JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه المخطوطة بروتوكولًا تجريبيًا لتقييم الخصائص المورفولوجية والحالة الوظيفية لمناصات المشبك الشريطية في الفئران العادية. النموذج الحالي هو أيضا مناسبة للنماذج التي تسببها الضوضاء والمرتبطة بالعمر cochlear متشابك المشبك. كما تتم مناقشة النتائج النسبية لدراسات الماوس السابقة.

Abstract

خلايا الشعر الداخلية القوقعة (IHCs) نقل الإشارات الصوتية إلى الخلايا العصبية العقدة دوامة (SGNs) من خلال نقاط الاشتباك العصبي الشريط. وقد أشارت العديد من الدراسات التجريبية إلى أن نقاط الاشتباك العصبي لخلايا الشعر قد تكون الأهداف الأولية في فقدان السمع الحسي العصبي (SNHL). وقد اقترحت هذه الدراسات مفهوم "اعتلال الشبكية" القوقعة، الذي يشير إلى التعديلات في عدد متشابك الشريط، أو الهيكل، أو وظيفة التي تؤدي إلى انتقال متشابك غير طبيعي بين IHCs وSGNs. في حين أن اعتلال الشبكي القوقعة لا رجعة فيه، فإنه لا يؤثر على عتبة السمع. في النماذج التجريبية الناجمة عن الضوضاء، يتم استخدام الأضرار المقيدة لنقاط الاشتباك IHC في مناطق تردد مختارة لتحديد العوامل البيئية التي تسبب على وجه التحديد اعتلال المشبك، فضلا عن العواقب الفسيولوجية لإزعاج هذه الأذن الداخلية الدائره. هنا، نقدم بروتوكول لتحليل مورفولوجيا متشابك القوقعة وظيفة في منطقة تردد محددة في الفئران الكبار. في هذا البروتوكول، يتم إجراء توطين القوقعة في مناطق تردد محددة باستخدام خرائط تردد المكان بالاقتران مع بيانات cochleogram، وبعد ذلك يتم تقييم الخصائص المورفولوجية لنقاط الاشتباك العصبي الشريطية عن طريق متشابك تلطيخ المناعة. ثم يتم تحديد الوضع الوظيفي لنقاط الاشتباك العصبي الشريط على أساس السعة من استجابة جذع الدماغ السمعي (ABR) موجة I. ويبين هذا التقرير أن هذا النهج يمكن استخدامه لتعميق فهمنا للأمراض وآليات الخلل المتشابك في القوقعة، مما قد يساعد في تطوير تدخلات علاجية جديدة.

Introduction

يمكن أن ينظر البشر إلى الترددات التي تتراوح بين 20 و201220,000 هرتز تقريباً على أنها محفزات سمعية. عادة ما تكون السمع البشري أكثر حساسية بالقرب من 1000 هرتز، حيث يبلغ متوسط مستوى ضغط الصوت 20 درجة مئوية في البالغين الصغار (أي 0 ديسيبل من مستوى ضغط الصوت [dB SPL]). في بعض الحالات المرضية، يقتصر فقدان السمع على ترددات محددة. على سبيل المثال، في المراحل المبكرة من فقدان السمع الناجم عن الضوضاء (NIHL)، يمكن ملاحظة "درجة" (أي ارتفاع عتبة السمع) في الرسم الصوتي عند kHz4 1. على طول قسم القوقعة الثدييات، تدرجاتها من صلابة وكتلة تنتج خريطة تردد الأسي، مع الكشف عن الصوت عالية التردد في قاعدة القوقعة والكشف عن التردد المنخفض في قمة2. في الواقع، هناك خريطة cochlear مكان تردد على طول الغشاء القاعدي، مما يؤدي إلى ما يعرف باسم منظمة التنورة2،3. كل مكان معين على غشاء باسيلار لديه أعلى حساسية لتردد صوت واحد فقط معين، والذي يسمى عادة التردد المميز3،4، على الرغم من أن الردود على الترددات الأخرى يمكن أيضا أن يلاحظ.

حتى الآن، تم استخدام نماذج الماوس المختلفة للتحقيق في الوظيفة العادية، والعمليات المرضية، والفعالية العلاجية في النظام السمعي. المعرفة الدقيقة للمعلمات الفسيولوجية في القوقعة الماوس هو شرط مسبق لمثل هذه الدراسات من فقدان السمع. وينقسم قوقعة الماوس تشريحيا إلى المنعطفات apical، الأوسط، والقاعدية، والتي تتوافق مع مناطق تردد مختلفة. من خلال وضع العلامات على afferents العصب السمعي في نواة القوقعة لتحليل مواقع التعصيب المحيطي المقابلة في القوقعة، نجح مولر وآخرون في إنشاء خريطة تردد مكان القوقعة في الماوس العادي في الجسم الحي5. في الفاصل الزمني من 7.2-61.8 كيلو هرتز، والذي يتوافق مع المواقف بين 90٪ و 10٪ من الطول الكامل للغشاء القاعدي، يمكن وصف خريطة تردد مكان قوقعة الماوس بواسطة وظيفة الانحدار الخطي بسيطة، مما يشير إلى وجود علاقة بين تطبيع المسافة من قاعدة القوقعة ولوغاريتم الترددالمميز 5. في الفئران المختبرية، يمكن استخدام خريطة تردد المكان لاستكشاف العلاقة بين عتبات السمع ضمن نطاقات تردد محددة ومخططات cochleograms التي تبين أعداد خلايا الشعر المفقودة في المناطق النسبية على طول الغشاء القاعدي6. الأهم من ذلك، توفر خريطة تردد المكان نظام تحديد المواقع للتحقيق في الحد الأدنى من الأضرار الهيكلية، مثل الأضرار التي لحقت نقاط الاشتباك العصبي الشريط من خلايا الشعر في مواقع محددة تردد القوقعة في الفئران مع الصدمة السمعية الطرفية7 ،8.

في القوقعة الثدييات، يتكون نقاط الاشتباك العصبي الشريط من الشريط presynaptic، والإسقاط كثيفة الإلكترون أن الحبال هالة من الحويصلات متشابك جاهزة للإفراج تحتوي على الغلوتامات داخل IHC، وكثافة postsynaptic على المحطة العصبية من SGN مع مستقبلات الغلوتامات9. أثناء [قlear] صوة [ترندوسكأيشن], ينتج إنحراف من الشعر خلية حزمة في [إيهك] [دّوكأيشنل], أيّ يقود إلى [غلومت] إطلاق من [إيهك] على ال [ستبّيبتيك] [أفيرنت] انتهائيّة, بذلك ينشط المسار سمعيّة. تفعيل هذا المسار يؤدي إلى تحويل الإشارات الميكانيكية التي يسببها الصوت إلى رمز معدل في SGN10. في الواقع، فإن مشبك الشريط IHC متخصص للغاية لنقل الصوت الذي لا يكل بمعدلات مئات من هيرتز مع دقة زمنية عالية، وله أهمية حاسمة لآليات presynaptic من ترميز الصوت. وقد كشفت الدراسات السابقة أن نقاط الاشتباك العصبي الشريط تختلف اختلافا كبيرا في الحجم والعدد في مناطق تردد مختلفة في القوقعة الماوس الكبار11،12، مما يعكس على الأرجح التكيف الهيكلي لالترميز الصوت معينة ل احتياجات البقاء على قيد الحياة. في الآونة الأخيرة، أظهرت الدراسات الحيوانية التجريبية أن اعتلال الشبكيالق يساهم في أشكال متعددة من ضعف السمع، بما في ذلك فقدان السمع الناجم عن الضوضاء، وفقدان السمع المرتبط بالعمر، وفقدان السمع الوراثي13، 14- وهكذا، فإن أساليب تحديد التغيرات المترابطة في عدد متشابك، وهيكل، ووظيفة في مناطق تردد محددة قد استخدمت بصورة متزايدة في دراسات التطور السمعي وأمراض الأذن الداخلية، وذلك باستخدام النماذج التي تم إنشاؤها عن طريق المعالجة التجريبية للمتغيرات الوراثية أو البيئية15،16،17.

في هذا التقرير، نقدم بروتوكول او تحليل عدد متشابك، وهيكل، وظيفة في منطقة تردد محددة من غشاء القاعدية في الفئران الكبار. يتم إجراء تعريب تردد القوقعة باستخدام خريطة تردد مكان معين في تركيبة مع مخطط قوقعة. يتم تقييم الخصائص المورفولوجية الطبيعية لمناقانات الشريط القوقعة عن طريق تلطيخ المناعة presynaptic وpostsynaptic. يتم تحديد الحالة الوظيفية لمناقان اتّشبك شريط القوقعة استناداً إلى السعة فوق العتبة للموجة ABR I. مع تعديلات طفيفة، يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص الظروف الفسيولوجية أو المرضية في النماذج الحيوانية الأخرى، بما في ذلك الفئران والخنازير غينيا، وgerbils.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لدليل NRC/ILAR لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الطبعة الثامنة). تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة كابيتال الطبية، بكين، الصين.

1. اختيار الحيوانات

  1. لجميع التجارب، استخدم الفئران الذكور C57BL/6J الكبار (8 أسابيع من العمر) كنموذج حيواني.
    ملاحظة: C57BL/6J الفئران تحمل متغير لصق من Cdh23 المعرض تسارع الحساسية في النظام السمعي، وينعكس على أنها خسارة 40٪ من نقاط الاشتباك العصبي الشريط في الدورة القاعدية من القوقعة وفقدان 10٪ في منتصف بدوره من 6 أشهر من العمر، تليها سريعة زيادة هذه الخسارة في القوقعة كلها مع سن18،19. وبالتالي، فإننا ننصح الحذر عند استخدام الفئران C57BL/6J أقدم من 6 أشهر للبحوث السمعية. ويمكن استخدام سلالات أخرى من الفئران اعتمادا على أهداف تجريبية محددة.
  2. فحص الفئران باستخدام منظار أوتوسكوب جيب تشخيصي احترافي لاستبعاد أمراض الأذن الخارجية أو المتوسطة قبل إجراء تقييمات السمع. قد تشمل العلامات المحتملة السوائل أو القيح في القناة السمعية الخارجية، والاحمرار والتورم في الأنسجة المحلية، وثقب غشاء الطبل.
    ملاحظة: على الرغم من أن هذا نادرا ما يواجه، بمجرد تحديدها، ينبغي استبعاد الفئران مع أمراض الأذن الخارجية أو المتوسطة.

2. تقييم السمع

  1. تخدير الفئران باستخدام حقن داخل اقابية لخليط من هيدروكلوريد الكيتامين (100 ملغم/كغم) وهيدروكلوريد إكسلازين (10 ملغم/كغم). الحكم على عمق التخدير عن طريق المحفزات المؤلمة (على سبيل المثال، رد الفعل بقرصة القدم).
    ملاحظة: عندما يكون رد الفعل بقرصة القدم غائباً تماماً، وصل الحيوان إلى عمق كاف ٍ من التخدير للاختبار السمعي. إذا كان هناك حاجة إلى مزيد من الوقت لتسجيلات ABR الثنائية, إدارة جرعة أقل (خمس الجرعة الأصلية) من التخدير لاستعادة الطائرة التخدير الأصلي. الحرص على تجنب جرعة زائدة مخدر، وهذا قد يؤدي إلى الموت في الفئران.
  2. الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان التخدير عند 37.5 درجة مئوية باستخدام وسادة التدفئة الحرارية. ضع الحيوان المُعَلَّب في غرفة محمية كهربائياً وصوتياً لتجنب التداخل طوال اختبار السمع.
    ملاحظة: الحفاظ على درجة الحرارة الفسيولوجية خلال الإجراء بأكمله حتى يكون الحيوان مستيقظا تماما، من أجل منع الوفاة الناجمة عن انخفاض حرارة الجسم بعد التخدير.
  3. وضع أقطاب إبرة تحت الجلد (20 مم، 28 غ) في رأس الجمجمة (قطب التسجيل)، في المنطقة النكفية ipsilateral تحت بينا الأذن المقاسة (القطب المرجعي)، وفي المنطقة النكبوية المنعكسة (القطب الأرضي)، بعمق 3 مم تحت جلد رأس الماوس، على التوالي20.
  4. استخدم مكبر صوت مغلق للأداء التحفيز الصوتي عبر أنبوب بلاستيكي بحجم 2 سم مع طرف مخروطي الشكل. تناسب غيض في قناة الأذن الخارجية21.
    ملاحظة: تأكد من أن المعاوقة الكهربائية في الأقطاب الكهربائية للتسجيل والمرجع أقل من 3 كم (عادة 1 كم). إذا كانت المقاومة عالية، قم بتغيير موقع الإدراج للقطب الكهربائي، أو نظف القطب بالكحول، أو استبدل القطب لتجنب التعديلات في سعة موجة ABR.
  5. لتسجيل ABR، توليد نقطة لهجة (3 مللي ثانية مدة، 1 مللي ثانية ارتفاع / سقوط مرات، بمعدل 21.1/ثانية، تردد: 4-48 كيلوهرتز) وتقديمها في خفض SPLs من 90 إلى 10 ديسيبل في 5\u201210 ديسيبل SPL الخطوات20. وخلال هذه الخطوة، يتم تضخيم الاستجابات (000 10 مرة)، وتصفيتها (0.1-3 كيلوهرتز)، ومتوسطها (024 1 عينة/مستوى التحفيز).
    ملاحظة: يتم جمع ABRs لكل مستوى من مستويات التحفيز في 10 خطوات ديسيبل، مع 5 dB خطوات إضافية بالقرب من العتبة.
  6. في كل تردد، حدد عتبة ABR، التي تشير إلى الحد الأدنى من SPL مما يؤدي إلى تسجيلABR موثوق بها مع واحد أو أكثر من موجات مميزة التي يمكن تحديدها بوضوح عن طريق التفتيش البصري (الشكل 1).
    ملاحظة: عادة ما يكون من الضروري تكرار عملية SPLs منخفضة حول العتبة لضمان اتساق الموجي. وعتبة الاستجابة هي أدنى مستوى من الحوافز يمكن عنده ملاحظة شكل الموجة، عندما يؤدي انخفاض قدره dB 5 إلى اختفاء الموجي.

3. معالجة أنسجة القوقعة

  1. بعد تسجيل ABR، قتل الفئران التخدير عن طريق خلع عنق الرحم، وقطع رأسها، وفضح البولا من الجانب البطني، وفتح مع مقص حاد للوصول إلى القوقعة.
  2. باستخدام ملقط غرامة، وإزالة العظام الزمنية، وفصل الشريان الأشرطة، وإزالة الأشرطة من النافذة البيضاوية، وتمزق غشاء النافذة المستديرة. جعل حفرة صغيرة في قمة القوقعة عن طريق تدوير بلطف غيض من إبرة (13 ملم، 27 G).
  3. إصلاح العظام المعزولة مع 4٪ (الوزن / المجلد) paraformaldehyde في 0.1 M الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. باستخدام ماصة ذات رؤوس رفيعة، قم بالتدفق بلطف من خلال المساحات المحيطة بلمفية عبر التطبيق على النوافذ البيضاوية أو الدائرية (كمدخول) والفتحة عند القمة (كمنفذ).
    ملاحظة: تتطلب بعض البروتينات مدة قصيرة من التثبيت لتجنب تدمير الربية الخاصة بها للحصول على علامات مناعية. في مثل هذه الحالات، حضانة العظام في 4٪ بارافورمالدهايد في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 2 ساعة، اعتمادا على تعليمات الشركة المصنعة لالكيمياء المناعية. ويمكن أيضا أن يتم التثبيت عن طريق التسريب القلبي لإزالة الدم قوقعة الأذن، وتجنب الضوضاء الخلفية بسبب تلطيخ غير محددة في مراحل لاحقة، وخاصة في نماذج الماوس من اعتلال الشبكي القوقعة.
  4. شطف العظام ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع 0.1 M PBS الباردة لإزالة paraformaldehyde المتبقية. صائق العظام مع 10٪ حمض الإيثيلين ديايمينتيراسيتيك (EDTA) إما في RT لمدة 4 ساعة أو في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة عن طريق هز لطيف في شاكر أفقي في 20 دورة في الدقيقة. يمكن تحديث EDTA في منتصف الطريق.
    ملاحظة: وتخضع أوقات الشارات لتركيز EDTA وتفضيلات المستخدمين. يجب أن تحافظ الأنسجة الصائق على درجة معينة من المتانة، مما يسهل التلاعب في عزل القوقعة الكاملة يتصاعد في الخطوات اللاحقة. يمكن أن تكون العظام الزمنية صائق في 10٪ EDTA مع التناوب، مما يسمح للباحثين بمغادرة المختبر بعد اختبارات ABR وتجارب التثبيت. وقت الشارات مرنة في حدود 20 إلى 30 ساعة عند 4 درجة مئوية.
  5. نقل عظم ة صدّقة زمنية من EDTA إلى 0.1 M PBS. استخدام #3، #5 ملقط Dumont وإبرة 27 G لتشريح مناطق القوقعة apical، الوسطى والقاعدية بدورها ومن ثم تشريح القوقعة من العظام تحت مجهر تشريح ستيريو (كما هو موضح سابقا22). جعل سلسلة من التخفيضات الصغيرة على طول الرباط الحلزوني باستخدام شفرة الحلاقة، وإزالةالغشاء tectorial وغشاء ريسنر (الشكل 2).
    ملاحظة: طالما أن القوقعة تشريح سليمة، يمكن تعديل هذه العملية وفقا للبروتوكول المعتاد للمشغل الفردية.
  6. مزيد من تشريح ظهارة السمعية المتبقية بما في ذلك الأطراف الحلزونية في المنعطفات القوقعة الفردية (قمة، وسط، وقاعدة مع منطقة هوك) للاستعدادات جبل كامل.
  7. تحت هدف زيت 40x من المجهر الخفيف، وقياس طول الغشاء القاعدي مع مقياس 250 درجة مئوية وضعت في العدسة، والتي يمكن تعديلها على طول stereocilia من IHCs.
  8. حساب طول كل بدوره قوقعة الأذن عن طريق إضافة جميع أطوال قطعة (250 ميكرومتر لكل قطعة)، وفي الوقت الذي تحصل على الطول الإجمالي للغشاء القاعدي عن طريق جمع أطوال كل منعطف.
  9. تحويل الطول الإجمالي للغشاء القاعدي بما في ذلك منطقة هوك إلى نسبة مئوية على أساس المسافة من قمة القوقعة (0٪ يشير إلى قمة القوقعة، 100٪ إلى قاعدة قوقعة).
  10. تحويل هذه المسافة إلى تردد مميز قوقعة باستخدام دالة لوغاريتمي (د)٪) = 1 - 156.5 + 82.5 × log(f)، مع ميل التردد 1.25 مم/اوكتاف، حيث d هو المسافة الطبيعية من قمة القوقعة في النسبة المئوية، و التردد في كيلوهرتز)، كماهو موضح سابقا 5،6. لذلك تردد مدى في منطقة مقابلة من الغشاء [بسّر] على كلّ قوقعة دورة يستطيع كنت اكتسبت.

4. تلطيخ الفلورة المناعية

  1. بعد تشريح، وضع كل بدوره قوقعة في أنبوب الطرد المركزي 2.5 مل منفصلة والحاضنة قوقعة يتحول في 10٪ مصل الماعز / PBS / 0.1٪ تريتون X-100 لمدة ساعة 1 في RT على الدوار.
  2. إزالة الحل أعلاه حجب / نفاذيبيليست من كل أنبوب باستخدام طرف ماصة 200 درجة مئوية تحت المجهر تشريح واحتضان العينات مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في 5٪ مصل الماعز / PBS / 0.1٪ تريتون X-100 بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على الدوار.
    ملاحظة: لوسم المناعة من شرائط متشابك القوقعة، واستخدام الماوس علامة presynaptic المضادة للكربوكسل الطرفية ملزمة البروتين 2 IgG1 (CtBP2، ووضع العلامات على المجال B من البروتين السقالات RIBEYE، 1:400) ومستقبلات الفأر علامة postsynaptic المضادة للغلوتامات 2 IgG2a (GluR2، وضع العلامات على وحدة فرعية من مستقبلات AMPA، 1:200)23.
  3. شطف ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع 0.1 M PBS الباردة لإزالة الأجسام المضادة الأولية المتبقية واحتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 5٪ مصل الماعز / PBS / 0.1٪ تريتون X-100 في RT لمدة 2\u20123 ساعة في الظلام على الدوار.
    ملاحظة: إعداد خلائط الأجسام المضادة الثانوية المناسبة باستخدام الماعز المضادة للماوس اليكسا فلور 568 (IgG1، 1:500) والماعز المضادة للماوس اليكسا فلور 488 (IgG2a، 1:500)، والتي هي مكملة للأجسام المضادة الأولية المستخدمة في الخطوة 4.2. لتحسين كفاءة وضع العلامات للأشرطة متشابك، نوصي بتحديد الأجسام المضادة الثانوية محددة. بعض المختبرات توسيع الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية لزيادة GluR2 تصنيف المناعة24.
  4. شطف ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع 0.1 M PBS لإزالة الأجسام المضادة الثانوية المتبقية ونقل العينات من أنابيب الطرد المركزي 2.5 مل إلى لوحات 35 ملم تحتوي على 0.1 M PBS.
  5. وضع قطرة من المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي على 4', 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) على الشريحة ونقل العينات من PBS إلى المتوسطة تصاعد. ضع حافة واحدة من غطاء على الشريحة وحرر هُنا للسماح للغطاء بالسقوط برفق.
    ملاحظة: لضمان أن تواجه خلايا الشعر إلى الأعلى وأنه لا يمكن طي أو التواء عينات القوقعة أثناء الإجراء، جبل عينات قوقعة تحت مجهر تشريح ستيريو.
  6. ضع الشرائح في مربع شريحة عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها للسماح للشرائح بالجفاف ثم الصورة تحت مجهر الليزر البؤري.

5. التقييم المورفولوجي لمناقان اتّصال قوقعة

  1. الشرائح صورة باستخدام المجهر البؤري مع ثلاثة ليزر - 405 نانومتر صمام ثنائي الأشعة فوق البنفسجية، و488 نانومتر ليزر الأرجون، و561 نانومتر الصمام الثنائي ضخ الصلبة الدولة (DPSS) ليزر لإثارة DAPI (الإثارة الطيف 409-464 نانومتر)، اليكسا فلور 488 (الإثارة الطيف 496-549 نانومتر) واليكسا فلور 568 (طيف الإثارة 573-631 نانومتر)، على التوالي.
  2. احصل على أكوام z البؤرية على مسافة 8 ميكرومتر من كل منعطف قوقعة باستخدام عدسة غمر الزيت عالية الدقة 63x.
    ملاحظة: بمجرد تعريفها، يجب حفظ جميع المعلمات لرقمنة الصور الضوئية وتطبيقها بشكل موحد على جميع الشرائح.
  3. بالنسبة لأعداد الملتحمة متشابك، قم بتعيين مكدسات z (حجم خطوة 0.3 ميكرومتر) لتمتد على طول IHCs بأكمله، مما يضمن أن جميع الملتحمة متشابك يمكن تصويرها.
  4. دمج الصور التي تحتوي على الملتحمة في مكدس z للحصول على إسقاط محور z والاستيراد إلى برنامج معالجة الصور.
  5. قسمة إجمالي عدد متشابك في كل مكدس z في مناطق تردد محددة على عدد IHCs (يساوي عدد الأدلة النووية DAPI) لحساب عدد الملتحمة متشابك لكل IHC. في كل منطقة تردد محددة، متوسط جميع الملتحمة متشابك في ثلاث صور من حقول مجهرية مختلفة تحتوي على 9-11 IHCs.
    1. حدد منطقة المصالح (ROIs) بما في ذلك المناطق البسولترية لكل IHC باستخدام زر التحديدات الحرة. استخدم وظيفة القياس للقياس الكمي التلقائي للدُعاق، ووظيفة مستجمعات المياه للتمييز بين البقع المجاورة بشكل وثيق.
    2. بعد كل عد آلي، إجراء عمليات التفتيش البصرية مع التصحيحات اليدوية لضمان التبذير العد موثوق بها.
      ملاحظة: يجب أن يبقى المجربين أعمى فيما إذا كانت الشريحة من قمة أو منتصف أو منعطف القاعدية من القوقعة.
  6. تقييم بصريا بنية متشابك والتوزيع، لعزل يدويا IHCs الفردية من جيرانهم بواسطة أداة قلم رصاص (M) لتصور أفضل للهندسة المعمارية السيتوالهيكلية وتوطين متشابك.
  7. لفحص تجاور الشرائط presynaptic (CtBP2) وبقع مستقبلات المشاركات (GluR2) ، استخراج الفضاء voxel حول الشريط بواسطة أداة سرادق مستطيلة وعزل الشريط الفردي ة بواسطة Crop. من خلال النقر فوق صورة > حجم الصورة، والحصول على مجموعة مصغرة من هذه الإسقاطات المصغرة، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحديد نقاط الاشتباك العصبي المقترنة (ظهرت كأزواج جنبا إلى جنب عن كثب من CtBP2 إيجابية وGluR2 إيجابية الباوبير) مقابل اليتيم شرائط (تفتقر إلى بقع مستقبلات الغلوتامات postsynaptic) (الشكل 3).
    ملاحظة: تظهر نقاط الاشتباك العصبية القوقعة العادية كعلامات مناعية مشتركة للشريط المتبصّر داخل خلية الشعر (المضادة للأشعة المقطعية2) والتصحيح مستقبلات الغلوتامات في محطة الأعصاب السمعية (المضادة للغلور2)25. بعض المختبرات استخدام الإسقاطات البؤرية جنبا إلى جنب مع النمذجة 3D لتحديد حجم التصحيح متشابك أو حجم26،27. قبل فقدان كبير من نقاط الاشتباك العصبي الشريط، شرائط تظهر تغييرات في الحجم أو بدون بقع مستقبلات الغلوتامات المقترنة من المرجح أن تدل على خلل متشابك27،28.

6. التقييم الوظيفي لمناقانة الشريط القوقعة

  1. جمع جميع موجات ABR لكل حافز التردد المقدمة في SPL من 90 ديسيبل لتحليل موجة ABR فوق العتبة أنا السعة.
    ملاحظة: وقد أظهرت الدراسات العصبية الفسيولوجية والمورفولوجية أن انخفاض معدل عفوي، والألياف عالية العتبة هي عرضة بشكل خاص للشيخوخة والتعرض للضوضاء29،30. على الرغم من أن فقدان بسيط من المشابك الشريط لا يمكن أن تؤثر على عتبات ABR، فإنه يؤدي عادة إلى تخفيضات كبيرة في موجة ABR I السعة، لأن هذه afferents بما في ذلك انخفاض معدل عفوي، والألياف عالية العتبة وارتفاع معدل عفوية، الألياف منخفضة العتبة تسهم بشكل كبير في الأنشطة الموجزة من ألياف العصب القوقعة28،29،31. يتم اختيار كثافة فوق عتبة 90 ديسيبل SPL هنا.
  2. تحديد موجة الذروة إلى الذروة أنا السعةباستخدام برنامج تحليل حاليا (الشكل 4). كل موجة أنا في اختبار ABR يتكون من بداية إيجابية (ع) انحراف وانحراف السلبية اللاحقة (ن). ABR موجة أنا السعة يعرف الفرق في الجهد بين الملكية الفكرية (الذروة الإيجابية للموجة I) وفي (الذروة السلبية للموجة I)29.
    ملاحظة: في الظروف المرضية ، يمكن تحديد اعتلال الشبكي القوقعة على أساس السعة فوق عتبة موجة ABR I ، والتي تعكس الاستجابات المعقمة لـ SGNs التي يثيرها الصوت. ومع ذلك، حساسية القوقعة التي لم يتم اختراق بسبب خلل OHC هو شرط مسبق لهذا الأسلوب.

النتائج

أجريت اختبارات السمع ABR ل10 C57BL/6J الفئران (8 أسابيع من العمر) تحت التخدير. وقد تم الحصول على ABRs باستخدام المحفزات انفجار لهجة في 4, 8, 16, 32, و 48 كيلو هرتز. تم الكشف بصريا عن عتبة السمع لكل الحيوان من خلال التمييز على الأقل واحد شكل موجي واضح في ABR. عرضت جميع الفئران عتبات ABR استجابة لرشقات نارية لهجة?...

Discussion

منذ تم وصف اعتلال الشبكي القوقعة لأول مرة في الفئران الكبار مع تحول عتبة مؤقتة (TTS) الناجمة عن 8\u201216 كيلوهرتز الضوضاء الفرقة اوكتاف في 100 ديسيبل SPL لمدة 2 ح31, وقد حقق الباحثون على نحو متزايد آثار اعتلال الكلى في مختلف الثدييات، بما في ذلك الكبيتو والبشر32،

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

Acknowledgements

وقد دعمت هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81770997، 81771016، 81830030)؛ مشروع التمويل المشترك لمؤسسة بكين للعلوم الطبيعية ولجنة بكين للتعليم (KZ201810025040)؛ مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (7174291)؛ والمؤسسة الصينية لعلوم ما بعد الدكتوراه (2016M601067).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ketamine hydrochlorideGutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, ChinaH35020148100 mg/kg
Xylazine hydrochlorideSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAX-125110 mg/kg
TDT physiology apparatusTucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USAAuditory Physiology System III
SigGen/BioSig softwareTucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USAAuditory Physiology System III
Electric PadPet Fun11072931136
Dumont forceps 3#Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada0203-3-PO
Dumont forceps 5#Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada0209-5-PO
Stereo dissection microscopeNikon Corp., Tokyo, JapanSMZ1270
Goat serumZSGB-BIO, Beijing,ChinaZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4Millipore Corp., Billerica, MA, USAMAB397mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2BD Biosciences, Billerica, MA, USA612044mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibodyThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USAA21124goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibodyThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USAA21131goat
Mounting medium containing DAPIZSGB-BIO, Beijing,ChinaZLI-9557
Confocal fluorescent microscopyLeica Microsystems, Wetzlar, GermanyTCS SP8 II
Image Pro Plus softwareMedia Cybernetics, Bethesda, MD, USAversion 6.0
Professional diagnostic pocket otoscopeLude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,ChinaHS-OT10
Needle electrodeFriendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China102920 mm, 28 G
Closed-field speakerTucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USACF1

References

  1. Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
  2. Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  3. Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
  6. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
  7. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
  8. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  9. Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
  10. Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
  11. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
  12. Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
  13. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
  14. Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
  15. Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
  16. Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
  17. Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).
  18. Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
  19. Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
  20. Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
  21. Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
  22. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  23. Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
  24. Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
  25. Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
  26. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
  27. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
  28. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  29. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
  30. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
  31. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  32. Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
  33. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  34. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
  35. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  36. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
  37. Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147cochleogramCtBP2GluR2ABRABR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved