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要約

ここでは、行動と生体染色、メカノセンシング メキシコの血脈のシリーズの高スループット研究の手法を提示します。これらのメソッドは、動作研究実用的かつコスト効果の高い方法を提供するフリー ソフトウェアとカスタム スクリプトを使用します。

要約

洞窟住居動物は、一連の絶え間なく暗くて食品スパース環境に適応する形態および行動の特性の進化しています。これらの特性の間で採餌行動は行動形質の進化の機能性に役に立つのウィンドウの 1 つです。魅力の振動挙動を分析するための更新方法は、ここに記載した (VAB: 適応の採餌行動) と洞窟に適応したテトラの関連するシグナリングのイメージングアステュアナクス メキシコ。さらに、一連の多動と睡眠の損失などを含む追加の血脈挙動の高速追跡手法を提示しました。血脈はまた asociality、反復的な行動とより高い不安を示します。したがって、血脈は進化した行動のための動物モデルとして機能します。これらのメソッドは、他の種類の動作に適用することができますフリー ソフトウェアとカスタム スクリプトを使用します。これらのメソッドは、市販のトラッキング ソフトウェアに実用的かつコスト効果の高い選択肢を提供します。

概要

メキシコのテトラ、アステュアナクス メキシコ(オキナヒメジ: 発音)、2 つの根本的に異なる代替モーフ - 発見、表面住居モーフといくつか異なるから成るブラインド、洞窟住居のモーフを持っていることのための魚の間で一意です人口1。異なる形態と生理学、彼らは、まだ interfertile2,3。これら interfertile モーフは、急速に進化している (~ 20,000 年)4がそれらの迅速な適応策の検討のための理想的なモデル システムに表示されます。血脈は味覚芽、シグナリング、多動性、振動刺激の特定周波数に合わせて採餌行動の増加数の密度増加を含む分岐形態および行動特性のスイートを持っている知られている、不眠。5採餌と暗いと食品スパース環境6、7のエネルギーの節約のための洞窟の暗闇の中で有利になるために示唆されたいくつかの可能性が高いが、同時に進化これらの動作の多くは。

多くの進化モデル システムでは、ほとんどの種は複雑な環境での連続的な勾配の間で配布されているので、環境への応答でどのように動物の形態と行動変化の統合の知識を習得することは困難です。ただし、洞窟と表面モーフアステュアナクス高コントラスト シャープ エコトーンで区切られた環境で進化した間の対照は、動物の進化を理解するアステュアナクスエクセレント モデルとして浮上しているにつながっています。遺伝子とアダプティブ特性と環境で選択の発達過程をより簡単にリンク可能です。さらに、アステュアナクスのこれらの特性の最近の医学研究は、これらの特徴が人間の症状8,9,10をパラレル可能性がありますを示しています。たとえば、社会性と眠りの損失と利得、反復的な行動、多動やコルチゾール レベルの自閉症スペクトル障害8の人間で観察されるものに似ています。

多くの行動や形質の複雑な共進化に対処するため、基になる遺伝学的および分子経路を強調するそれらの多くを試金するため有利です。アステュアナクスの表面、洞窟、およびハイブリッドのモーフの洞窟型行動表現型の程度の特性評価法は、ここに記載しました。表現型を特徴付けるために分析焦点の行動が洞窟に適応した採餌行動 (振動の魅力の動作、VAB と今後は呼ばれる)、および多動性/睡眠期間11,12。また発表は、VAB13に関連付けられている感覚システムのイメージング法です。最近では、行動実験を実行するための多くのオープン ソースのトラッキング ソフトウェア利用可能な14,15となっています。これらの作品も非常に長い 10 分未満の短いビデオのため。しかし、それは強烈な計算/追跡時間のため、ビデオが長い場合は問題になります。対応の市販ソフトウェアは高価なことができます。提示方法は主にフリーウェアを使用し、コスト ・高スループット方法とみなされます。また含まれている代表的な結果に基づいていますこれらのメソッド。

プロトコル

「原則の研究所動物ケア」(国立衛生研究所文書 85-23 号、1985 の改訂とハワイ大学マノア校機関動物のケアと使用によって承認されたに記載されているガイドラインに従うすべてのプロシージャを実行します。委員会動物プロトコル 17-2560-3。

1. 振動の魅力 (VAB) の動作分析 (≤ 10 分全体の録音の手順)

メモ: 赤外線高感度カメラを使用して、USB ウェブカメラを変更することにより赤外線カメラを構築します。USB ウェブカメラを変更 (このA. メキシコ問題から)、ゼウスにこの血脈問題でキーン ラボによって提示された詳細な説明や補足資料で簡単な説明を参照してください。

  1. レコーディングの設定
    1. カメラが位置にあることを確認、まだと記録されている切換から適切な焦点距離では、塩化ビニルからブラック ボックス フレームを構築 120 cm H x 45 (PVC) 管 cm L x 90 ・ w ・ cm
    2. フレームの建設は後、1 つ水耕農業向けなどプラスチック製の遮光カーテンでカバーします。
    3. フレームの上に調整可能なズームの C マウント レンズと同じ直径を測定センターでカメラの赤外線ウィンドウと黒のアクリル板を置きます。この箱の中には、VAB アッセイ装置 (図 1) を配置します。
  2. 振動装置
    注: 振動は小さい関数発生器を使用して生成されます。
    1. 次の方法の魅力5,16の最大応答を誘発する周波数である 0.15 mm と 40 Hz の周波数の振幅する振動を調整します。
    2. 関数発生器を水平に直面してスピーカーに接続します。
    3. ホット接着剤やガスケットの接着剤を使用してスピーカーの表面の防塵カバーに 7.5 mm 径ガラス棒の長さ 14 cm を接続します。
    4. このロッドと、下向きに垂直に添付別 7.5 mm 径ガラス棒 4 cm (図 1)。
  3. 行動分析
    1. 12/12 L/D サイクルでエアコン水 (pH 6.8 7.0、伝導率約 700 μ S、温度約 22 ° C の間) で満たされた円筒試験室で 4 日間の実験a. メキシコを順応させます。魚が飼料にそれらの遅延時間を観察することによって順応するかどうかを確認します。自分の家のタンクのより長い待ち時間は順応時間が必要を示します。順化、全体ライブ アルテミアノープリウスと一日一回をフィードします。
    2. 前日 (3 日後馴化の残余効果)、アッセイの日新鮮なエアコン水分析室で水に置き換えます。
    3. 分析が完了した後 (4 日後馴化) アッセイの日まで食品の実験的な魚を奪います。飽食振動に対する彼らの反応が変わります。
    4. VirtualDub フリーウェア17記録パラメーターを設定: 15 フレーム/秒、コーデック: x264vfw、実行時間の記録: 3 分 30 秒。
    5. 40 Hz にチューニングして (手順 1.2 参照) 振動発光装置を準備します。装置の説明のための図 1を参照してください。振動のガラス棒、水溶性剤を除去する脱イオン水ですすいでください。
    6. 暗闇での作業、ブラック ボックスで赤外線バックライトに照らされた録音ステージ上測定シリンダーに配置、魚 3 分のために適応することができます。
      1. 3 分順化後 3 分 30 秒の動画を記録します。記録の開始時に水の列 (約 0.5 cm) に振動のガラス棒を挿入します。
      2. 意味をすることができます任意のノイズや、魚と水の振動のガラス棒を位置決めしながら振動を作るほとんどのマイナーな妨害も避けてください。
      3. 30 内でこの手順を完了 s 動作の以上 3 分を記録し、ビデオの録画を開始します。
    7. この段階でエラーが発生しないことを確実に記録しながらビデオを監視します。
    8. 録音を終えた後円筒測定室から振動のガラス棒、録音段階から試験室を取り外します。次の魚の 1.3.5 からを繰り返します。
  4. ビデオ分析
    注: は ImageJ を読み込むことができる形式、コーデックを変換する Windows オペレーティング システム18 (表 1) でのみ動作します。
    1. ImageJ とセットの解析パラメーターの読み取り可能な形式に圧縮の avi ビデオを変換します。
      1. AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/)、pfmap ビルド 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/)、avfs ver1.0.0.5 または ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/) をインストールします。この方法はプログラム/バージョンの違いに注意してください。提供されているウェブサイトへのリンクは、適切なバージョン (表 1) をご案内いたします。
      2. バッチ ファイルを実行するには、 avs_creater.bat (補足ファイル) をダブルクリックします。Avs のビデオ ファイルを右クリックして ( avs_creater.batによって作成された avs ファイルから選択) を分析します。
      3. ImageJ の Tracker プラグインを使用してビデオの解析は、ImageJ マクロ (補足ファイルMacro_VAB_moko.txt) の読み込みを必要とするとは、ImageJ の GUI シェルにドラッグ アンド ドロップによってマクロをロードします。このマクロには、次の分析の特定のホット キーが有効になります。
      4. 作業ディレクトリ"Process_ImageJ"新しいフォルダーを作成します。
      5. .Avs ファイル上で右クリック ( avs_creater.batによって作成された avs ファイルから選択) を分析します。クイック マウント・ オプションを選択します。Avs ファイルを外付けドライブとしてマウントした後は、ImageJ で avi ファイルを開く (avi ファイルの名エンディング「.avi」と).
      6. 距離測定の尺度を設定する定額法の選択ツールを使用して商工会議所の間で直線を描画することによって測定チャンバーの直径を選択し、クリックして分析 > 縮尺を設定する関数。9.4 cm 内側直径を持つ円筒形の皿を使用している場合、たとえば、 9.4 cmを入力します。以下のビデオ分析のすべてにわたって規模を標準化するために、グローバルのラジオ ボックスを確認します。
    2. バイナリのスタックに変換し、分析を実行します。
      1. 楕円形選択ツールを使用して試金商工会議所エリアをコピーし、右クリックして選択画像 > 重複する。この時、例えば、さらに分析を保つ、振動ロッド (これは正確に 3 分ビデオの 15 の fps) で水に入る後最初 2,700 のフレームを維持するフレームの範囲を指定します。
      2. 試験室の外をクリア、キーボードの数のバー ホット キーの 7 を押すことによってバイナリ イメージ変換します。
      3. 背景をクリアするとプロンプトが表示されます、既に塗りつぶし関数と黒に設定されて楕円形選択ツールを使用して振動のガラス棒の位置を示すためセンターで黒いドットを追加します。[Ok]をクリックし、しきい値の調整に移動するプロンプトが表示されます。
      4. 魚の (すべて黒と白) のバイナリ イメージを作るためのしきい値を設定します。しきい値を調整、魚全体のビデオ クリップで見ることができるし、適用を選択します。
      5. 数値バーのホット キー 8を押すことで「トラッカー」プラグインを実行します。100 とヒット[ok]、振動ロッドとバイナリのビデオのすべて 3 分について、フレームごとの魚の距離を生成する最小のピクセル サイズを設定します。
      6. ビデオのノイズによって生成された誤追跡を調整します。これを行うには、チェックイン (例えば、水またはロッドの透明のアームの日陰で粒子) のフレームでオブジェクト数 3 またはより高い示す余分なオブジェクトを返すフレームを識別するために結果ウィンドウ「棒」や「魚」に加え、フレーム。[ペイント ブラシ] ツールを使用して任意の余分なオブジェクトを削除します。
      7. 座標と距離データ (補足ファイルCF01.xls、Threshold_CF01.tif、Trac_CF01.tif (再分析する必要がある) 場合、全体のビデオの画像のバイナリのスタックをエクスポートするのには番号のバーと .xls ファイルにホット キー 9 をヒットします。).ホット キー 9はまた現在のビデオに関連付けられているすべてのファイルを閉じる。すべて複製手順 1.4.2.1 1.4.2.6 を通じてを繰り返します。
      8. 1 つのワークシートに複数のトラッカー結果ファイル (.xls) を統合し、ロッドから 1.5 cm の領域にアプローチの期間と数をカウントするマクロ スクリプト ( JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsmの補足ファイル) を実行します。少なくとも 0.5 s は長続きしないのアプローチはカウントされません。距離と時間の興味の特定の質問によるとアプローチとしてカウントのパラメーターを変更します。
    3. すべての解析を終えた後、PC のディスク容量を解放します。マウントされたファイルのディスク領域を解放するを削除 avi.avi と。 avi.avs ファイル (拡張子ソフトウェアによって生成された)-1.4.1.2 セクションでavs_creater.batを実行した同じフォルダーにバッチ ファイルmultiunmountdel.batを実行しています。

2. 睡眠と多動性アッセイ (24 h 記録)

  1. 行動分析
    1. 4 日間以上各商工会議所特注 10 L アクリル記録水族館 5 実験魚を順応 (45.9 cm x 17.8 x 17.8 cm センチメートル × 長さ × 幅 × 深さ、それぞれ) エアコンの水で満たされた (ステップ 1.3.1 を参照)。
      1. 黒のアクリル板と同じサイズ、88.9 を測定室を作るとそれぞれの個々 の商工会議所を分離 × 177.8 mm × 177.8 mm (図 2)。必ず各タンク室の間にジャンプから魚を防ぐためにカバーしてください。
      2. 自動的に切って 12 h の白色 LED で点灯してプログラマブル電源タイマーを設定 12 時間馴化期間中毎日 (たとえば、7 でのライトを設定し、オフ 19 で)。これは (引き込みやすい場合) 魚の概日リズムが同調されます。
      3. すべてのタンクの間でも強度とディフューズ ライトを提供するために白と赤外線光を渡す 10 L タンクにディフューザーとして類似のディメンションの不透明、白のアクリル板を使用します。
      4. 順化、全体で一日アルテミアノープリウスのライブし、各水槽のスポンジ フィルターを通して通気を提供するフィードします。
        メモ: 必ず魚が一貫した時 fed (すなわち、9:00 で 1 日あたり 1 x)19概日リズムの同調にも影響することができます餌をやる時間に。
      5. 飼料にそれらの遅延時間を観察することによって魚を順応するかどうかを確認します。自分の家のタンクのより長い待ち時間は順応時間が必要を示します。
    2. (3 日間またはそれ以上、馴化の残余効果)、アッセイの日に事前交換分析室における水たて完備日水 (ステップ 1.3.1 を参照)。
    3. VirtualDub ソフトウェア17の記録パラメーターを設定: 15 フレーム/秒、コーデック: x264vfw、実行時間の記録: 86,400 秒 (24 時間)。
    4. 録音ステージの背後にある赤外線バックライトをつける (図 2参照)。画面で VirtualDub のライブ画像を観察することによって USB カメラに直面させるそれらに各水槽の位置を調整します。
    5. レコーディング、ライブ アルテミアノープリウスとそれぞれの魚をフィードの日スポンジ フィルターをすべて削除し、赤外線バックライトが点灯します。
    6. 朝の記録 24 h を開始 (たとえば、開始時刻が 9 と終了時刻は、9 次の日)。ビデオのキャプチャを開始し、障害を避けるために場所を確保します。録画が実行されていることを定期的に確認します。
    7. 24 h 後ビデオが正しく保存されていることを確認します。ビデオを追跡および魚の動作を分析する PC ワークステーションに転送します。
  2. ビデオ分析
    1. まず、照明を見ることによってビデオの品質をチェックします。各セクションで、1 つの魚がある場合、誤追跡可能性があります任意の外部の動きがある場合を確認します。
    2. 水族館の外の誤追跡を避けるためにマスクを準備します。2 つのマスクを作る: の 'も' と '奇妙な' 魚用タンク内の順序に基づいて。
    3. 「奇妙な」と「も」マスクの上記 2 つのフォルダーを作る。追跡を移動これらの各フォルダーに SwisTrack のパラメーター ファイル。
    4. 追跡を開く SwisTrack トラッキング ソフトウェア (補足ファイルTracking_odd.swistrack または Tracking_even.swistrack) のパラメーター ファイル。ビデオ ファイルとマスク ファイルへのパスを指定し、保存し、追跡を終了パラメーター ファイル。Blob の数と最大ピクセルのパラメーターを調整する"Blob として検出"し、「最も近い隣人追跡」コンポーネント、実験によると、それぞれ。
    5. SwisTrack ソフトウェアを自動的に開く勝利オートメーション ソフトウェアのスクリプトを実行する] をダブルクリックします (補足ファイルswistrack_1.exe、swistrack_2.exe、swistrack_3.exe または swistrack_4.exe- これらは、すべての同じ実行可能ファイル)、SwisTrack の適応的背景差分の更新を支援します。
    6. SwisTrack ソフトウェアの追跡を読み込みでTracking_odd.swistrackまたはTracking_even.swistrackを開いてパラメーター ファイル。パラメーターをロードした後に、追跡を開始する実行ボタンを押します。
    7. 初期 9,000 枠内 (600 s、すなわち、録画したビデオの最初の 10 分)、魚類行動追跡が適応的背景減算、バイナリ マスクを見ることによって動作しているかどうか確認、最も近い隣人 SwisTrack (参照の [コンポーネント] リストで追跡添付のビデオ)。[コンポーネント] リストで適応的背景差分を選択します。
    8. 勝利オートメーションを再開し、追跡するための PC のままキーボードのRボタンを押します。追跡を行うと、24 時間あたり 5-7 h の 4 CPU コアと 8 GB のメモリを持つデスクトップのビデオ。ニーズによると CPU のコアの数まで (単一のビデオ ファイルの奇数と偶数のアリーナを含む) 複数の SwisTrack プロセスを実行します。たとえば、4 コアは 4 の動画を一度に処理できます。
    9. この追跡時に勝利オートメーション プログラム自動的にマウス ポインターを移動するので、他の目的にこの PC を使用を回避します。次の手順で初期 9,000 フレームは破棄されます。
    10. 3 Perl スクリプト ファイル (1.fillupGaps2.pl、2.Calc_fish_id_moko_robust、および 3.pl、3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) を (ステップ 2.2.3 を参照) 'もと '奇妙な' のフォルダーに SwisTrack によって生成された追跡ファイルを含むフォルダーに割り当てます。
    11. VirtualDub を使用してビデオ ファイルからビデオの 1 つのフレームをクリップし、ImageJ に写真としてこのクリップをインポートします。ImageJ で水族館 (45.9 cm) の長さを選択し、ピクセル/cm 比率を計算します。テキスト エディター プログラムで1.fillGaps2.plピクセル/cm 比率を作成し、保存します。
    12. CygWin プログラム、Unix エミュレーターを起動します。コマンドラインでcdを使用して、3 つの Perl スクリプトを含む SwisTrack フォルダーを探します。
    13. Perl スクリプトを実行するには、 Perl の 1.fillGaps.plを入力します。これら 3 つの Perl スクリプトは、水族館のユニークな部屋に各追跡ファイルを割り当てる、魚は目がさめている睡眠の期間とスイミングの距離を分析します。分析が完了する 1-2 時間かかります。
    14. 分析から欠落したフレーム数が下がった; 場合を決定するためのSummary_Sleep.txtをという名前のテキスト ファイルを評価します。フレームの 15% 未満を行方不明は許容できると見なされます。
    15. マクロ ( Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsmの補足ファイル) のスプレッドシートとSummary_Sleep.txtから解析結果をコピペ。
    16. 追跡ファイルの概要のデータを抽出するマクロを実行します。

3. DASPMI または DASPEI 染色機械刺激受容オイカワ

注: DASPMI と DASPEI は、光に敏感な染色と暗いところで行う必要があります。例として DASPMI を使用しての DASPMI と DASPEI の両方、次のプロトコルです。

  1. プロトコルを汚す
    1. 染色原液 (25 μ g/mL) の 1 L の合計は、dH2O の 1 L に DASPEI または DASPMI の結晶の 0.025 g を追加し、一晩溶かすのよ。4 ° C で保存し、光から保護のソリューションを保持します。
    2. 2.5 μ g/mL DASPMI で魚を浸したり、エアコンの水に溶解した DASPEI (ステップ 1.3.1 を参照) 22 ° c. で暗い環境で 45 分
    3. 45 分後、魚を DASPMI または DASPEI ソリューションから削除し、66.7 μ g/ml のバッファー-エチル 3-アミノ安息香酸メタン スルホン酸塩 (MS222) のエアコンの水の氷浴に浸漬して麻酔。
    4. ペトリ皿プレートと蛍光顕微鏡下の写真の魚をマウントします。Z スタック画像を取るし、次の分析の .tif ファイルとして保存します。
  2. ImageJ を用いた画像解析
    1. .Tif ファイルを含むフォルダーの中 ImageJ マクロ ファイル (Neuromast_ImageJ.txt) のテンプレートを貼り付け、"Process_ImageJ"と題する新しいフォルダーを作成します。ImageJ のマクロ ファイル内のパスを現在のディレクトリに設定します。
    2. ImageJ を起動し、マクロを開くと、GUI にマクロ ファイルをドラッグするかをクリックしてファイル > 開くマクロ ファイルを選択するとします。
    3. クリックして、マクロを実行マクロ > マクロの実行。マクロは、分析対象とする画像ファイルを自動的に開き。画像ファイルが表示されない場合をクリックしてマクロ > ファイルを拾う。
    4. Neuromast 定量化、多角形ツールを使用して関心の領域を選択します。
    5. 関心の重複領域にホット キー 5をヒットします。
    6. ペイント ツールを使用して削除または前の画像から余分なまたは不足している neuromast のドットを追加し、 6を押して。6を押すと、2 つの新しいウィンドウが表示されます: 番号オイカワ ドット ・定量化合計オイカワとテーブルの方式。
    7. 両方のファイルを保存する7を打つ: 1 つのファイルは、.tif イメージ ファイルとして格納され、他は .xls ファイルとして保存されます。これらのファイルを格納した後、分析の新しい画像ファイルが開きます。
    8. マクロ スクリプト (SN_Number_Diameter.xlsm) を実行して、1 つのワークシートにそれぞれの魚の neuromast カウントを統合します。

結果

ここに記載した結果は、提示方法と取得することができるものの代表例です。したがって、結果は、血脈と実験条件によって表層魚群のここで示したものから少し逸脱できます。

魅力の振動挙動

図 3洞窟の表面魚 VAB の代表的な結果を見つけ...

ディスカッション

これらの提案手法は簡単にアクセスが、フリーウェア起源の性質を実行するために複雑にすることができます。したがって、試用版の試金および任意の実際の実験前に、解析を実行することを強くお勧めします。

データ生成の速度は、実験と解析のフレームワークを確立したら迅速に対応できます。いったん確立すれば、VAB の試金のための 7 分のレコードの 2 つの魚、?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

私たちはこの原稿で使用される実験魚の魚のケアのため N. チェトラーロ、N. サイモン、C. バルディーズ、c. Macapac、j. チョイ、L. Lu、j. グエン、S. Podhorzer、H. Hernandes、j. フォン、加藤淳子、I. 主を含む吉澤研究室のすべてのメンバーに感謝します。また、赤外線 CCD カメラを組み立てる私を訓練する p. Masek を含む A. キーン研究室メンバーを感謝いたします。最後に、ハワイ大学マノアの貴重なビデオ、特に B. スミス、j. ラムと S のホワイト メディア研究室 - 社会科学の大学 - 通信学校に感謝したいと思います。この作品は、ハワイのコミュニティ財団 (16CON 78919 と 18CON 90818) によって支えられたし、私に健康の日の出の国立研究所 (P20GM125508) を付与します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide)MilliporeSigmaD3418
880 nm wave length black lightAdvanced IlluminationBL41192-880
avfsfreewareVersion 1.0.0.6http://turtlewar.org/avfs/
AvisynthfreewareVersion 2.6.0http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
CygwinfreewareVersion 2.11.0https://www.cygwin.com/
Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish)Corning3140-10010 cm diameter 5 cm high
Ethovision XTNoldus Information  Technology, Wageningen, The NetherlandsVersion 14https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, BlackJardin (through Amazon.com)NASponge filter for Sleep/hyperactivity recording system
Grade A Brine shrimp eggsBrine shrimp directBSEA16Z
ImageJfreewareVersion 1.52ehttps://imagej.nih.gov/ij/
macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lensToyoNAAttach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer
Neutral RegulatorSeachemNA
Optical cast plastic IR long-pass filterEdmund optics43-948Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam
pfmapfreewareBuild 178http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom)
Reef Crystals Reef SaltInstant OceanRC15-10
SwisTrackfreewareVersion 4https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam)MicrosoftQ2F-00013Cut 2-2.5 cm of the front
WinAutomationfreewareVersion 8https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)
Windows operating systemMicrosoft7, 8 or 10https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfwfreewareNAhttps://sourceforge.net/projects/x264vfw/

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