Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים שיטות למחקר תפוקה גבוהה של סדרת cavefish מקסיקני התנהגויות, צביעת חיוני של מערכת mechanosensory. שיטות אלה להשתמש בקבצי script התוכנה-החופשית, מחוייט, מתן שיטה מעשית וחסכונית עבור המחקרים של התנהגויות.

Abstract

בעלי החיים שוכני המערה התפתחו סדרה של מאפיינים מורפולוגיים והתנהגותיים להסתגל לסביבות שלהם חשיבתו אפל, מזון-דליל. בין התכונות הללו, התנהגות הרעיה הוא אחד החלונות שימושי לתוך יתרונות פונקציונליים של האבולוציה תכונה התנהגותית. שהוצגו במסמך זה הן שיטות מעודכן לניתוח התנהגות המשיכה רטט (VAB: התנהגות אדפטיבית הרעיה) הדמיה של mechanosensors המשויכת של טטרה הותאם המערה, Astyanax mexicanus. בנוסף, שיטות מוצגים לצורך מעקב תפוקה גבוהה של סדרת התנהגויות cavefish נוספים כולל היפראקטיביות ושינה-הפסד. Cavefish גם להראות asociality, התנהגות שחוזרת על עצמה וחרדה גבוהה יותר. לכן, cavefish לשמש מודל חיה עבור התנהגויות מפותחת. שיטות אלה להשתמש בקבצי script התוכנה-החופשית, בהזמנה אישית שניתן להחיל על סוגי אחרים של התנהגות. שיטות אלה מספקים חלופות מעשי וחסכוני תוכנת מעקב זמינים מסחרית.

Introduction

טטרה מקסיקנית, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), מיוחד בין הדגים שיש שני morphs אלטרנטיביות שונות באופן קיצוני - מורף רואי, השטח-המגורים ואת מורף עיוורת, שוכני המערה מורכבת מכמה ברורים אוכלוסיות1. למרות שונה מורפולוגיה ופיזיולוגיה, הם עדיין interfertile2,3. אלה morphs interfertile להופיע התפתחו במהירות (~ 20,000 שנים)4, מה שהופך אותם מערכת מודל אידיאלי לחקר הסתגלותם המהירה. Cavefish ידועים חבילה של תכונות מורפולוגיים והתנהגותיים מתבדרת כולל צפיפות מוגברת של בלוטות הטעם, עלייה במספר mechanosensors, הרעיה התנהגות מכוון לתדר מסוים של גירוי רוטטת, היפראקטיביות, ו נדודי שינה. רבים של התנהגויות אלו ככל הנראה התפתח בו זמנית, אשר חלקם שהוצעו להיות יתרון בחשכת מערות שיחור מזון5 ושימור אנרגיה בסביבות כהה, מזון-דליל6,7.

במערכות רבות של המודל האבולוציוני, קשה לרכוש ידע משולב על שינוי התנהגות ומורפולוגיה כמה בעלי חיים בתגובה הסביבה כי רוב המינים מופצים מעבר הדרגתי מתמשך בסביבות מורכבות. עם זאת, הניגוד סטארק בין המערה של השטח מורף Astyanax שהתפתחו ב מאוד מנוגדים סביבות המותווית על ידי אקוטון חדה הובילה Astyanax המתעוררים כמודל מעולה כדי להבין את התפתחות בעלי חיים. הדבר מאפשר לקשר בקלות רבה יותר גנים ותהליכים התפתחותיים עם תכונות הסתגלות ומבחר בסביבה. יתר על כן, חקירות ביו האחרונים של תכונות אלה ב- Astyanax הראו כי התכונות הללו עשויים מקבילי הסימפטומים האנושי8,9,10. לדוגמה, הפסד של sociality ושינה, ורווח של קשב, התנהגות שחוזרת על עצמה, רמת הקורטיזול דומים מה נצפית בבני אדם עם הפרעת ספקטרום אוטיזם8.

כדי לטפל ההתפתחות שיתוף מורכבים של התנהגויות רבות תכונות מורפולוגיות, זה יתרון assay רבים מהם כדי לסמן מסלולים גנטית ומולקולרית המשמש כבסיס. שהוצגו במסמך זה הן שיטות אפיון מידת פנוטיפים התנהגותיים המערה-סוג של משטח המערה, היברידית morphs של Astyanax. ההתנהגויות מוקד ניתח לאפיין פנוטיפ הם למערה הותאם הרעיה התנהגות (רטט משיכה, המכונה מעתה ואילך VAB), היפראקטיביות/שינה משך11,12. הציג גם היא שיטת הדמיה של מערכת החישה המשויך VAB13. לאחרונה, תוכנת קוד פתוח מעקב רבים עבור הפעלת מבחני התנהגות הפכו זמינים14,15. אלה עובדים טוב מאוד עבור קטעי וידאו קצרים, פחות מ 10 דקות. עם זאת, הוא הופך להיות בעייתי אם הוידאו ארוך בגלל זמן חישוב/מעקב אינטנסיבי. תוכנה זמינים מסחרית מסוגל יכול להיות יקר. השיטות הציג בעיקר השתמש freeware, ולכן נחשבים חסכוניים ושיטות תפוקה גבוהה. נכללים גם התוצאות נציג מבוססים על שיטות אלה.

Protocol

כל הפרוצדורות מתבצעות לבצע את ההנחיות המתוארות "עקרונות של מעבדה חיה אכפת" (המכון הלאומי לבריאות פרסום מס' 85-23, תוקן 1985), שאושרו על-ידי האוניברסיטה של hawai ' i Manoa מוסדיים טיפול בעלי חיים, שימוש ועדת חיות פרוטוקול 17-2560-3.

1. רטט המשיכה התנהגות (VAB) assay (≤ 10 דקות עבור הליך הקלטת כולה)

הערה: השתמש מצלמת אינפרא אדום רגיש או לבנות מצלמת אינפרא-אדום על-ידי שינוי מצלמת אינטרנט USB. כדי לשנות את מצלמת אינטרנט USB, ראה תיאור מפורט שהוצגו על ידי המעבדה קין בנושא זה cavefish-יופיטר (מבעיה זו mexicanus א ), או תיאור קצר את החומרים המשלימים.

  1. הגדרת הקלטה
    1. כדי לוודא כי המצלמה תישאר בעמדה, עדיין, ו- אורך המוקד נכונה מ subject(s) מוקלטת, בונה מסגרת קופסה שחורה מחוץ פוליוויניל כלוריד (PVC) צינורות, מדידת 120 ס מ H x 45 ס מ L x 90 ס. מ. וו
    2. לאחר בניית המסגרת, לכסות את זה עם וילון האפלה פלסטיק כגון המלצותיה אחד לחקלאות הידרופוני.
    3. על גבי המסגרת, שמים לוח אקריליק שחור עם חלון עבור מצלמה אינפרא אדום במרכז מדידת הקוטר אותו כמו זום עדשה מתכוונן רכוב C. בתוך הקופסא הזו, מניחים את הציוד וזמינותו של VAB (איור 1).
  2. מכשיר רטט
    הערה: רעידות מיוצרים באמצעות גנרטור הפונקציה small.
    1. על השיטות הבאות, מנגינה ויברציות משרעת של 0.15 מ מ, תדירות של 40 הרץ, אשר הוא תדירות ולחושים היענות מקסימלית של משיכה5,16.
    2. לחבר את מחולל נואם בפני אופקי.
    3. לצרף מוט זכוכית בקוטר 7.5 מ מ 14 ס מ אורך מכסה האבק על הרמקול באמצעות דבק-חם או דבק של אטם.
    4. מאונך המוט, כשפניה כלפי מטה לצרף עוד 7.5 מ מ קוטר זכוכית רוד 4 ס"מ אורך (איור 1).
  3. Assay התנהגותית
    1. חבל על ניסיוני mexicanus א ארבעה ימים בחדר assay גלילי מלא במים ממוזגים (pH בין 6.8-7.0, מוליכות כ 700 µS, הלעפה תרוטרפמט 22 כ טמפרטורה) עם מחזור 12/12 L/D. בדוק אם דגים יש שאמבטיה על ידי התבוננות שלהם השהיה שננבור. השהיית זמן רב יותר מאשר במיכל בבית שלהם מציין עוד זמן להתאקלמות נדרש. ברחבי והפיזיולוגי, להאכיל פעם ביום עם הדברים Artemia בשידור חי.
    2. ביום שלפני יום וזמינותו (אחרי 3 ימים של להתאקלמות), להחליף מים בבית הבליעה assay מים מתוקים ממוזגים.
    3. ביום של וזמינותו (לאחר 4 ימי להתאקלמות), לשלול דגים ניסיוני של מזון עד השלמת וזמינותו. Satiation תשנה את תגובתם ויברציות.
    4. קבע את הפרמטרים הקלטה ב ה freeware VirtualDub17: 15 מסגרות בשנייה, ה-codec: x264vfw, הקלטה משך: 3 דקות 30 s.
    5. הכן את המנגנון פולט-רטט (ראה שלב 1.2) על ידי כוונון עד 40 הרץ. ראה איור 1 ההסבר של המנגנון. יש לשטוף את מוט זכוכית רוטטת עם מים יונים כדי להסיר את כל הכימיקלים מסיסים במים.
    6. עובד בחושך, למקם את הצילינדר assay על הבמה הקלטה מואר על ידי באקליט אינפרא-אדום הקופסה השחורה ולאפשר דגים להסתגלות למשך 3 דקות.
      1. לאחר בעזיבה 3 דקות, שיא 3 דקות 30 s של וידאו. מיד עם תחילת ההקלטה, הכנס את מוט זכוכית רוטטת עמודת המים (כ 0.5 ס מ עומק).
      2. להימנע מביצוע כל רעש או ויברציות תוך מיצוב מוט זכוכית רוטטת במים כמו הדגים יכול הגיוני אפילו את הפרעות קלות ביותר.
      3. סיום הליך זה בתוך 30 s להתחיל הקלטת וידאו כדי להבטיח כי נרשם יותר מ 3 דקות של ההתנהגות.
    7. לפקח על וידאו תוך כדי הקלטה כדי להבטיח כי אין שגיאות מתרחשות בשלב זה.
    8. לאחר שסיים את ההקלטה, להסיר את מוט זכוכית רוטטת מן החדר assay גלילי ולהסיר תא assay מהבמה הקלטה. חזור מ 1.3.5 שהדגים הבא.
  4. ניתוח וידאו
    הערה: המרת ה-codec לפורמט ImageJ ניתן לטעון עובד רק על מערכת ההפעלה Windows18 (טבלה 1).
    1. להמיר וידאו avi דחוס לפורמט קריא עבור ImageJ וניתוח הגדרת פרמטרים.
      1. התקנת AviSynth_260.exe (https://sourceforge.net/projects/avisynth2/), pfmap לבנות 178 (http://pismotec.com/pfm/ap/), avfs ver1.0.0.5 או ver1.0.0.6 (https://sourceforge.net/projects/avf/). שים לב שיטה זו הוא תוכנית/גירסה רגיש. הקישורים באתר ובלבד ינחה לגירסאות תקין (טבלה 1).
      2. הפעל קובץ אצווה על-ידי לחיצה כפולה על avs_creater.bat (קובץ משלים). לחץ לחיצה ימנית על קובץ הווידאו avs להיות מנותח (בחר מקבצי ה-avs שנוצרו על-ידי avs_creater.bat).
      3. כמו ניתוח וידאו באמצעות התוסף המעקב ב- ImageJ דורש טעינה של המאקרו ImageJ (קובץ משלים Macro_VAB_moko.txt), טען המאקרו על-ידי גרירה ושחרור המעטפת GUI של ImageJ. פקודת מאקרו זו תאפשר מסוימים מקשים חמים לניתוח הבא.
      4. בספריית העבודה, ליצור תיקיה חדשה בשם "Process_ImageJ".
      5. לחץ לחיצה ימנית על הקובץ .avs כדי להיות מנותח (בחר מקבצי ה-avs שנוצרו על-ידי avs_creater.bat). בחר באפשרות הר מהירה . לאחר שהקובץ avs נטענה בתור כונן חיצוני, פתח את הקובץ avi ב ImageJ (קובץ avi יש שם סוף עם ".avi").
      6. כדי להגדיר את היקף מרחק המדידה, בחר את הקוטר של התא assay על ידי ציור קו ישר על פני החדר באמצעות הכלי בחירה בקו ישרולאחר מכן לחץ על נתח > הגדר בקנה מידה פונקציה. לדוגמה, קלט 9.4 ס מ , אם באמצעות צלחת גלילי בקוטר פנימי 9.4 ס מ. סמן את התיבה רדיו של גלובל כדי לתקנן את קנה המידה על-פני כל הניתוחים הסרטונים הבאים.
    2. להמיר ערימה בינארית, להפעיל ניתוח.
      1. להעתיק האזור קאמרית assay באמצעות הכלי בחירה אליפסה , ואז לחץ לחיצה ימנית ובחר תמונה > שכפול. בשלב זה, ציין את הטווח של מסגרות לשמור על ניתוח נוסף, למשל, להשאיר את המסגרות 2,700 קודם לאחר המטה רוטטת נכנס למים (ב 15 fps שזה בדיוק 3 דקות של וידאו).
      2. החלק החיצוני של החדר assay ויכין להמיר תמונה בינארית על ידי להכות את המפתח חם 7 על הבר מספר של המקלדת.
      3. לאחר הרקע מנקה, תופיע הודעה שתדווח לו, להוסיף נקודה שחורה במרכזו כדי לציין את המיקום של מוט זכוכית רוטטת באמצעות הכלי בחירה אליפסה מוגדרים כבר שחור עם פונקציית מילוי . לחץ על אישור , תופיע הודעה שתדווח לעבור סף ההתאמה.
      4. הגדר את הסף להפוך תמונה בינארי (הכל שחור ולבן) של הדג. להתאים את הסף כך הדג ניתן לראות קטעי וידאו כולו, ולאחר מכן בחר החל.
      5. הפעל את התוסף "הגשש" על ידי להכות את חם מפתח 8 על הבר מספר. הגדר את גודל הפיקסל המזעריות 100 כאשר תתבקש לעשות זאת, כניסות אישור, יצירת המרחק בין מוט רוטטת הדג לכל מסגרות עבור כל 3 דקות של וידאו בינארי.
      6. התאם את המעקב אחר שגויה שנוצר על ידי רעש וידאו. כדי לעשות זאת, לבדוק את החלון תוצאות כדי לזהות את המסגרות המחזירים את האובייקט מספר 3 או גבוה יותר-? מצביע על האובייקטים המיותרים במסגרות אלה (למשל, חלקיקי המים או הגוון של הזרוע שקוף של המוט) בנוסף על "מקל" ו "דג" מסגרת. להסיר את כל האובייקטים המיותרים באמצעות הכלי מברשת צבע.
      7. פגע מפתח חם 9 על הבר מספר לייצוא ערימה בינארית של תמונות של הווידאו כולו (במקרה זה יש צורך לנתח מחדש), קובץ xls עם קואורדינטות ונתוני מרחק (משלים קבצים CF01.xls, Threshold_CF01.tif, Trac_CF01.tif ). מפתח חם 9 ייסגר גם כל הקבצים המשויכים הווידאו הנוכחי. חזור על הצעדים 1.4.2.1 דרך 1.4.2.6 משכפל כל.
      8. להריץ את הסקריפט מאקרו (קובץ משלים JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) לאחד את מספר המעקב התוצאה קבצים (. xls) לתוך גיליון אלקטרוני אחד ולספור את המספר ואת משך הזמן של גישות לתוך אזור 1.5 ס מ המוט. גישות לא שנמשך לפחות 0.5 s וויל לא ייספר. לשנות את הפרמטרים של מרחק וזמן נספר כ גישה על פי שאלות מסוים של עניין.
    3. שחרר את PC-שטח הדיסק לאחר סיום כל הבדיקות. הסר קבצים שנטענו כדי לפנות שטח דיסק - avi.avi ו. avi.avs קבצים (סיומות שנוצרו על-ידי התוכנה)-על-ידי הפעלת קובץ אצווה multiunmountdel.bat באותה תיקיה שבה הופעל avs_creater.bat במקטע 1.4.1.2.

2. שינה ואת וזמינותו היפראקטיביות (24 שעות הקלטה)

  1. Assay התנהגותית
    1. להתאקלם דגים ניסיוני חמישה ארבעה ימים או יותר בכל אחד של אקווריום אישית מעוצבת הקלטה אקריליק 10 L (45.9 ס מ x 17.8 ס"מ x 17.8 ס מ; אורך x רוחב x עומק, בהתאמה) מלא במים ממוזגים (ראה שלב 1.3.1).
      1. להפריד בין כל תא בודד עם לוחות אקריליק שחור עושה צ'יימברס שווים בגודלם, מדידת 88.9 מ"מ × 177.8 × 177.8 מ (איור 2). הקפד לכסות את טנק אחד כדי למנוע קפיצות בין תאי דגים.
      2. את הטיימר ניתן לתיכנות כוח כדי באופן אוטומטי להפעיל LED לבן אור במשך 12 שעות, וגם עבור 12 שעות כל יום בתקופה להתאקלמות (לדוגמה, להגדיר את האור דולק ב-7 בבוקר לסירוגין בשעה 19:00). זה entrain את שעון ביולוגי של דגים (אם זה רגישים entrainment).
      3. להשתמש לוחות אקריליק לבן, אטום של ממד דומה למיכל 10 L רשתות ומפזרים לעבור אור אינפרא-אדום ולבן דרך כדי לספק אור מפוזר בעוצמה אפילו על פני כל הטנקים.
      4. ברחבי והפיזיולוגי, ניזונים פעם אחת ביום עם חיה Artemia הדברים ולספק לערבב דרך ספוג מסננים באקווריום כל.
        הערה: ודא הדגים ניזונים בזמנים עקבית (קרי, 1 x לכל יום ב 9 בבוקר...) כמו זמן האכלה יכולים להשפיע גם על entrainment של השעון הביולוגי19.
      5. בדוק אם יש להפוך שאמבטיה דגים על ידי התבוננות שלהם השהיה שננבור. השהיית זמן רב יותר מאשר במיכל בבית שלהם מציין עוד זמן להתאקלמות נדרש.
    2. יום קודם ליום של וזמינותו (3 ימים או יותר והפיזיולוגי של), להחליף את המים בבית הבליעה assay עם טרי ממוזגים מים (ראה שלב 1.3.1).
    3. להגדיר את הפרמטר הקלטה תוכנה VirtualDub17: 15 מסגרות בשנייה, ה-codec: x264vfw, הקלטה משך: 86,400 s (24 שעות).
    4. להדליק את התאורה האחורית אינפרא-אדום מאחורי הבמה הקלטה (ראה איור 2). על ידי התבוננות בתמונה VirtualDub בשידור חי על המסך, להתאים את מיקום האקווריום כדי להפוך אותם מול מצלמה USB.
    5. ביום של הקלטה, להאכיל כל דג עם הדברים Artemia בשידור חי, להסיר את כל המסננים ספוג, והפעל את התאורה האחורית אינפרא-אדום.
    6. להתחיל 24 שעות הקלטה בבוקר (לדוגמה, זמן ההתחלה הוא 9:00 בבוקר ו סיום השעה 9:00 בבוקר למחרת). להתחיל לכידת הוידאו ולאבטח את המיקום כדי למנוע הפרעה. בדוק מעת לעת כי ההקלטה פועל.
    7. לאחר 24 שעות, ודא כי הווידאו נשמר כראוי. העברת הוידאו תחנת PC כדי לעקוב אחר ניתוח ההתנהגות של הדג.
  2. ניתוח וידאו
    1. תחילה, בדוק את איכות הווידאו על ידי הסתכלות על התאורה. בדוק אם יש דג אחד בכל מקטע, ואם ישנם כל תנועות זרים שעלולים לגרום מעקב בצורה שגויה.
    2. הכינו את המסיכה כדי למנוע מעקב שגויה מחוץ לאקווריום. מכין מסיכות שני: אחד עבור 'אפילו' ואחד עבור דג "מוזר", המבוסס על סדר רצף הטנקים.
    3. להפוך תיקיות שני בשם "מוזר", "וגם" עבור המסיכות שתוארו לעיל. להזיז את המעקב אחר קובץ פרמטר של SwisTrack בכל אחת מתיקיות אלה.
    4. פתח את המעקב אחר קובץ פרמטר של SwisTrack מעקב תוכנה (קובץ משלים Tracking_odd.swistrack או Tracking_even.swistrack). לציין את הנתיב אל קובץ הווידאו ואת מסכת קובץ, ולאחר מכן שמור וצא החוצה המעקב אחר קובץ פרמטר. התאמת בועה ומספר פיקסלים מרבי בפרמטרים "בועה זיהוי" ו "הקרוב שכן מעקב" רכיבים, בהתאמה, על פי הניסויים.
    5. לחץ פעמיים כדי להפעיל קובץ script של תוכנות win-אוטומציה אשר ייפתח אוטומטית SwisTrack תוכנה (קובץ משלים swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe או swistrack_4.exe- אלו הם כל אותם הקבצים הפעלה), אשר מסייע עדכון חיסור רקע מסתגלת ב- SwisTrack.
    6. פתח Tracking_odd.swistrack או Tracking_even.swistrack SwisTrack תוכנה כדי לטעון את המעקב אחר קובץ פרמטר. לאחר טעינת הפרמטרים, לחץ על לחצן הפעלה כדי להתחיל לנהל מעקב אחר.
    7. בתוך המסגרות 9,000 הראשונית (600 s, קרי: הראשון 10 דקות של הווידאו המוקלט), לבדוק אם הדגים מעקב עובד על ידי הסתכלות על רקע מסתגלת החיסור, מסכה בינארי, ו הקרוב שכן מעקב ברשימה רכיב של SwisTrack (ראה וידאו המלווה). לאחר מכן בחר רקע מסתגלת חיסור ברשימה רכיב.
    8. תלחץ על הכפתור R במקלדת כדי לחדש לנצח-אוטומציה ולהשאיר את המחשב כדי לעקוב אחר. מעקב אחר ייקח 5-7 h לכל 24 שעות וידאו עבור מחשב שולחני עם מעבד 4 ליבות ו-8 GB של זיכרון. בהתאם לצרכים, להפעיל תהליכים SwisTrack מרובים (כולל ארנאס האי-זוגיים של קובץ וידאו יחיד) מספר ליבות ב- CPU. לדוגמה, 4-ליבות יכול לטפל 4 סרטונים בו-זמנית.
    9. במהלך המעקב, הימנע משימוש מחשב זה למטרות אחרות כי win-אוטומציה התוכנית באופן אוטומטי מעביר את מצביע העכבר. המסגרות 9,000 הראשונית יבוטלו בהליך הבא.
    10. הקצאת קבצי script Perl 3 (1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust, 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl) אל התיקיה המכילה את קבצי מעקב שנוצרו על-ידי SwisTrack בתיקיות '' ואי-זוגיות '' (ראה שלב 2.2.3).
    11. קליפ מסגרת אחת של וידאו מקובץ הווידאו באמצעות VirtualDub וייבא קליפ זה כמו צילום אל ImageJ. בחר את אורך האקווריום (45.9 ס מ) ב- ImageJ, לחשב יחס פיקסל/cm. לכתוב את היחס פיקסל/ס מ 1.fillGaps2.pl ב תוכנית עורך טקסט ולשמור.
    12. הפעל תוכנית CygWin, אמולטור Unix. אתר את התיקיה SwisTrack המכיל את קבצי ה-script של Perl 3 באמצעות תקליטור בשורת הפקודה.
    13. להריץ את הסקריפט Perl על-ידי הקלדת Perl 1.fillGaps.pl. אלה שלושה סקריפטים Perl להקצות כל קובץ מעקב תא ייחודי של האקווריום ולנתח המרחק משך ושחייה שינה ואילו הדג היה ער. זה ייקח 1-2 h כדי לסיים את הניתוח.
    14. להעריך את קובץ הטקסט בשם Summary_Sleep.txt כדי לקבוע אם המספר של מסגרות שהושמטו מניתוח נמוכה בצורה מתקבלת על הדעת; חסר פחות מ 15% של מסגרות נחשב מקובל.
    15. העתק והדבק את התוצאות שנותחה מ Summary_Sleep.txt גיליון אלקטרוני עם המאקרו (קובץ משלים Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm).
    16. הפעל את המאקרו כדי לחלץ את הנתונים סיכום של מעקב אחר קבצים.

3. DASPMI או DASPEI מכתים של mechanosensory neuromasts

הערה: DASPMI ו DASPEI מכתים רגישים לאור וזה צריך להיעשות בתנאים כהה. ע פ הפרוטוקול היא גם DASPMI וגם DASPEI באמצעות DASPMI כדוגמה.

  1. צביעת פרוטוקול
    1. עבור סכום כולל של 1 ליטר של צביעת מניות פתרון (25 µg/mL), להוסיף 1 ליטר של dH2O g 0.025 של גבישים DASPEI או DASPMI ולתת לו להתמוסס במשך הלילה. שמור פתרון האחסון ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
    2. לטבול את הדג ב- 2.5 µg/mL DASPMI או DASPEI מומס במים ממוזגים (ראה שלב 1.3.1) למשך 45 דקות בסביבה חשוכה-22 מעלות צלזיוס.
    3. לאחר 45 דק ', הסר דגים הפתרון DASPMI או DASPEI, עזים ומתנגד על ידי טבילה באמבט קרח-מים ממוזגים עם µg/mL 66.7 באגירה-אתיל 3-aminobenzoate מתאן סולפונאט מלח (MS222).
    4. הר דגים בצלחת פטרי, צילום במיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונות z-מחסנית, לשמור כקבצי. tif לניתוח הבא.
  2. ניתוח התמונה באמצעות ImageJ
    1. בתוך התיקיה המכילה קבצי. tif, הדבק תבנית של קובץ מאקרו ImageJ (Neuromast_ImageJ.txt), צור תיקיה חדשה בשם "Process_ImageJ". בקובץ מאקרו ImageJ, להגדיר את הנתיב לספריה הנוכחית.
    2. ImageJ ולפתיחת המאקרו על-ידי גרירת קובץ מאקרו לתוך GUI או על-ידי לחיצה על קובץ > פתח , בחירת קובץ מאקרו.
    3. הפעל את המאקרו באמצעות לחיצה על מאקרו > הפעל מאקרו. המאקרו ואז נפתחת באופן אוטומטי קובץ תמונה כדי להיות מנותח. אם קובץ התמונה לא נפתח, לחץ על מאקרו > קובץ לאסוף.
    4. על כימות Neuromast, בחר את אזור עניין בכלי מצולע.
    5. פגע מפתח חם 5 לאזור כפולים של עניין.
    6. השתמש בכלי ' צייר ' כדי להסיר או להוסיף נקודות מיותרות או חסרות neuromast מהתמונה הקודמת ואח כ 6. לאחר שפגע 6, יופיעו שני חלונות חדש: ערכה של נקודות neuromasts ממוספרים, שולחן עם neuromasts הכולל לכמת.
    7. פגע 7 לשמור שני קבצים: אחד הקובץ מאוחסן כקובץ תמונה. tif ו האחר נשמר כקובץ. xls. אחרי קבצים אלה מאוחסנים, קובץ תמונה חדש ייפתח לניתוח.
    8. לאחד הסעיפים neuromast של כל דג לגיליון אחד על-ידי הפעלת מאקרו התסריט (SN_Number_Diameter.xlsm).

תוצאות

התוצאות שהוצגו במסמך זה הן דוגמאות מייצגות של מה ניתן לרכוש עם השיטות שהוצגו. לכן, התוצאות ניתן לסטות מעט לבין אלו המובאות כאן הן cavefish והן דגים השטח בהתאם לתנאי הניסוי.

התנהגות המשיכה רטט

ניתן למצ...

Discussion

שיטות אלה שהוצגו קל לגישה אבל יכול להיות מסובך לביצוע בשל אופיו של מקורותיה freeware. לכן, מומלץ מאוד לבצע מבחני ניסיון וניתוחים לפני כל ניסויים בפועל.

קצב נתונים הדור יכול להיות מהירה ברגע הוקם במסגרת ניסיוני אנליטיים. הוקמה לאחר, זה אפשרי להקליט שני דגים ב- 7 דקות לקבלת VAB וזמינ?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לכל חברי המעבדה יושיזאווה כולל Cetraro ש ש סיימון, ג ולדז, ג Macapac, ג'יי צ'וי, ל' Lu, ג'יי נגוין, ס פודהורצר, ה Hernandes, פונג ג'יי, ג'יי קאטו, אני לורד לטיפול דגים על הדגים נסיוני בשימוש כתב היד הזה. אנו מודים גם חברי המעבדה קין א כולל עמ' Masek לאמן שלי להרכיב מצלמת IR CCD. לבסוף, ברצוננו להודות את מעבדת המדיה - המכללה למדעי החברה - בית הספר לתקשורת האוניברסיטה של hawai ' i Mānoa על עזרתם לא בפז עם ביצוע הווידאו, סמית ב', ג' לאם ולבן ס במיוחד. עבודה זו נתמכה על ידי קרן קהילתית הוואי (16CON-78919 ו- 18CON-90818), המכון הלאומי של הבריאות NIGMS (P20GM125508) מעניק שלי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide)MilliporeSigmaD3418
880 nm wave length black lightAdvanced IlluminationBL41192-880
avfsfreewareVersion 1.0.0.6http://turtlewar.org/avfs/
AvisynthfreewareVersion 2.6.0http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
CygwinfreewareVersion 2.11.0https://www.cygwin.com/
Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish)Corning3140-10010 cm diameter 5 cm high
Ethovision XTNoldus Information  Technology, Wageningen, The NetherlandsVersion 14https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, BlackJardin (through Amazon.com)NASponge filter for Sleep/hyperactivity recording system
Grade A Brine shrimp eggsBrine shrimp directBSEA16Z
ImageJfreewareVersion 1.52ehttps://imagej.nih.gov/ij/
macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lensToyoNAAttach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer
Neutral RegulatorSeachemNA
Optical cast plastic IR long-pass filterEdmund optics43-948Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam
pfmapfreewareBuild 178http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom)
Reef Crystals Reef SaltInstant OceanRC15-10
SwisTrackfreewareVersion 4https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam)MicrosoftQ2F-00013Cut 2-2.5 cm of the front
WinAutomationfreewareVersion 8https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)
Windows operating systemMicrosoft7, 8 or 10https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfwfreewareNAhttps://sourceforge.net/projects/x264vfw/

References

  1. Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
  2. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), (1977).
  3. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) - Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  4. Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
  5. Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  6. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
  7. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
  8. Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
  9. Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
  10. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
  11. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
  12. Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  13. Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Developmental Biology. 441 (2), 262-271 (2018).
  14. Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
  15. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  16. Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
  17. Lee, A. . Virtualdub. , (2014).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  19. Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
  20. Swimmer, B., Lang, H. H. . Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), 233-246 (1980).
  21. Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. . Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), 195-196 (1987).
  22. Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
  23. Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
  24. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
  25. Rasband, W. S. . Object Tracker. , (2000).
  26. Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , (2012).
  27. Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. . SwisTrack. , (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

146mechanosensorystygobiontsAstyanaxfreeware

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved