تتبع السلوكية وتصوير نيوروماست من كافيفيش المكسيكية

McLean Worsham; Vânia  Filipa Lima Fernandes; Alexander Settle; Chantell Balaan; Kimberly Lactaoen; Lillian  J. Tuttle; Motoko Iwashita; Masato Yoshizawa

doi:10.3791/59099

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

نقدم هنا، أساليب لدراسة الفائق من سلسلة من كافيفيش المكسيكية السلوكيات وتلطيخ الحيوية لنظام ميتشانوسينسوري. هذه الأساليب تستخدم البرامج النصية البرمجيات الحرة ومصنوعة خصيصا، توفير وسيلة عملية وفعالة من حيث التكلفة للدراسات المتعلقة بالسلوكيات.

Abstract

وقد تطورت الحيوانات تعيش في كهف سلسلة من الصفات المورفولوجية والسلوكية تتكيف مع بيئاتها الدوام الظلام والغذاء-متفرق. من بين هذه الصفات، السلوك مساحات العلف أحد النوافذ مفيدة في المزايا الوظيفية لتطور السمات السلوكية. المقدمة في هذه الوثيقة تحديث أساليب لتحليل سلوك الجذب الاهتزاز (VAB: سلوك التكيفي مساحات العلف) والتصوير من ميتشانوسينسورس المرتبطة بها لتتكيف مع كهف تترا، مكسيكي أستياناكس. وبالإضافة إلى ذلك، تعرض أساليب لتتبع الفائق من سلسلة من السلوكيات كافيفيش إضافية بما في ذلك فرط النشاط وفقدان النوم. كما تظهر كافيفيش أسوسياليتي، والسلوك المتكرر والقلق أعلى. ولذلك، كافيفيش بمثابة نموذج حيوان لتطور السلوكيات. هذه الأساليب تستخدم البرمجيات الحرة ومصنوعة خصيصا من البرامج النصية التي يمكن تطبيقها على أنواع أخرى من السلوك. هذه الأساليب توفير بدائل عملية وفعالة من حيث التكلفة للبرمجيات المتاحة تجارياً التعقب.

Introduction

تترا المكسيكية، أستياناكس مكسيكي (عظميات: تشاراسيداي)، هي فريدة من نوعها بين الأسماك لوجود اثنين نقراً بديلة مختلفة جذريا-وضعهن المبصرين، وتعيش في السطح ووضعهن الأعمى، وتعيش في كهف يتألف من عدة متميزة ¹من السكان. وبالرغم من اختلاف في مورفولوجيا وفسيولوجيا، فهي لا تزال إينتيرفيرتيلي²^،³. هذه نقراً interfertile يبدو قد تطورت بسرعة (~ 20,000 سنة)⁴، مما يجعلها نظام نموذج مثالي لدراسة التكيف السريع. كافيفيش من المعروف أن لديها مجموعة من الصفات المورفولوجية والسلوكية المتباينة بما في ذلك زيادة الكثافة من براعم الذوق، زيادة عدد ميتشانوسينسورس، السلوك مساحات العلف ضبطها إلى تردد معين من حافز تهتز، فرط النشاط، و الأرق. وكثير من هذه السلوكيات قد تطورت في وقت واحد، البعض منها قد اقترحت أن تكون مفيدة في ظلام الكهوف لجمع العلف⁵ والمحافظة على الطاقة في البيئات المظلمة والغذاء متفرق⁶^،⁷.

في كثير من نظم نموذجية التطوري، من الصعب اكتساب المعرفة المتكاملة المتعلقة بالحيوانات كيف تغير مورفولوجيا والسلوك استجابة للبيئة نظراً لأن معظم الأنواع توزع عبر تدرج مستمر في البيئات المعقدة. بيد تناقض صارخ بين الكهف ويتحول السطح أستياناكس التي تطورت في الغاية المتناقضة البيئات التي رسمتها أكتون حادة قد أدى إلى أستياناكس الناشئة باعتبارها نموذجا رائعا لفهم تطور الحيوانات. وهذا يجعل من الممكن لأكثر سهولة ربط الجينات والعمليات الإنمائية مع الصفات التكيفية والتحديد في البيئة. وعلاوة على ذلك، أظهرت التحقيقات الطبية مؤخرا من هذه الصفات في أستياناكس أن هذه الصفات قد توازي أعراض البشرية⁸^،^،من⁹¹⁰. على سبيل المثال، فقدان بالمجتمع والنوم، وكسب من فرط النشاط والسلوك المتكرر ومستوى الكورتيزول مماثلة لما لوحظ في البشر مع اضطراب طيف التوحد⁸.

لمعالجة التطور المشترك معقدة من العديد من السلوكيات والخصائص المورفولوجية، مفيد للعديد منهم لتسليط الضوء على المسارات الجينية والجزيئية الكامنة وراء الاعتداء. المقدمة في هذه الوثيقة طرق لوصف درجة كهف من نوع تعمل السلوكية لنقرأ سطح، وكهف، والهجين من أستياناكس. سلوك التنسيق تحليلها لتحديد خصائص النمط الظاهري هي كهف تكييف السلوك مساحات العلف (السلوك الجذب الاهتزاز، يشار إليها من الآن فصاعدا VAB)، وفرط النشاط/النوم مدة¹¹^،¹². وقدم أيضا أسلوب تصوير للمنظومة الحسية المرتبطة VAB¹³. في الآونة الأخيرة، أصبح العديد من البرامج المفتوحة المصدر تتبع لتشغيل الاختبارات السلوكية المتوفرة¹⁴^،¹⁵. وهذه تعمل بشكل جيد لأفلام الفيديو القصيرة، على بعد أقل من 10 دقائق طويلة. ومع ذلك، يصبح مشكلة إذا كان الفيديو أطول بسبب العملية الحسابية المكثفة/تتبع الوقت. يمكن أن تكون قادرة على البرمجيات المتاحة تجارياً مكلفة. طرق عرض أساسا استخدام مجانية وتعتبر لذلك طرق فعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية. وشملت أيضا نتائج تمثيلية تستند إلى هذه الأساليب.

Protocol

يتم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية المبينة في "مبادئ لمختبر الحيوان الرعاية" (المعهد الوطني للصحة المنشور رقم 85-23، تنقيح عام 1985) والمعتمدة من جامعة هاواي في مانوا رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة الحيوان بروتوكول 17-2560-3.

1-الاهتزاز الجذب السلوك (VAB) المقايسة (≤ 10 دقيقة لإجراء التسجيل الكامل)

ملاحظة: استخدام كاميرا الأشعة تحت حمراء حساسة أو بناء على كاميرا الأشعة تحت حمراء عن طريق تعديل كاميرا USB. لتعديل كاميرا USB، انظر وصفاً مفصلاً قدمه "المختبر كين" في هذه المسألة كافيفيش في جوف (من هذه المسألة ) أ (مكسيكي )، أو وصفاً موجزاً في "المواد التكميلية".

إعداد تسجيل
1. للتأكد من أن الكاميرا لا تزال في موقف، ما زالت، وفي البعد البؤري الصحيح من الموضوع (ق) يجري تسجيلها، بناء إطار مربع الأسود من البولي فينيل كلوريد (بلاستيك)، قياس 120 سم ح x 45 سم ل x 90 سم جورج
2. وبعد بناء الإطار، تغطية ذلك مع ستارة تعتيم بلاستيك مثل المقصود واحد للزراعة المائية.
3. أعلى الإطار، وضع مجلس اكريليك أسود مع نافذة لكاميرا الأشعة تحت الحمراء في مركز قياس القطر نفسه كعدسة التكبير للتعديل مثبتة على ج. داخل هذا المربع، قم بوضع معدات الفحص VAB (الشكل 1).
جهاز الاهتزاز
ملاحظة: يتم إنتاج الاهتزازات استخدام مولدات صغيرة دالة.
1. للأساليب التالية، لحن الاهتزازات سعة 0.15 مم وتردد 40 هرتز، وهو التردد الذي يتسبب استجابة الحد أقصى للجذب⁵^،¹⁶.
2. قم بتوصيل مولد دالة متكلم تواجه أفقي.
3. إرفاق قضيب زجاج 7.5 mm قطرها 14 سم في طول غطاء الغبار على وجه المتكلم باستخدام الغراء الساخن أو مادة لاصقة طوقا.
4. عمودي لهذا قضيب وتواجه اتجاه نزولي، إرفاق آخر 7.5 مم قضيب الزجاج قطره 4 سم في الطول (الشكل 1).
التحليل السلوكي
1. يتأقلم تجريبية مكسيكي (أ) لمدة 4 أيام في قاعة مقايسة أسطوانية مملوءة بالماء (pH بين 6.8 7.0، الموصلية المايكروثانيه 700 تقريبا، درجة الحرارة ما يقارب 22 ˚C) مكيفة مع دورة ل 12/12/د. التحقق من ما إذا كانت الأسماك قد تأقلم بالتقيد زمن الوصول العلف. زمن أطول من دبابتهم الرئيسية تشير إلى حاجة إلى مزيد من الوقت التأقلم. في جميع أنحاء التأقلم، تغذية مرة واحدة يوميا مع لايف الارتيميا النوبليوس.
2. اليوم قبل اليوم التحليل (بعد 3 أيام التأقلم)، يستعاض عن المياه في قاعة الفحص بالمياه العذبة مكيفة.
3. في يوم الفحص (بعد 4 أيام التأقلم)، تحرم الأسماك التجريبية من الغذاء حتى بعد الانتهاء من الفحص. سيتم تغيير شبع استجابتها للاهتزازات.
4. تعيين معلمات التسجيل في مجانية فيرتوالدوب¹⁷: 15 إطارات/ثانية، الترميز: x264vfw، تسجيل المدة: 3 دقيقة 30 ثانية.
5. تحضير جهاز لبث الاهتزاز (راجع الخطوة 1، 2) بضبط إلى 40 هرتز. انظر الشكل 1 لشرح للجهاز. شطف قضيب الزجاج تهتز مع المياه لإزالة أي مواد كيميائية للذوبان في الماء.
6. تعمل في الظلام، ضع اسطوانة الفحص في مرحلة تسجيل مضيئة في خلفية الأشعة تحت حمراء في المربع الأسود والسماح للأسماك إلى تأقلم لمدة 3 دقائق.
  1. بعد التأقلم 3 دقيقة، سجل s 3 30 دقيقة من الفيديو. في بداية التسجيل، إدراج قضيب الزجاج تهتز في عمود الماء (حوالي 0.5 سم العمق).
  2. تجنب إجراء أي يمكن الإحساس بالضوضاء أو الاهتزازات أثناء وضع قضيب الزجاج تهتز في الماء كالسمك حتى اضطرابات طفيفة آخر.
  3. الانتهاء من هذا الإجراء ضمن 30 s لبدء تسجيل الفيديو التأكد من أن يتم تسجيل أكثر من 3 دقيقة للسلوك.
7. مراقبة الفيديو أثناء التسجيل التأكد من أن أية أخطاء تحدث أثناء هذه المرحلة.
8. بعد الانتهاء من التسجيل، إزالة قضيب الزجاج تهتز من قاعة الفحص أسطواني وإزالة قاعة الفحص بدءاً من مرحلة التسجيل. كرر من 1.3.5 للأسماك القادمة.
تحليل أشرطة الفيديو
ملاحظة: تحويل الترميز إلى تنسيق التي يمكن تحميل ImageJ يعمل فقط على نظام التشغيل Windows¹⁸ (الجدول 1).
1. تحويل فيديو avi المضغوطة إلى تنسيق قابل لقراءة إيماجيج وتحليل مجموعة المعلمات.
  1. قم بتثبيت AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/)، بفماب بناء 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/)، وأففس ver1.0.0.5 أو ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/). لاحظ أن هذا الأسلوب إصدار البرنامج/الحساسة. سوف دليل الموقع توفير الوصلات إلى الإصدارات الصحيحة (الجدول 1).
  2. تشغيل الملف الدفعي بالنقر المزدوج فوق avs_creater.bat (ملف إضافي). انقر على الحق في ملف الفيديو avs أن تحليل (حدد من الهلال ملفات تم إنشاؤها بواسطة avs_creater.bat).
  3. كما يتطلب تحليل أشرطة الفيديو باستخدام البرنامج المساعد المقتفي في ImageJ تحميل الماكرو إيماجيج (ملف Macro_VAB_moko.txtتكميلية)، تحميل الماكرو بالسحب والإفلات في shell واجهة المستخدم الرسومية من إيماجيج. وسيمكن هذا الماكرو بعض مفاتيح التشغيل السريع للتحليل التالي.
  4. في دليل العمل، قم بإنشاء مجلد جديد بعنوان "Process_ImageJ".
  5. انقر على الحق في أن يكون ملف.avs حلل (حدد من الهلال ملفات تم إنشاؤها بواسطة avs_creater.bat). حدد خيار التحميل السريع . بعد تحميل الملف avs كمحرك أقراص خارجي، فتح ملف avi في إيماجيج (ملف avi باسم إنهاء مع "أفي").
  6. لضبط المقياس لقياس المسافة، تحديد قطر قاعة الفحص برسم خط مستقيم عبر الدائرة باستخدام أداة التحديد الخط المستقيم، ثم انقر فوق تحليل > ضبط مقياس الدالة. على سبيل المثال، إدخال 9.4 سم في حالة استخدام طبق أسطواني يبلغ قطرها داخلي 9.4 سم. حدد المربع الإذاعة من العالمية بغية توحيد المقياس عبر كافة التحليلات الفيديو التالي.
2. تحويل المكدس ثنائي وتشغيل التحليل.
  1. نسخ منطقة غرفة الفحص باستخدام أداة التحديد البيضاوي ثم انقر بالزر الأيمن واختر الصورة > تكرار. في هذا الوقت، حدد مجموعة الإطارات للاحتفاظ لمزيد من التحليل، مثلاً، تبقى الإطارات أولاً 2,700 بعد إدخال قضيب تهتز الماء (حتى 15 إطارا في الثانية وهذا بالضبط 3 دقائق فيديو).
  2. مسح خارج قاعة الفحص وتحويل إلى صورة ثنائية عن طريق ضرب المفتاح الساخن 7 شريط رقم للوحة المفاتيح.
  3. بعد مسح الخلفية ويظهر موجه، أضف نقطة سوداء في مركز للإشارة إلى موقف قضيب الزجاج تهتز باستخدام أداة التحديد البيضاوي بالفعل تعيين إلى الأسود مع وظيفة التعبئة . انقر فوق موافق وستظهر موجه للانتقال إلى التسوية العتبة.
  4. تعيين العتبة جعل صورة ثنائي (كل أسود وأبيض) من الأسماك. ضبط العتبة حتى السمك يمكن تبينه من مقاطع الفيديو كامل، ومن ثم حدد تطبيق.
  5. قم بتشغيل البرنامج المساعد "تعقب" بضرب المفتاح الساخن 8 على شريط رقم. تعيين حجم بكسل الحد الأدنى إلى 100 عند مطالبتك بذلك، وضرب موافق، توليد المسافة بين قضيب تهتز والأسماك لكل إطار لكل 3 دقيقة من الفيديو ثنائي.
  6. ضبط التعقب سوء المتولدة عن الضوضاء في الفيديو. للقيام بذلك، تحقق من إطار النتائج لتحديد الإطارات التي تقوم بإرجاع كائن رقم 3 أو أعلى تشير إلى كائنات إضافية في تلك الإطارات (مثل الجزيئات في الماء أو الظل من ذراع القضيب شفاف) بالإضافة إلى "رود" و "الأسماك" الإطار. قم بإزالة أية كائنات إضافية باستخدام أداة فرشاة الطلاء.
  7. ضرب المفتاح الساخن 9 على شريط رقم تصدير كدسة ثنائي من صور الفيديو بأكمله (في حال من الضروري ريناليزي) وملف.xls مع الإحداثيات والبيانات عن بعد (ملفات تكميلية CF01.xls، Threshold_CF01.tif، و Trac_CF01.tif ). سيتم إغلاق المفتاح الساخن 9 أيضا كافة الملفات المرتبطة بالفيديو الحالي. كرر الخطوات من 1.4.2.1 عن طريق 1.4.2.6 لجميع replicates.
  8. تشغيل البرنامج النصي ماكرو (ملف JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsmالتكميلية) دمج عدة ملفات النتيجة المقتفي (.xls) في جدول واحد، وحساب عدد ومدة النهج إلى منطقة 1.5 سم من القضيب. النهج غير دائم على الأقل 0.5 s الإرادة لا يمكن عدها. تغيير معلمات المسافة والوقت تحسب كنهج وفقا لمسائل معينة من الفائدة.
3. حرر مساحة القرص في الكمبيوتر بعد الانتهاء من جميع التحاليل. إزالة الملفات المحملة لتحرير مساحة القرص--avi.avi و. avi.avs الملفات (ملحقات الأسماء التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج)-عن طريق تشغيل ملف دفعي multiunmountdel.bat في نفس المجلد حيث تم تشغيل avs_creater.bat في المقطع 1.4.1.2.

2-النوم وفرط النشاط الإنزيم (تسجيل ح 24)

التحليل السلوكي
1. تأقلم الأسماك التجريبية الخمسة لمدة 4 أيام أو أكثر في كل دائرة من حوض السمك خصيصا ل 10 تسجيل اﻷكريليك (45.9 سم × 17.8 سم × 17.8 سم؛ والطول × العرض × العمق، على التوالي) مملوءة بالمياه المكيفة (راجع الخطوة 1.3.1).
  1. فصل كل الدائرة الفردية مع لوحات اﻷكريليك الأسود مما يجعل الدوائر متساوية في الحجم، قياس 88.9 مم × 177.8 ملم × 177.8 ملم (الشكل 2). يجب التأكد من تغطية كل صهريج لمنع السمك من القفز بين الدوائر.
  2. تعيين جهاز ضبط الوقت في الطاقة القابلة للبرمجة تلقائياً تشغيل LED البيضاء الخفيفة ح 12، وإيقاف ح 12 كل يوم خلال فترة التأقلم (على سبيل المثال، تعيين الضوء على الساعة 07:00 ص وإيقاف الساعة 07:00 م). وهذا سوف انترين إيقاع circadian الأسماك (إذا كان عرضه للرائعة).
  3. استخدام لوحات اﻷكريليك بيضاء معتمة، والبعد مماثلة إلى خزان ل 10 الناشرون لتمرير الضوء الأبيض والأشعة تحت الحمراء من خلال بغية توفير ضوء منتشر بكثافة حتى عبر جميع الدبابات.
  4. في جميع أنحاء التأقلم، تغذية مرة واحدة يوميا مع العيش الارتيميا النوبليوس وتوفير التهوية من خلال مرشحات الأسفنج في كل الحوض.
    ملاحظة: تأكد من يتم تغذية الأسماك في الأوقات متسقة (أي، 1 x يوميا الساعة 09:00 ص) كما يمكن أن يؤثر على تغذية الوقت الرائعة من إيقاعات circadian¹⁹.
  5. التحقق من ما إذا كانت الأسماك قد تصبح تأقلم بالتقيد زمن الوصول العلف. زمن أطول من دبابتهم المنزل تشير إلى حاجة إلى مزيد من الوقت التأقلم.
2. المياه في اليوم قبل يوم التحليل (3 أيام أو أكثر للتأقلم)، يستعاض عن المياه في قاعة الفحص مع طازجة مكيفة (راجع الخطوة 1.3.1).
3. تعيين معلمة التسجيل في برامج فيرتوالدوب¹⁷: 15 إطارات/ثانية، الترميز: x264vfw، تسجيل المدة: 86,400 s (24 ساعة).
4. قم بتشغيل الإضاءة الخلفية وراء مرحلة تسجيل الأشعة تحت الحمراء (انظر الشكل 2). عن طريق مراقبة فيرتوالدوب صورة حية على الشاشة، ضبط موضع كل حوض السمك لجعلها في مواجهة كاميرا USB.
5. اليوم لتسجيل، وإطعام كل الأسماك الحية الارتيميا النوبليوس، إزالة كافة عوامل التصفية الأسفنج، وقم بتشغيل الإضاءة الخلفية الأشعة تحت الحمراء.
6. بدء تشغيل 24 ح التسجيل في الصباح (على سبيل المثال، وقت البدء 09:00 ص ووقت الانتهاء 09:00 ص في اليوم التالي). بدء تشغيل التقاط الفيديو، وتأمين مكان لتجنب اضطراب. فحص دوري لأن التسجيل قيد التشغيل.
7. بعد 24 ساعة، تأكد من أن حفظ الفيديو بشكل صحيح. نقل الفيديو إلى الكمبيوتر محطة العمل لتتبع وتحليل سلوك السمك.
تحليل أشرطة الفيديو
1. أولاً، تحقق من جودة الفيديو التي تبحث في الإضاءة. تحقق إذا كان هناك واحد من الأسماك في كل قسم، وإذا كانت هناك أية تحركات الأجانب التي قد تسبب سوء التعقب.
2. إعداد قناع لتجنب سوء تتبع خارج الحوض. جعل أقنعة اثنين: واحد من أجل 'حتى' وواحد للأسماك 'الغريب'، استناداً إلى ترتيب التسلسل في الصهاريج.
3. جعل اثنين من المجلدات المسماة "الفردية" و "حتى" للاقنعة المذكورة أعلاه. نقل التتبع الملف المعلمة من سويستراك في كل من هذه المجلدات.
4. فتح التتبع الملف المعلمة من سويستراك تتبع البرمجيات (تكميلية الملف Tracking_odd.swistrack أو Tracking_even.swistrack). تحديد المسار إلى ملف الفيديو وقناع الملف، ثم حفظ والخروج من التعقب ملف معلمة. ضبط عدد blob والمعلمات بكسل كحد أقصى في "النقطة الكشف" و "أقرب جار تتبع" المكونات، على التوالي، وفقا للتجارب.
5. انقر نقراً مزدوجاً فوق تشغيل برنامج نصي لبرامج التشغيل الآلي للمكاتب وين الذي سيتم تلقائياً فتح البرنامج سويستراك (الملف التكميلي swistrack_1.exe أو swistrack_2.exe أو swistrack_3.exe أو swistrack_4.exe--هذه هي نفس الملفات القابلة للتنفيذ)، التي الإيدز في استكمال الطرح الخلفية التكيفية في سويستراك.
6. فتح Tracking_odd.swistrack أو Tracking_even.swistrack في برنامج سويستراك لتحميل التعقب ملف معلمة. بعد تحميل المعلمات، اضغط على زر التشغيل لبدء تعقب.
7. ضمن الأطر 9,000 الأولية (600 s، أي، أول 10 دقيقة من الفيديو المسجل) والتحقق ما إذا كانت الأسماك التي تتبع من عمل خلال النظر في الطرح الخلفية التكيفية، قناع ثنائي، وأقرب جار تتبع في قائمة مكون من سويستراك (انظر الفيديو المصاحبة). ثم حدد خلفية التكيفية الطرح في قائمة المكونات.
8. ضرب الزر R على لوحة المفاتيح لاستئناف التشغيل الآلي للمكاتب وين وترك جهاز الكمبيوتر لتتبع. تتبع سوف يستغرق 5-7 ح كل 24 ساعة فيديو لسطح مكتب مع النوى وحدة المعالجة المركزية 4 و 8 غيغابايت من الذاكرة. وفقا للاحتياجات، وتشغيل عدة عمليات سويستراك (بما في ذلك المجالات الفردية والزوجية من ملف فيديو واحد) تصل إلى عدد النوى في وحدة المعالجة المركزية. على سبيل المثال، 4-النوى يمكن التعامل مع 4 أشرطة الفيديو في وقت واحد.
9. وخلال هذا التتبع، تجنب استخدام هذا الكمبيوتر لأغراض أخرى لأن برنامج التشغيل الآلي للمكاتب وين تلقائياً بتحريك مؤشر الماوس. سيتم تجاهل إطارات 9,000 الأولية في الإجراء التالي.
10. تخصيص 3 ملفات البرنامج النصي Perl (1.fillupGaps2.pl، 2.Calc_fish_id_moko_robust، و 3.pl، 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات التتبع التي تم إنشاؤها بواسطة سويستراك في المجلدات 'حتى' و 'الغريب' (راجع الخطوة 2.2.3).
11. مقطع أحد إطارات الفيديو من ملف الفيديو باستخدام فيرتوالدوب واستيراد هذه القصاصة كصورة في إيماجيج. قم بتحديد طول الحوض (45.9 سم) في إيماجيج، وحساب نسبة بكسل/سم. كتابة نسبة بكسل/سم في 1.fillGaps2.pl في أحد برامج محرر نص ثم حفظ.
12. إطلاق برنامج CygWin، جهاز المضاهاة Unix. حدد موقع المجلد سويستراك الذي يحتوي على البرامج النصية Perl 3 باستخدام القرص المضغوط على سطر الأوامر.
13. تشغيل البرنامج النصي Perl بكتابة 1.fillGaps.pl بيرل. هذه البرامج النصية Perl ثلاثة سيتم تعيين كل ملف التتبع إلى غرفة فريدة من نوعها للحوض وتحليل المسافة مدتها والسباحة النوم بينما الأسماك كان مستيقظا. وسوف يستغرق 1-2 ح للانتهاء من التحليل.
14. تقييم ملف نصي يدعى Summary_Sleep.txt تحديد ما إذا كان عدد الإطارات التي تم إسقاطها من التحليل مقبول منخفض؛ يعتبر مقبولاً أقل من 15% إطارات في عداد المفقودين.
15. نسخ ولصق النتائج تم تحليلها من Summary_Sleep.txt إلى جدول بيانات مع الماكرو (الملف التكميلي Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm).
16. تشغيل ماكرو لاستخراج البيانات الموجزة لتتبع الملفات.

3-داسبمي أو داسبي تلطيخ من نيوروماستس ميتشانوسينسوري

ملاحظة: داسبمي وداسبي تلطيخ حساسة للضوء وينبغي أن يتم في ظروف مظلمة. بعد البروتوكول لكل من داسبمي وداسبي باستخدام داسبمي كمثال.

تلوين البروتوكول
1. لما مجموعة 1 لتر من تلطيخ حل الأسهم (25 ميكروغرام/مل)، أضف 0.025 غرام بلورات داسبي أو داسبمي إلى 1 لتر من dH₂س والسماح لها حل بين عشية وضحاها. يبقى الحل المخزنة في 4 درجات مئوية ومحمية من الضوء.
2. تزج الأسماك في 2.5 ميكروغرام/مل داسبمي أو داسبي المذابة في الماء المكيفة (راجع الخطوة 1.3.1) لمدة 45 دقيقة في بيئة مظلمة عند 22 درجة مئوية.
3. وبعد 45 دقيقة، إزالة الأسماك من حل داسبمي أو داسبي وتخدير بالانغماس في حمام الثلج من المياه المكيفة مع 66.7 ميكروغرام/مل من الملح المشبعة بالفلور أوكتين الميثان إيثيل مخزنة 3-أمينوبينزواتي (MS222).
4. جبل الأسماك في لوحة طبق بيتري والصورة تحت مجهر فلوري. أخذ z-رص الصور وحفظها كملفات.tif للتحليل التالي.
تحليل الصور باستخدام إيماجيج
1. داخل المجلد الذي يحتوي على ملفات.tif، لصق قالب الملف الماكرو إيماجيج (Neuromast_ImageJ.txt) وقم بإنشاء مجلد جديد بعنوان "Process_ImageJ". في ملف الماكرو ImageJ، تعيين المسار إلى الدليل الحالي.
2. شن إيماجيج وفتح الماكرو عن طريق سحب الملف الماكرو في واجهة المستخدم الرسومية، أو عن طريق النقر فوق ملف > فتح وتحديد الملف الماكرو.
3. بتشغيل الماكرو بواسطة النقر فوق وحدات الماكرو > "تشغيل الماكرو". ثم سوف الماكرو تلقائياً فتح ملف صورة ليتم تحليلها. إذا لم يتم فتح ملف الصورة، انقر فوق ماكرو > التقاط ملف.
4. للتحديد الكمي نيوروماست، حدد منطقة الاهتمام باستخدام أداة المضلع.
5. ضرب المفتاح الساخن 5 إلى المنطقة مكررة للفائدة.
6. استخدام أداة الطلاء لإزالة أو إضافة النقاط نيوروماست إضافية أو مفقودة من الصورة السابقة ومن ثم ضرب 6. بعد ضرب 6، سوف تظهر اثنين من النوافذ الجديدة: نظام النقاط المرقمة نيوروماستس وجدول بإجمالي نيوروماستس كمياً.
7. ضرب 7 لحفظ كلا الملفين: يتم تخزين ملف واحد كملف صورة tif وأخرى يتم حفظها كملف.xls. بعد أن يتم تخزين هذه الملفات، سيتم فتح ملف صورة جديدة للتحليل.
8. توحيد التهم نيوروماست كل الأسماك إلى جدول واحد بتشغيل البرنامج النصي الكلي (SN_Number_Diameter.xlsm).

النتائج

النتائج المقدمة في هذه الوثيقة أمثلة لما يمكن الحصول عليه بطرق عرض. ولذلك، يمكن أن تنحرف النتائج قليلاً من تلك المعروضة هنا لكل من كافيفيش وأسماك السطح تبعاً لظروف تجريبية.

السلوك الجذب الاهتزاز

Discussion

هذه الأساليب المقدمة سهلة الوصول إليها ولكن يمكن أن يكون معقداً لأداء نظراً لطبيعة أصولها مجانية. لذلك، ينصح بإجراء فحوصات للمحاكمة والتحليلات قبل أي إجراء التجارب الفعلية.

يمكن أن يكون معدل توليد البيانات سريعاً حالما يتم إنشاء إطار التجريبية والتحليلية. وبمجرد إنشاء، م?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونشكر جميع أعضاء المختبر Yoshizawa منها سيترارو أ. وسيمون أ.، فالديز جيم، ماكاباك جيم، تشوي جيه، لو ل.، نغوين J.، س. بودورزير، هيرنانديس H.، فونغ J.، كاتو J.، والرب أولاً الرعاية الأسماك على الأسماك التجريبية المستخدمة في هذه المخطوطة. كما نشكر أعضاء مختبر كين ألف فيهم ماسك ص لتدريب بلدي بتجميع كاميرا "الأشعة تحت الحمراء اتفاقية مكافحة التصحر". وأخيراً، نود أن نشكر المدرسة "مختبر وسائط الإعلام"-كلية العلوم الاجتماعية-للاتصالات في مانوا جامعة هاواي لمساعدتهم لا تقدر بثمن بجعل الفيديو، لا سيما ب. سميث ولام ياء، والأبيض س.. هذا العمل كان تدعمها "مؤسسة المجتمع هاواي" (16CON 78919 و 18CON-90818) و "المعهد الوطني للصحة نيجمس" (P20GM125508) منح للي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide)	MilliporeSigma	D3418
880 nm wave length black light	Advanced Illumination	BL41192-880
avfs	freeware	Version 1.0.0.6	http://turtlewar.org/avfs/
Avisynth	freeware	Version 2.6.0	http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
Cygwin	freeware	Version 2.11.0	https://www.cygwin.com/
Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish)	Corning	3140-100	10 cm diameter 5 cm high
Ethovision XT	Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands	Version 14	https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black	Jardin (through Amazon.com)	NA	Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system
Grade A Brine shrimp eggs	Brine shrimp direct	BSEA16Z
ImageJ	freeware	Version 1.52e	https://imagej.nih.gov/ij/
macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens	Toyo	NA	Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer
Neutral Regulator	Seachem	NA
Optical cast plastic IR long-pass filter	Edmund optics	43-948	Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam
pfmap	freeware	Build 178	http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom)
Reef Crystals Reef Salt	Instant Ocean	RC15-10
SwisTrack	freeware	Version 4	https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam)	Microsoft	Q2F-00013	Cut 2-2.5 cm of the front
WinAutomation	freeware	Version 8	https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)
Windows operating system	Microsoft	7, 8 or 10	https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfw	freeware	NA	https://sourceforge.net/projects/x264vfw/

References

Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), (1977).
Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).
Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
Lee, A. . Virtualdub. , (2014).
Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
Swimmer, B., Lang, H. H. . Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), 233-246 (1980).
Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. . Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), 195-196 (1987).
Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
Rasband, W. S. . Object Tracker. , (2000).
Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , (2012).
Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. . SwisTrack. , (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

146

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: