid arter ligate ve kan akımı iskemi 10-40 dakika sonra geri yükleme.

Özet

Bu çalışmada, bir orta serebral arter (MCA) tıkanıklığı fare modeli serebral iskemi-reperfüzyon çalışmaya istihdam edilmektedir. Bir tekrarlanabilir ve güvenilir fare modeli serebral iskemi-reperfüzyon Patofizyoloji araştıran ve kontur olan hastalar için potansiyel tedavi stratejileri belirlemek için yararlıdır. Anatomi varyasyonları Willis C57BL/6 fareler çemberi serebral iskemi indüklenen yaralanma sonra onların enfarktüsü birimi etkiler. Çalışmalar bu distal MCA tıkanıklığı (MCAO) bu sorunun üstesinden gelmek ve istikrarlı enfarktüsü boyutunda neden belirttiler. Bu çalışmada, serebral iskemi-reperfüzyon doğru MCA için kan akımı kesintiye aracılığıyla bir iki-damar tıkanıklığı fare modeli kurmak. Klemple doğru MCA ve şu ortak Karotid arter (CCA) ligate ve kan akımı iskemi belirli bir süre sonra geri yükleme. Bu iskemi-reperfüzyon hasarı bir enfarktüsü ve istikrarlı boyutu ve davranışsal bir açığı neden olmaktadır. Periferik bağışıklık hücreleri iskemik beyin 24 h infiltrasyon süresi içinde sızmak. Ayrıca, kortikal alanı nöronal kaybına daha uzun bir reperfüzyon süre için azdır. Bu nedenle, bu iki-damar tıkanıklığı model sonra serebral iskemi reperfüzyon döneminde bağışıklık yanıtı ve nöronal kurtarma soruşturma için uygundur.

Giriş

Serebral iskemi-reperfüzyon fare modeli beyin iskemi indüklenen yaralanma1Patofizyoloji soruşturma için en çok kullanılan deneysel yaklaşımlar biridir. Serebral iskemi-reperfüzyon periferik bağışıklık sistemi aktive periferik bağışıklık hücreleri iskemik beyin sızmak ve nöronal hasar2çünkü. Böylece, serebral iskemi-reperfüzyon taklit eden bir güvenilir ve tekrarlanabilir fare modeli kontur Patofizyoloji anlamak için gereklidir.

C57BL/6J (B6) fareler en sık kullanılan zorlanma kontur deneylerde olduklarından, genetik olarak kolayca yönetilebilir. Serebral iskemi-reperfüzyon durumunu taklit iki ortak MCAO/reperfüzyon modelleri mevcuttur. Ilk proksimal MCAO, nerede bir silikon kaplı filament intravascularly MCA kan akışında doldurmak için istihdam intraluminal filaman modeldir; occluding filaman kan akışı3geri yüklemek için daha sonra kaldırılır. Daha uzun bir tıkanıklığı süre infarkt kortikal ve subcortical alanlarında neden olur, ancak kısa tıkanıklığı süresi subcortical bölgesinin bir lezyon oluşur. İkinci model MCA ve CCA sonra dikiş ve anevrizma klip4kaldırılması kan akışını geri yüklenir MCA yoluyla kan akışını azaltmak için extravascular ligasyon içerir distal MCAO tüp ligasyonu modeldir. Bu modelde, bir enfarktüsü kortikal bölgelerde neden olur ve ölüm oranı düşüktür. MCAO/reperfüzyon modeli ligasyonu distal MCA sitenin ortaya çıkarmak için Kraniyektomi gerektirdiğinden, site kolayca teyit edilmesi ve distal MCA kan akışında işlem sırasında bozulur olup olmadığını inceleyerek basittir.

B6 fareler anatomisini önemli değişimler Willis onların dairenin sergi; Bu serebral iskemi-reperfüzyon5,6,7takip enfarktüsü birim etkileyebilir. Şu anda, bu sorun distal MCA8ligasyonu ile aşılabilir. Bu çalışmada, MCA kan akımı occluding ve önceden belirlenmiş bir süre iskemi reperfüzyon sağlayan bir yöntem oluşturun. İki damar tıkanıklığı serebral iskemi-reperfüzyon modelinin MCA bölgenin sağ distal MCA ve doğru CCA, tüp ligasyonu ile geçici iskemi kan akımı iskemi belirli bir süre sonra geri ile neden olmaktadır. Bu MCAO/reperfüzyon model bir enfarktüsü istikrarlı boyutu, bir toplu iskemik beyin ve davranış bir açığı beyin infiltre bağışıklık hücreleri ve serebral iskemi-reperfüzyon4' ten sonra neden olmaktadır.

Protokol

Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler Academia Sinica ve Taipei Tıp Üniversitesi deneysel hayvan kullanımı için bu protokolü onayladı.

1. MCAO/reperfüzyon modeli

  1. Fareler ameliyat kadar su ve yemek için ücretsiz erişim sağlar.
  2. Otoklav cerrahi araçları ve cerrahi tablo ve % 70 etanol kullanarak ekipman sterilize. Ameliyat maskesi ve steril eldiven giymek. Eğer birden çok fare ameliyatları bir deneyde yapılan cerrahi araçlar resterilize için Kuru boncuk Sterilizatör kullanın.
  3. Bir 8 - için 12-hafta-yaşlı fare anestezi (kitle: 25 – 30 g) % 0.8 kloral hidrat, mayi bir enjeksiyon yoluyla kullanarak. İmzalat fareyi bir pedal refleks (bir firma ayak çimdik kullanarak test gibi) sonra anesthetization yok emin olun.
  4. Veteriner merhem anestezi altında iken fare göz kuruluğu önlemek için kullanın.
  5. Bir noninvaziv kan basıncı sistemi fare kan basıncını izlemek için kullanın.
  6. Fizyolojik bir izleme sistemi, rektal ısı ve arteriyel kan gazı izlemek için kullanın. 36,5 ±, vücut ısısını korumak 0.5 ° C.
  7. Subkutan fare profilaktik antibiyotik (25 mg/kg sülfadiyazin)8ile enjekte et.
  8. Sırtüstü pozisyonda Isıtma Yastığını üzerine fareyi getirin.
  9. Elektrik makası cilt fare kürk ventral boyun bölgesindeki yanı sıra sağ gözü ve sağ kulak arasındaki bölgede tıraş tarafından ortaya çıkarmak için kullanın.
  10. Fare vücuttan kürk temizleyin ve scrbus povidione-iyot ve % 70 etanol ile dönüşümlü olarak cerrahi sitesi dezenfekte için epilasyon kremi kullanın.
  11. Iris makas 1 cm uzunluğundaki Ensizyon ensenden kesmek için kullanın.
  12. Iris forseps fiziksel yaralanma neden olmadan vagus sinir ücretsiz CCA dikkatle incelemek için kullanın.
  13. 5-0 ipek sütür CCA belirlemek için kullanın.
  14. 0,3 cm kesi kafa derisi, sağ gözü ile sağ kulak arasındaki orta nokta olun.
  15. Elmacık ve squamosal kemik ortaya çıkarmak için temporalis kas kesmek için microscissors kullanın.
  16. Stereo diseksiyon mikroskop altında bir microdrill doğrudan sağ distal MCA üzerinde 2 mm çapında delik oluşturmak için kullanın.
  17. 10-0 dikiş kullanarak sağ distal MCA gövdesine ligate.
  18. Nontraumatic anevrizma klipi kullanarak sağdaki CCA doldurmak.
  19. İskemi 10 veya 40 dakika sonra anevrizma klipleri ve kan akımı MCA ve CCA getirmek için dikiş kaldırın.
  20. Bir dikiş klip baş cilt kesi mühürlemek için kullanın.
  21. Boyun deri dikiş veya zımba9ile kapatarak takip tek dikiş kullanarak servikal cilt kesi kapatın.
  22. Subkutan buprenorfin (0.1 mg/kg) ağrı Rölyef9için enjekte et.
  23. Tam anesteziden kurtarıldı kadar fare vücut sıcaklığı 36,5 ± 0,5 ° C Isıtma yastığını korumak. Tamamen iyileşmiş kadar ameliyat için şirketin diğer hayvanların geçirmiştir hayvan döndürmüyor. Yeterli bilincinin tekrar yerine geleceğinden hayvan başıboş bırakmayın.
  24. Böylece serbestçe su erişmek ve tam olarak kurtarıldı sonra yutar fare autoclaved kafesin içine yerleştirin.

2. 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür ile boyama

  1. Fare ile % 0.8 kloral hidrat mayi iğne ile anestezi.
  2. İşletim makas hayvan başını kesmek için kullanın.
  3. Kafatası bir kesik baş cilt içinde yapmak Iris makas kullanarak açarsınız.
  4. İşletim makas ön frontal kemik kesmek için kullanın.
  5. Iris makas kafatası sagittal dikiş boyunca kesmek için kullanın.
  6. Bir kemik rongeur bir kenara alın ve Paryetal kemik itmek ve beyin ortaya çıkarmak için kullanın.
  7. Iris forseps beyin incelemek için kullanın.
  8. Fare beyin matris ve jilet 2 mm koronal dilimleri elde etmek için kullanın.
  9. 1 fosfat tamponlu tuz x %2 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) ile 37 ° C'de 10 dakika için beyin dilimleri leke.
  10. Beyin 2 durulama x % 10 formalin ile.
  11. % 10 formalin, oda sıcaklığında 24 h için beyinde düzeltmek.

3. enfarktüsü boyut ölçümü

  1. Temiz plastik Slayt üzerindeki bölümleri düzenlemek ve rostral bölümlerden Kaudal için yönlendirmek.
  2. Bir tarayıcı kullanarak slayt tarama. Metrik bir cetvel yerleştirin ve Taranan görüntüde görünür olduğundan emin olun. Slayt ters çevirin ve yan ters inceden inceye gözden geçirmek.
  3. ImageJ yazılımını kullanarak her bölümün infarktüsü alanını hesaplamak.
    1. Görüntü dosyasını açın ve görüntü ölçeği ayarlayın.
    2. Serbest seçim enfarktüsü alanı seçmek için kullanın.
    3. Faiz (ROI) Yöneticisi bölgelerinde ilgi alanı ölçmek için kullanın.
  4. Her bölüm için enfarkt alanları toplamı ve sonucu toplam infarktüsü birim tahmin etmek için bölüm kalınlığı tarafından çarpın.

4. istatistiksel analiz

  1. GraphPad prizma 6 öğrencinin tile istatistiksel anlamlılık belirlemek için kullanın-test.
    Not: Standart hataları değerlerin ortalamasının (SEM) bar grafikler üzerindeki hata çubukları temsil ediyor.
  2. Kullanım G * güç uygun örnek boyutu hesapla ve güç analizi10gerçekleştirmek için 3.1.

Sonuçlar

Bu MCAO/reperfüzyon yordamı bir kortikal enfarktüsü doğru MCA çevresinde üretilen ve davranışsal bir açığı neden oldu. İskemi indüklenen enfarktüsü birim (şekil 1AB) ve nöronal kaybı (şekil 1 cD) farklı derecelerde bir artışı ligasyonu süresi ile doğru MCA çevrenin beyin korteksi oluşturulmuş. Bu MCAO/reperfüzyon hasarı hayvanın Lokomotor aktivite, 48 h MCAO/reper...

Tartışmalar

MCAO/reperfüzyon fare modeli yaygın insanlarda geçici iskemi taklit etmek için istihdam hayvan bir modeldir. Bu hayvan modeli transgenik ve nakavt fareler suşları için kontur Patofizyoloji araştırmak için uygulanabilir. İletişim kuralı birkaç adımda özellikle önemlidir. (1 microdrill dikkatli bir delik ile uygunsuz eylem kolayca MCA kanama neden kafatasında, oluşturulurken kullanılan gerekir. (2) MCA bozuk ve kanama önce ve sonra ligasyonu yordam kaçınılmalıdır. MCA hasar reperfüzyon iskemik be...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Bakanlığı bilim ve teknoloji, Tayvan (en 106-2320-B-038-024, en 105-2221-E-038-007-MY3 ve en 104-2320-B-424-001) ve Taipei Tıp Üniversitesi Hastanesi (107TMUH-SP-01) tarafından desteklenmiştir. Bu el yazması Wallace akademik düzenleyerek düzenlendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Bone rongeurDienerFriedman
BuprenorphineSigmaB-044
CefazolinSigma1097603
Chloral hydrateSigmaC8383
Dissection microscopeNikonSMZ-745
Electric clippersPetpro
10% formalinSigmaF5304
Germinator dry bead sterilizerBraintree Scientific
Iris ForcepsKarl Klappenecker10 cm
Iris ScissorsDiener9 cm
Iris Scissors STRKarl Klappenecker11 cm
MicrodrillStoeltingFOREEDOM K.1070
Micro-scissors-VannasHEISSH-4240blade 7mm, 8 cm
Mouse brain matrixWorld Precision Instruments
Non-invasive blood pressure systemMuromachiMK-2000ST
Operating Scissors STRKarl Klappenecker14 cm
Physiological Monitoring SystemHarvard Apparatus
Razor bladesEver-Ready
Stoelting Rodent WarmersStoelting53810Heating pad
Suture clipStoelting
TweezersIDEALTEKNo.3
Vetbond3M15672Surgical glue
10-0 sutureUNIKNT0410
2,3,5-Triphenyltetrazolium chlorideSigmaT8877

Referanslar

  1. Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
  2. Chamorro, A., et al. The immunology of acute stroke. Nature Reviews. Neurology. 8 (7), 401-410 (2012).
  3. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - Middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
  4. Lee, G. A., et al. Interleukin 15 blockade protects the brain from cerebral ischemia-reperfusion injury. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 562-570 (2018).
  5. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  6. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).
  7. Wellons, J. C., et al. A comparison of strain-related susceptibility in two murine recovery models of global cerebral ischemia. Brain Research. 868 (1), 14-21 (2000).
  8. Doyle, K. P., Fathali, N., Siddiqui, M. R., Buckwalter, M. S. Distal hypoxic stroke: a new mouse model of stroke with high throughput, low variability and a quantifiable functional deficit. Journal of Neuroscience Methods. 207 (1), 31-40 (2012).
  9. Doyle, K. P., Buckwalter, M. S. A mouse model of permanent focal ischemia: Distal middle cerebral artery occlusion. Methods in Molecular Biology. , 103-110 (2014).
  10. Wayman, C., et al. Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. Journal Of Visualized Experiments. (108), e53106 (2016).
  11. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neuroscience Letters. 349 (2), 130-132 (2003).
  12. Florian, B., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neuroscience Letters. 438 (2), 180-185 (2008).
  13. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
  14. Lin, T. N., Te, J., Huang, H. C., Chi, S. I., Hsu, C. Y. Prolongation and enhancement of postischemic c-fos expression after fasting. Stroke. 28 (2), 412-418 (1997).
  15. Glazier, S. S., O'Rourke, D. M., Graham, D. I., Welsh, F. A. Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14 (4), 545-553 (1994).
  16. Tachibana, M., et al. Early Reperfusion After Brain Ischemia Has Beneficial Effects Beyond Rescuing Neurons. Stroke. 48 (8), 2222-2230 (2017).
  17. Gan, Y., et al. Ischemic neurons recruit natural killer cells that accelerate brain infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2704-2709 (2014).
  18. Li, M., et al. Astrocyte-derived interleukin-15 exacerbates ischemic brain injury via propagation of cellular immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), E396-E405 (2017).
  19. Wang, S., Zhang, H., Dai, X., Sealock, R., Faber, J. E. Genetic architecture underlying variation in extent and remodeling of the collateral circulation. Circulation Research. 107 (4), (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 145serebral iskemi reperf zyon orta serebral arter t kan kl235 triphenyltetrazolium klor r tahlila k alanl tahlilenfarkt s ciltImageJ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır