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Resumen

Este manuscrito describe un protocolo experimental para evaluar las características morfológicas y el estado funcional de las sinapsis de cinta en ratones normales. El modelo actual también es adecuado para modelos de sinaptopatía coclear inducidas por ruido y relacionados con la edad. También se discuten los resultados correlativos de estudios anteriores del ratón.

Resumen

Las células del vello interno coclear (ICH) transmiten señales acústicas a las neuronas ganglionares espirales (SGN) a través de las sinapsis de cinta. Varios estudios experimentales han indicado que las sinapsis de células pilosas pueden ser los objetivos iniciales de la hipoacusia neurosensorial (SNHL). Tales estudios han propuesto el concepto de "sinaptoopatía" coclear, que se refiere a alteraciones en el número, estructura o función de la siinas de cinta que dan lugar a una transmisión sináptica anormal entre los IHC y los SCN. Si bien la sinaptoopatía coclear es irreversible, no afecta al umbral auditivo. En los modelos experimentales inducidos por ruido, se emplean daños restringidos a las sinapsis de IHC en regiones de frecuencia selectas para identificar los factores ambientales que causan específicamente la sinaptopatía, así como las consecuencias fisiológicas de perturbar este oído interno Circuito. Aquí, presentamos un protocolo para analizar la morfología sináptica coclear y la función en una región de frecuencia específica en ratones adultos. En este protocolo, la localización coclear de regiones de frecuencia específicas se realiza utilizando mapas de frecuencia de lugar junto con datos de coclearografía, tras los cuales las características morfológicas de las sinapsis de cinta se evalúan a través de sinápticas Immunostaining. El estado funcional de las sinapsis de cinta se determina entonces en función de las amplitudes de la respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) onda I. El presente informe demuestra que este enfoque puede utilizarse para profundizar nuestra comprensión de la patogénesis y los mecanismos de la disfunción sináptica en la cócleara, lo que puede ayudar en el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas.

Introducción

Las frecuencias en el rango de aproximadamente 20 u201220,000 Hz pueden ser percibidas como estímulos auditivos por los seres humanos. La audición humana es normalmente más sensible cerca de 1.000 Hz, donde el nivel medio de presión sonora es de 20 oP en adultos jóvenes (es decir, 0 decibelios de nivel de presión sonora [dB SPL]). En algunas condiciones patológicas, la pérdida auditiva está restringida a frecuencias específicas. Por ejemplo, en las primeras etapas de la pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL), se puede observar una "notch" (es decir, elevación del umbral auditivo) en el audiograma a 4 kHz1. A lo largo de la partición coclear de mamíferos, sus gradaciones de rigidez y masa producen un mapa de frecuencia exponencial,con detección de sonido de alta frecuencia en la base de la cócleara y detección de baja frecuencia en el ápice 2. De hecho, hay un mapa de frecuencia de lugar coclear a lo largo de la membrana basilar, que conduce a lo que se conoce como organización tonotópica2,3. Cada lugar dado en la membrana basilar tiene la sensibilidad más alta a una sola frecuencia de sonido particular, que generalmente se denomina la frecuencia característica3,4, aunque también se pueden observar respuestas a otras frecuencias.

Hasta la fecha, se han empleado varios modelos de ratón para investigar la función normal, los procesos patológicos y la eficacia terapéutica en el sistema auditivo. El conocimiento preciso de los parámetros fisiológicos en la cócleara del ratón es un requisito previo para estos estudios de pérdida auditiva. La cócleara de ratón se divide anatómicamente en giros apicales, medios y basales, que corresponden a diferentes regiones de frecuencia. Mediante el etiquetado de los afferents de nervio auditivo en el núcleo coclear para analizar sus correspondientes sitios de inervación periférica en la cócleara, m'ller et al. lograron establecer el mapa de frecuencia de lugar coclear en el ratón normal in vivo5. En el intervalo de 7,2–61,8 kHz, que corresponde a posiciones entre el 90% y el 10% de la longitud total de la membrana basilar, el mapa de frecuencia de lugar coclear del ratón se puede describir mediante una simple función de regresión lineal, lo que sugiere una relación entre el distancia normalizada desde la base coclear y el ritmoritmo de la frecuencia característica5. En ratones de laboratorio, el mapa de frecuencia de lugar se puede utilizar para explorar la relación entre los umbrales auditivosdentro de rangos de frecuencia específicos y los cocleares que muestran el número de células pilosas que faltan en regiones relativas a lo largo de la membrana basilar 6. Es importante destacar que el mapa de frecuencia de lugar proporciona un sistema de posicionamiento para la investigación de daños estructurales mínimos, como daños en las sinapsis de la cinta de las células pilosas en lugares específicos de frecuencia coclear en ratones con trauma auditivo periférico7 ,8.

En la cóclea de mamíferos, las sinapsis de cinta se componen de una cinta presináptica, una proyección de electrones denso que ate un halo de vesículas sinápticas listas para liberación que contengan glutamato dentro del IHC, y una densidad postsináptica en el terminal nervioso de la SGN con receptores de glutamato9. Durante la transducción del sonido coclear, la desviación del haz de células pilosas resulta en la despolarización de IHC, que conduce a la liberación de glutamato de los IHC en los terminales aferentes postsinápticos, activando así la vía auditiva. La activación de esta vía conduce a la transformación de señales mecánicas inducidas por el sonido en un código de velocidad en el SGN10. De hecho, la sinapsis de cinta IHC está altamente especializada para la transmisión de sonido infatigable a velocidades de cientos de hercios con alta precisión temporal, y es de importancia crítica para los mecanismos presinápticos de codificación de sonido. Estudios anteriores han revelado que las sinapsis de cinta varían mucho en tamaño y número en diferentes regiones de frecuencia en la cócleara de ratón adulta11,12, probablemente reflejando la adaptación estructural a la codificación de sonido particular para necesidades de supervivencia. Recientemente, estudios experimentales en animales han demostrado que la sinaptopatía coclear contribuye a múltiples formas de deficiencias auditivas, incluyendo pérdida auditiva inducida por ruido, pérdida auditiva relacionada con la edad y pérdida auditiva hereditaria13, 14. Así, los métodos para identificar los cambios correlacionados en el número, la estructura y la función sinápticas en regiones de frecuencia específicas se han empleado cada vez más en estudios de desarrollo auditivo y enfermedad del oído interno, utilizando modelos generados a través de manipulación experimental de variables genéticas o ambientales15,16,17.

En el informe actual, presentamos un protocolo para analizar el número sináptico, la estructura y la función en una región de frecuencia específica de la membrana basilar en ratones adultos. La localización de frecuencia coclear se realiza utilizando un mapa de frecuencia de lugar determinado en combinación con un coclearografía. Las características morfológicas normales de las sinapsis de cinta coclear se evalúan mediante inmunomanchas presinápticas y postsinápticas. El estado funcional de las sinapsis de la cinta coclear se determina en función de las amplitudes supraumbral de la onda ABR I. Con alteraciones menores, este protocolo se puede utilizar para examinar condiciones fisiológicas o patológicas en otros modelos animales, incluyendo ratas, conejillos de indias y jerbos.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía NRC/ILAR para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8a Edición). El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica Capital, Beijing, China.

1. Selección de animales

  1. Para todos los experimentos, utilice ratones macho c57BL/6J adultos (8 semanas de edad) como modelo animal.
    NOTA: Los ratones C57BL/6J que llevan una variante de empalme del Cdh23 presentan una senescencia acelerada en el sistema auditivo, reflejada como una pérdida del 40% de las sinapsis de cinta en el giro basal de la cócleara y una pérdida del 10% en el giro medio por 6 meses de edad, seguida de una rápida aumento de esta pérdida en toda la cócleara con18años,19. Por lo tanto, recomendamos precaución al usar ratones C57BL/6J mayores de 6 meses para la investigación auditiva. Otras cepas de ratones se pueden utilizar dependiendo de objetivos experimentales específicos.
  2. Inspeccione a los ratones utilizando un otoscopio de bolsillo de diagnóstico profesional para descartar patologías del oído externo o medio antes de las evaluaciones auditivas. Los signos potenciales pueden incluir líquido o pus en el canal auditivo externo, enrojecimiento e hinchazón en el tejido local, y perforación de membrana timpánica.
    NOTA: Aunque esto rara vez se encuentra, una vez identificado, se deben excluir los ratones con enfermedades del oído externo o medio.

2. Evaluación de la audición

  1. Anestetizar ratones utilizando una inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina (100 mg/kg) e clorhidrato de xilazina (10 mg/kg). Juzgue la profundidad de la anestesia a través de estímulos dolorosos (p. ej., reflejo de pellizco de los dedos de los dedos).
    NOTA: Cuando el reflejo del dedo del pie está completamente ausente, el animal ha alcanzado una profundidad adecuada de la anestesia para las pruebas auditivas. Si se requiere más tiempo para las grabaciones bilaterales abr, administrar una dosis más baja (una quinta parte de la dosis original) de anestésicos para restaurar el plano anestésico original. Tenga cuidado de evitar la sobredosis anestésica, ya que esto puede llevar a la muerte en ratones.
  2. Mantener la temperatura corporal del animal anestesiado a 37,5 oC utilizando una almohadilla térmica. Coloque el animal anestesiado en una habitación eléctrica y acústicamente blindada para evitar interferencias durante toda la prueba auditiva.
    NOTA: Mantener la temperatura fisiológica durante todo el procedimiento hasta que el animal esté totalmente despierto, con el fin de prevenir la muerte causada por la hipotermia post-anestesia.
  3. Coloque los electrodos de aguja subdérmico (20 mm, 28 G) en el vértice del cráneo (electrodo de grabación), en la región parótida ipsilateral por debajo del pinna del oído medido (electrodo de referencia), y en la región parótida contralateral (electrodo de tierra), con una profundidad de 3 mm bajo la piel de la cabeza del ratón, respectivamente20.
  4. Utilice un altavoz de campo cerrado para realizar estimulación acústica a través de un tubo de plástico de 2 cm con una punta en forma de cono. Coloque la punta en el canal auditivo externo21.
    NOTA: Asegúrese de que la impedancia eléctrica en los electrodos de grabación y referencia es inferior a 3 kOhm (normalmente 1 kOhm). Si la impedancia es alta, cambie el sitio de inserción del electrodo, limpie el electrodo con alcohol o reemplace el electrodo para evitar alteraciones en la amplitud de onda ABR.
  5. Para la grabación ABR, genere pips de tono (3 ms de duración, tiempos de subida/caída de 1 ms, a una velocidad de 21,1/s, frecuencia: 4-48 kHz) y preséntelos en EsP de disminución de 90 a 10 dB en pasos de 5 a 201210 dB SPL20. Durante este paso, las respuestas se amplifican (10.000 veces), se filtran (0,1–3 kHz) y se promedian (1.024 muestras/nivel de estímulo).
    NOTA: Los AB se recogen para cada nivel de estímulo en pasos de 10 dB, con pasos adicionales de 5 dB cerca del umbral.
  6. En cada frecuencia, determine el umbral ABR, que se refiere al SPL mínimo que da como resultado una grabación ABR confiable con una o más ondas distinguibles que se pueden identificar claramente mediante la inspección visual (Figura1).
    NOTA: Por lo general, es necesario repetir el proceso para los SPÁ Bajos alrededor del umbral para asegurar la consistencia de las formas de onda. El umbral de respuesta es el nivel de estímulo más bajo en el que se puede observar la forma de onda, cuando una disminución de 5 dB llevaría a la desaparición de la forma de onda.

3. Procesamiento de tejido coclear

  1. Después de la grabación de ABR, eutanasia a los ratones anestesiados a través de la dislocación cervical, decapitarlos, exponer la bulla desde el lado ventral y abrir con tijeras afiladas para acceder a la cócleara.
  2. Usando un fórceps fino, retire los huesos temporales, corte la arteria de las estapas, retire las estapas de la ventana ovalada y rompa la membrana de la ventana redonda. Haga un pequeño agujero en el ápice de la cócleara girando suavemente la punta de una aguja (13 mm, 27 G).
  3. Fijar los huesos aislados con 4% (wt/vol) paraformaldehído en 0.1 M solución salina con fosfato (PBS, pH 7.4) durante la noche a 4 oC. Usando una pipeta de punta fina, enjuague suavemente el fijador a través de los espacios perilinfáticos a través de la aplicación a las ventanas ovaladas o redondas (como una entrada) y la abertura en el ápice (como salida).
    NOTA: Algunas proteínas requieren una corta duración de la fijación para evitar la destrucción de sus epítopos para el inmunoetiquetado. En tales casos, incubar huesos en 4% paraformaldehído a temperatura ambiente (RT) durante 2 h, dependiendo de las instrucciones del fabricante para la inmunohistoquímica. La fijación también se puede realizar a través de perfusión cardíaca para eliminar la sangre coclear, evitando el ruido de fondo debido a manchas no específicas en etapas posteriores, particularmente en modelos de ratón de sinaptopatía coclear.
  4. Enjuague los huesos tres veces durante 5 min con PBS frío de 0,1 M para eliminar el paraformaldehído residual. Descalcificar los huesos con ácido etilendiaminetetraacético al 10% (EDTA) ya sea a RT durante 4 h o a 4 oC durante 24 h mediante un suave temblor en un agitador horizontal a 20 rpm. EDTA se puede refrescar a mitad de camino.
    NOTA: Los tiempos de descalcificación están sujetos a la concentración de EDTA y a las preferencias de los usuarios. El tejido descalcificado debe mantener un cierto grado de dureza, lo que facilita la manipulación del aislar monturas cocleares enteras en pasos posteriores. Los huesos temporales se pueden descalcificar en 10% EDTA con rotación, lo que permite a los investigadores salir del laboratorio después de pruebas de ABR y experimentos de fijación. El tiempo de descalcificación es flexible dentro del rango de 20 a 30 h a 4 oC.
  5. Transfiera un hueso temporal descalcificado de EDTA a 0,1 M PBS. Utilice #3, #5 fórceps Dumont y la aguja de 27 G para diseccionar las regiones cocleares apicales, medias y basales a su vez y luego diseccionar la cócleara fuera del hueso bajo un microscopio de disección estéreo (como se describió anteriormente22). Haga una serie de pequeños cortes a lo largo del ligamento espiral usando una cuchilla de afeitar, y retire la membrana tectorial y la membrana de Reissner (Figura2).
    NOTA: Mientras la cócleara diseccionada esté intacta, este proceso se puede modificar de acuerdo con el protocolo habitual del operador individual.
  6. Diseccionar aún más el epitelio auditivo restante, incluyendo el limbo espiral en giros cocleares individuales (ápice, medio y base con región de gancho) para preparaciones de montaje completo.
  7. Bajo un objetivo de aceite de 40x de un microscopio de luz, mida la longitud de la membrana basilar con una escala de 250 m colocada en el ocular, que se puede ajustar a lo largo de la estereocilia de los IHCs.
  8. Calcular la longitud de cada giro coclear añadiendo todas las longitudes de segmento (250 m por segmento), y obtener de forma concomitante la longitud total de la membrana basilar sumando las longitudes de cada vuelta.
  9. Convertir la longitud total de la membrana basilar incluyendo la región del gancho en un porcentaje basado en la distancia desde el ápice coclear (0% se refiere al ápice coclear, 100% a la base coclear).
  10. Convierta esta distancia en la frecuencia característica coclear utilizando una función logarítmica (d(%) á 1 - 156,5 + 82,5 a log(f), con una pendiente de 1,25 mm/octava de frecuencia, donde d es la distancia normalizada del ápice coclear en porcentaje, f es la frecuencia en kHz), como se describió anteriormente5,6. Por lo tanto, se puede adquirir un rango de frecuencia en un área correspondiente de la membrana basilar en cada giro coclear.

4. Mancha de inmunofluorescencia

  1. Después de la disección, coloque cada giro coclear en un tubo centrífugo separado de 2,5 ml e incubar giros cocleares en 10% suero de cabra/PBS/0.1% Tritón X-100 para 1 h a RT en un rotador.
  2. Retire la solución de bloqueo/permeabilización anterior de cada tubo utilizando una punta de pipeta de 200 ml bajo un microscopio de disección e incubar las muestras con anticuerpos primarios diluidos en un 5% de suero de cabra/PBS/0.1% Triton X-100 durante la noche a 4 oC en un rotador.
    NOTA: Para el inmunoetiquetado de cintas sinápticas cocleares, utilice el marcador presináptico ratón anti-carboxilo-terminal proteína de unión 2 IgG1 (CtBP2, etiquetando el dominio B de la proteína de andamiaje RIBEYE, 1:400) y el receptor anti-glutamato de ratón marcador postsináptico 2 IgG2a (GluR2, etiquetado de una subunidad del receptor AMPA, 1:200)23.
  3. Enjuagar tres veces durante 5 min con 0,1 M DE PBS frío para eliminar anticuerpos primarios residuales e incubar los especímenes con anticuerpos secundarios diluidos en 5% de suero de cabra/PBS/0.1% Tritón X-100 en RT para 2-u20123 h en la oscuridad en un rotador.
    NOTA: Preparar mezclas de anticuerpos secundarios apropiadas utilizando Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) y Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), que son complementarios a los anticuerpos primarios utilizados en el paso 4.2. Para mejorar la eficiencia del etiquetado de las cintas sinápticas, se recomienda seleccionar anticuerpos secundarios específicos. Algunos laboratorios extienden la incubación con anticuerpos secundarios para aumentar el inmunoetiquetado GluR224.
  4. Enjuague tres veces durante 5 min con 0,1 M PBS para eliminar anticuerpos secundarios residuales y transferir las muestras de tubos centrífugos de 2,5 ml a placas de 35 mm que contengan 0,1 M PBS.
  5. Coloque una gota de medio de montaje que contenga 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en la corredera y transfiera las muestras de PBS al medio de montaje. Coloque un borde de un cubreobjetos en la diapositiva y suelte para dejar que el cubreobjetos caiga suavemente.
    NOTA: Para asegurarse de que las células pilosas miran hacia arriba y que no se produzca nilcante o torsión de muestras cocleares durante el procedimiento, monte muestras cocleares bajo un microscopio de disección estéreo.
  6. Coloque las diapositivas en una caja deslizante a 4 oC durante la noche para dejar que las diapositivas se sequen y luego la imagen bajo un microscopio confocal láser.

5. Evaluación morfológica de las sinapsis de la cinta coclear

  1. Diapositivas de imagen utilizando un microscopio confocal con tres láseres: un diodo UV de 405 nm, un láser de argón de 488 nm y un láser de estado sólido (DPSS) de 561 nm para excitar DAPI (espectro de excitación 409–464 nm), Alexa Fluor 488 (espectro de excitación 496–549 nm) y Alexa Fluor 568nm) y Alexa Fluor 568nm) (Espectro de excitación 573–631 nm), respectivamente.
  2. Adquiera pilas z confocales a una distancia de 8 m de cada giro coclear utilizando una lente de inmersión de aceite de alta resolución de 63x.
    NOTA: Una vez definidos, todos los parámetros para digitalizar fotomicrografías deben guardarse y aplicarse uniformemente a todas las diapositivas.
  3. Para recuentos de punctum sináptico, establezca las pilas z (tamaño de paso de 0,3 m) para abarcar toda la longitud de los IHC, asegurando así que se pueda crear una imagen de todos los puncta sinápticos.
  4. Combine las imágenes que contienen puncta en una pila z para obtener la proyección del eje z e importarlas al software de procesamiento de imágenes.
  5. Divida los recuentos totales sinápticos en cada pila z en regiones de frecuencia específicas por el número de IHC (igual a los recuentos manuales de la energía nuclear dAPI) para calcular el número de puncta sináptica para cada IHC. En cada región de frecuencia específica, promedio de todos los puncta sinápticos en tres imágenes de diferentes campos microscópicos que contienen 9-11 IC.
    1. Esbozar la región de intereses (ROI) incluyendo las regiones basolaterales de cada IHC utilizando el botón de selección a mano alzada. Utilice la función de medida para la cuantificación automática de puncta y la función de cuenca hidrográfica para distinguir entre puntos estrechamente adyacentes.
    2. Después de cada recuento automatizado, realice inspecciones visuales con correcciones manuales para garantizar que el recuento de puncta sea confiable.
      NOTA: Los experimentadores deben permanecer cegados en cuanto a si la diapositiva es del ápice, medio o giro basal de la cócleara.
  6. Evalúe visualmente la estructura y distribución sináptica, para aislar manualmente los IHC individuales de sus vecinos mediante la Herramienta Lápiz (M) para visualizar mejor la arquitectura citoesquelética y la localización sináptica.
  7. Para inspeccionar la yuxtaposición de cintas presinápticas (CtBP2) y parches de receptores postsinápticos (GluR2), extraiga el espacio de vóxeles alrededor de la cinta mediante la herramienta Marco rectangular y aísle la cinta individual de Recortar. Al hacer clic En Imagen > Tamañode imagen, adquiera una matriz de miniaturas de estas proyecciones en miniatura, que luego se puede utilizar para identificar sinapsis emparejadas (aparecieron como pares estrechamente yuxtapuestos de Puncta positiva y GluR2 positiva) frente a huérfana cintas (falta de parches receptores de glutamato postsináptico) (Figura 3).
    NOTA: Las sinapsis cocleares normales aparecen como inmunoetiquetado combinado de la cinta presináptica dentro de la célula pilosa (anti-CtBP2) y el parche del receptor de glutamato postsináptico en el terminal del nervio auditivo (anti-GluR2)25. Algunos laboratorios utilizan proyecciones confocales junto con el modelado 3D para cuantificar el tamaño del parche sináptico o el volumen26,27. Antes de la pérdida significativa de sinapsis de cinta, cintas que presentan cambios en el tamaño o sin parches receptores de glutamato emparejados son probablemente indicativos de disfunción sináptica27,28.

6. Evaluación funcional de las sinapsis de la cinta coclear

  1. Recoja todas las ondas ABR para cada estímulo de frecuencia presentado en un SPL de 90 dB para el análisis de las amplitudes supraumbrales de la onda ABR I.
    NOTA: Estudios neurofisiológicos y morfológicos han demostrado que las fibras de baja velocidad espontánea y alto umbral son especialmente vulnerables al envejecimiento y a la exposición al ruido29,30. Aunque la simple pérdida de sinapsis de cinta no puede afectar a los umbrales ABR, comúnmente resulta en reducciones significativas en las amplitudes de onda I de ABR, porque estos aferentes incluyen baja tasa espontánea, fibras de alto umbral y alta tasa espontánea, las fibras de umbral bajo contribuyen en gran medida a las actividades sumadas de las fibras nerviosas cocleares28,29,31. Aquí se selecciona una intensidad supraumbral de 90 dB SPL.
  2. Determinar la amplitud de la onda de pico a pico I mediante un programa de análisis sin conexión (Figura4). Cada onda I en la prueba ABR consiste en una desviación positiva inicial (p) y la posterior desviación negativa (n). La amplitud de la onda I ABR se define como la diferencia de voltaje entre Ip (el pico positivo de la onda I) y In (el pico negativo de la onda I)29.
    NOTA: En condiciones patológicas, la sinaptoopatía coclear se puede determinar sobre la base de las amplitudes supraumbral de la onda ABR I, que reflejan las respuestas de inicio sumadas de los SGN evocados por el sonido. Sin embargo, la sensibilidad coclear que no se ve comprometida debido a la disfunción OHC es un requisito previo para este método.

Resultados

Se realizaron pruebas auditivas de ABR para 10 ratones C57BL/6J (8 semanas de edad) bajo anestesia. Los Abs se introdujeron utilizando estímulos de ráfaga de tono a 4, 8, 16, 32 y 48 kHz. El umbral auditivo de cada animal se detectó visualmente distinguiendo al menos una forma de onda clara en el ABR. Todos los ratones mostraron umbrales de ABR en respuesta a ráfagas de tono, que oscilan entre 25 y 70 dB SPL dependiendo de la frecuencia del estímulo. Nuestros resultados indicaron que el umbral auditivo

Discusión

Dado que la sinaptoopatía coclear se caracterizó por primera vez en ratones adultos con un desplazamiento temporal de umbral (TTS) inducido por el ruido de banda de octava de 8 u201216 kHz a 100 dB SPL durante 2 h31, los investigadores han investigado cada vez más los efectos de la sinaptopatía en varios mamíferos, incluyendo monos y humanos32,33. Además de la exposición al ruido, varias otras condiciones se han asociado con la sina...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81770997, 81771016, 81830030); el proyecto de financiación conjunta de beijing Natural Science Foundation y Beijing Education Committee (KZ201810025040); la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (7174291); y la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (2016M601067).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Ketamine hydrochlorideGutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, ChinaH35020148100 mg/kg
Xylazine hydrochlorideSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAX-125110 mg/kg
TDT physiology apparatusTucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USAAuditory Physiology System III
SigGen/BioSig softwareTucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USAAuditory Physiology System III
Electric PadPet Fun11072931136
Dumont forceps 3#Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada0203-3-PO
Dumont forceps 5#Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada0209-5-PO
Stereo dissection microscopeNikon Corp., Tokyo, JapanSMZ1270
Goat serumZSGB-BIO, Beijing,ChinaZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4Millipore Corp., Billerica, MA, USAMAB397mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2BD Biosciences, Billerica, MA, USA612044mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibodyThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USAA21124goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibodyThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USAA21131goat
Mounting medium containing DAPIZSGB-BIO, Beijing,ChinaZLI-9557
Confocal fluorescent microscopyLeica Microsystems, Wetzlar, GermanyTCS SP8 II
Image Pro Plus softwareMedia Cybernetics, Bethesda, MD, USAversion 6.0
Professional diagnostic pocket otoscopeLude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,ChinaHS-OT10
Needle electrodeFriendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China102920 mm, 28 G
Closed-field speakerTucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USACF1

Referencias

  1. Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
  2. Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  3. Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
  6. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
  7. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
  8. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  9. Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
  10. Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
  11. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
  12. Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
  13. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
  14. Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy--neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
  15. Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
  16. Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
  17. Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).
  18. Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
  19. Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
  20. Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
  21. Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
  22. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  23. Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein's journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
  24. Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
  25. Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
  26. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
  27. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
  28. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  29. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
  30. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
  31. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  32. Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
  33. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  34. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
  35. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  36. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
  37. Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).

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