تشكيل المواد من الحرير العنكبوت المؤتلف من خلال الإفراز المائي باستخدام الحرارة والضغط

Summary

هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لإنتاج المياه القابلة للذوبان العنكبوت المؤتلف حلول بروتين الحرير والاشكال المادية التي يمكن تشكيلها من تلك الحلول.

Abstract

العديد من العناكب تنتج سبعه أنواع من الحرير. سته من الحرير هي ألياف في شكل عندما تنتجها العناكب. هذه ألياف ليست قابله للذوبان في الماء. من أجل أعاده إنتاج الخواص الميكانيكية الرائعة من الحرير العنكبوت ، يجب ان تنتج في المضيفين مغاير كما العناكب علي حد سواء الاقليميه وتفكيكها. النظير الاصطناعية من الحرير العنكبوت تميل أيضا إلى ان تكون غير قابله للذوبان في المحاليل المائية. وهكذا ، فان نسبه كبيره من البحوث في الحرير العنكبوت المؤتلف تعتمد علي المذيبات العضوية التي تضر بالإنتاج علي نطاق واسع من المواد. طريقه مجموعتنا يجبر علي إفراز هذه الحرير العنكبوت المؤتلف في الماء. بشكل ملحوظ ، عندما يتم اعداد هذه البروتينات باستخدام هذه الطريقة من الحرارة والضغط ، يمكن اعداد مجموعه واسعه من الاشكال المادية من نفس الحل من البروتينات الحرير العنكبوت المؤتلف (rSSp) بما في ذلك: الأفلام وألياف والإسفنج ، هيدروجيل ، lyogel ، والمواد اللاصقة. يوضح هذا المقال إنتاج rssp مذاوبه والاشكال المادية بطريقه أكثر سهوله فهم من المواد المكتوبة والأساليب وحدها.

Introduction

وقد حصلت الحرير العنكبوت اهتمام العلماء المادية لمزيج مثير للإعجاب من القوه والمرونة ، والتوافق الحيوي. وقد كان أعاده إنشاء ألياف تقليديا فحوى البحث. وقد أعاق هذا الجهد بروتين الحرير العنكبوت المؤتلف (rSSp) غير الذوبان في الماء ، فضلا عن عدم قدره تقنيات الإفراز التقليدية (العوامل الانسيابية والمنظفات) لتحقيق الإفراز المائي. وعلاوة علي ذلك ، التقنيات التي تم تطويرها لإصدارات أذابه من rssp لا تعمل علي جميع المتغيرات rssp وتتطلب أيضا التلاعب كبيره والوقت الذي غالبا ما يؤدي إلى فقدان البروتين^1،2. وقد ادي ذلك إلى حد كبير إلى استخدام الحقل 1 ، 1 ، 1 ، 3 ، 3 ، 3-هيكسافلورويسوبروبانول (HFIP) كمذيب لتشكيل ألياف ، وغيرها من اشكال المواد المحدودة. الميزة التي هي ان جميع rSSp المعروفة قابله للذوبان في HFIP ، وتوفير التوحيد البيانات بين كل مجموعه البحوث. والعيب في ذلك هو ان HFIP هو مذيب سام مكلف وغير عملي النطاق بسبب الشواغل الصحية والاعتبارات البيئية.

وقد تم تطوير نهج جديد لأذابه الملوثات العضوية المتطايرة التي سدت الفجوة التكنولوجية بين المذيب العضوي القاسي HFIP والتقنيات الأخرى التي تعمل بشكل انتقائي من أجل الاذابه الحيوية لل rSSp. وتم تطبيق مزيج من درجات الحرارة المحددة والضغوط علي تعليق المياه والماء. وكانت النتائج بالقرب من 100 ٪ الإفراز والانتعاش من rSSp ، فضلا عن تركيزات البروتين عاليه ؛ وقد حددت مجموعه متنوعة من المواد التي يمكن ان تكون ممكنة من هذه الصيغ التي لم تكن جميعها قابله للتحقيق باستخدام hfip أو غيرها من المذيبات العضوية³,^4,5,6. والهدف من هذا النهج هو بكفاءة وسهوله جعل البروتينات العنكبوت المؤتلف المنقية والمجففة في محلول مائي التي يمكن استخدامها بعد ذلك لإنتاج مجموعه متنوعة من الاشكال المادية.

ألياف ، والأفلام ، والطلاء ، والمواد اللاصقة ، والهلام المائي ، lyogels ، والمجالات الدقيقة ، والإسفنج كلها بارع بسهوله من نفس محلول rSSp مائي باستخدام هذه الطريقة. التطور المستمر لهذه الطريقة ، ليس فقط مع rSSp اضافيه ولكن مع البروتينات الأخرى ، يمكن ان يؤدي إلى اشكال المواد الجديدة والبديلة لتنقيه البروتين وطرق الاذابه.

Protocol

1. اعداد خليط الحرير العنكبوت المؤتلف من مخزونات البروتين المجفف بالتجميد

1. تحديد الصياغة والحجم اللازمين للتشكيلات المادية المقصودة. التركيبات النموذجية تتراوح من 3 ٪ (w/v) تصل إلى 15 ٪ (w/v). باستخدام هذا التحديد ، احسب rSSp المناسب والتركيزات والنسب.
   1. استخدم التركيبات التالية لاعداد كل ماده موصوفه في هذا البروتوكول: الهلام المائي/الإسفنج/الليجليلز ، 6% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2 ؛ الأفلام/الطلاء ، 5 ٪ (ث/v) 80:20 MaSp1: MaSp2 ؛ المواد اللاصقة ، 12 ٪ (ث/v) 50:50 MaSp1: MaSp2 ؛ ألياف ، 12.5 ٪ (ث/ف) 80:20 MaSp1: MaSp2.
      ملاحظه: علي الرغم من ان معظم تركيبات هي أفضل تركيبها لاشكال محدده والمواد ، وهناك مجموعه واسعه من الصيغ التي يمكن ان تتداخل في كثير من الأحيان. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن أيضا تصميم مواد rSSp النهائية اثناء التشكيل والمعالجة لإنتاج الخصائص المطلوبة. وعموما ، فان كل بروتين يتطلب التحقيق في المعلمات المناسبة أو المفيدة.
2. حدد نظيفه وجديده 8 مل الاوتوكلاف بوروسيليكات الزجاج الثقافة قارورة مع غطاء من المطاط واصطف المسمار.
3. أزاله الغطاء ووضع قارورة فارغه علي التوازن التحليلي. Tare كتله من قارورة فارغه بحيث التوازن يقرا الكتلة الصفر.
4. أضف مسحوق rSSp المجفف بالتجميد المطلوب إلى القارورة الفارغة لكل ماده محدده.
   1. استخدام هذه الجماهير محدده من كل نوع من أنواع البروتين لكل ماده ، عند اعداد 2 مل من الحل: هيدروجيل/الإسفنج/lyogels ، 60 ملغ من MaSp1 و 60 ملغ من MaSp2 ؛ الأفلام/الطلاء ، 80 ملغ من MaSp1 و 20 ملغ من MaSp2 ؛ المواد اللاصقة ، 120 ملغ من MaSp1 و 120 ملغ من MaSp2 ؛ ألياف ، 200 ملغ من MaSp1 و 50 ملغ من MaSp2.
5. أضف الكمية المطلوبة من الماء فائق النقاء ، علي الأقل 2 مل ، إلى القارورة التي تحتوي بالفعل علي مساحيق rSSp الموزونة.
   ملاحظه: يوصي بحجم الحد الأدنى من 2 مل لجميع إجراءات الإفراز.
6. ختم الغطاء القارورة والدوامة بخفه محتويات لخلق مشتته ، ومتجانسة ، خليط rSSp التي هي الآن جاهزه لاجراء الإفراز. ويمكن استخدام نهج تجانس اضافيه مثل سونيكيشن أو المكره خلط مع ، أو بالاضافه إلى ذلك ، دوامه خلط.

2. المؤتلف العنكبوت الحرير الإفراز

تحذير: يتم توليد ارتفاع درجات الحرارة والضغوط اثناء اجراء الإفراز. مطلوب معدات الحماية الشخصية المناسبة ، وخاصه نظارات واقيه ، والأكمام الطويلة ، وقفازات مقاومه للحرارة لهذه العملية.

1. قم باجراء فحص نهائي لقنينة القارورة ، أو الوعاء ، للتاكد من انها قد تم تشديدها بشكل صارم وأمن. ثم نقل الخليط rSSp المعلقة إلى فرن الميكروويف التقليدية.
   ملاحظه: ويوصي وحدات الميكروويف داخل نطاق السلطة من 700 إلى 1,500 واط ، وامتلاك قدرات الغرفة الداخلية أصغر ، ومنصات الدورية لتوفير أفضل ظروف الميل.
2. بدء تشغيل الميكروويف مع 5 ق رشقات ناريه في السلطة الكاملة. بعد كل انفجار فتح الباب لفتره وجيزة وخلط بعناية/دوامه القارورة لمنع تسويه والحفاظ علي الخليط المعلقة.
3. كرر هذه العملية الميكروويف حتى الخليط و/أو الحل قد حصل علي درجه حرارة علي الأقل 130 درجه مئوية ، عند قياسه بمقياس حرارة الاشعه تحت الحمراء مباشره ضد الحل الذي يحتوي علي أجزاء من القارورة. كرر هذه العملية حتى يتم حل جميع الجسيمات الصلبة تماما ولم تعد مرئية.
   ملاحظه: يقترح السماح لقارورة ومحلول لتبرد في بعض الأحيان ، وخاصه إذا كانت التركيبة لديها تركيز عال من rSSp الحالية. تزيد درجات الحرارة التي تتجاوز 200 درجه مئوية من خطر فشل ختم القارورة. ويجب أيضا إيلاء اهتمام خاص لمنع الخليط المسخن/المحلول من لمس الختم ، والذي سيؤدي أيضا إلى فشل احتواء القارورة.
4. بعد بنجاح أذابه خليط rssp في حل تسمح درجه حرارة المحلول وغطاء قارورة لتبرد أدناه 100 درجه مئوية (نقطه الغليان) قبل الافتتاح.

3. الهلام المائي

1. اعداد هيدروجيل من المحلول بعد ازالته من الميكروويف والسماح لها لتبرد وتعيين. يلقي هيدروجيل في هندسي محدده قبل السماح لها لتبرد تماما.
   ملاحظه: سوف تتطلب rSSps مختلفه كميات متنوعة من المرات إلى الانتقال إلى هيدروجيل. علي سبيل المثال ، تميل التتابعات الشبيهة MaSp2 إلى تكوين الهلام المائي بسرعة أكبر مقارنه بالمتواليات الشبيهة MaSp1. تركيزات البروتين, الملوحة, والاس الهيدروجيني أيضا تؤثر بشكل مباشر علي معدل الانتقال إلى هيدروجيل.

4. الإسفنج

1. اعداد الإسفنج rssp من قبل السماح أولا الحل مذاوبه الاساسيه لتشكيل هيدروجيل.
2. وضع هيدروجيل في حمام مائي ، ووضع هذا الحمام في الفريزر في-20 درجه مئوية ، والانتظار حتى يتم تجميد الحمام تماما.
3. إكمال عمليه تشكيل الإسفنج عن طريق أزاله هيدروجيل المجمدة وحمام المياه من الفريزر والذوبان عند 25 درجه مئوية. يمكن أزاله الاسفنجه الناتجة الآن من الماء المذاب.

5-ليوغل

1. اعداد lyogel rSSp عن طريق تجميد مباشره شكل هيدروجيل ، اما مع أو بدون حمام مائي ، ونقل عينه هيدروجيل المجمدة إلى مجفف الشعر بالتجميد
2. أزاله المواد هلام بالتجميد النهائي من السفينة التي حدثت في التسامي الرطوبة.

6. الأفلام والطلاء

1. استخدام واحده من الطرق الثلاث التالية: حل الصب ، الرش الحل ، أو تراجع طلاء لإنتاج الأفلام أو الطلاء من rSSp.
   1. يلقي محلول الحرير solubilized في/علي اشكال PDMS من الشكل المطلوب.
   2. صب وانتشار 200 μL من الحل الفيلم والسماح لهذا لتجف قبل تقشير لهم الخروج من الركيزة PDMS للاختبار أو العلاج.
   3. بعد السماح لهذه لتجف ، وأزاله الأفلام التي شكلت للاختبارات الميكانيكية أو ما بعد علاج الأفلام لتحسين الخواص الميكانيكية.
2. لاعداد طلاء ، أو الفيلم الذي لا يمكن ازالتها من الركيزة ، واستخدام اما رذاذ أو تراجع طلاء لإنتاج طبقه رقيقه من الفيلم.
   ملاحظه: لرش معطف ، وقد وجد هذا البروتوكول النجاح مع البخاخة الطلاء الرئيسي نموذج بخاخ.
   1. تشكل طلاء تراجع ببساطه عن طريق دمج الركيزة من الاختيار في rSSp solubilized وتكرار بعد التجفيف لتحقيق سمك المطلوب.
   2. أداء معطف رذاذ الاوليه قبل تطبيق معطف تراجع لزيادة الاتساق والفعالية للطلاء النهائي.

7. المواد اللاصقة

ملاحظه: يتم تحقيق تشكيل المواد اللاصقة من خلال أحدي الطرق التالية.

1. أضافه مباشره إلى rSSp solubilized علي الركيزة ومن ثم تطبيق الركيزة الثانية علي راس الحل. بحزم المشبك القطع معا ومن ثم تجف العينات في فرن مع درجه الحرارة الدنيا من 25 درجه مئوية لمده لا تقل عن 16 ساعة.
2. بدلا من ذلك ، رش السطوح اثنين من الركيزة مع طلاء رذاذ ومن ثم المشبك ركائز معا.
3. ويمكن أيضا تطبيق rSSp من خلال طريقه التراجع طلاء الركائز والتصاق ركائز يمكن استخدامها لاعداد ولاصقه.

8. الرطب نسج ألياف

1. تحميل حل منشطات solubilized في حقنه المتمركزة مع تلميح Luer لوك من خلال ابره انزلاق 19 G. إخراج فقاعات الهواء والسماح للمخدرات الجلوس في نهاية Luer لوك من الحقنه.
2. ادراج ما لا يقل عن 25 ملم من الأنابيب نظره خاطفه ، القطر الداخلي 0.01 بوصه ، في الأنابيب نظره خاطفه واحده من قطعه الاصبع تركيبات ضيقه ل 1/16 بوصه OD و 10/32 مخروط. نعلق هذا المناسب لأنابيب نظره خاطفه إلى محول Luer-لوك الإناث.
   1. استبدال الابره قياس 19 مع هذا الاعداد علي حقنه محمله.
3. ملء طويل القامة ، وحمام الزجاج واضحة مع 99 ٪ ايزوبروبانول نقيه لاستخدامها لحمام التخثر.
   1. ملء الحمامات تمتد ، وتقع تحت godets تمتد. وهذه سيكون 80:20 ايزوبروبانول: الماء المقطر في حمام تمتد الاولي ، و 20:80 ايزوبروبانول: الماء المقطر في حمام تمتد الثانية.
4. تعيين نظام تمتد غوديه بحيث الغوديه الاولي بعد حمام التخثر وأول غوديه في حمام تمتد الاولي تدور بنفس السرعة.
   1. البدء في الامتداد الأول عن طريق ضبط سرعات الهه النهائية في حمام تمتد 1 ، غوديه العلوي الأوسط ، وأول غوديه في حمام تمتد 2 إلى نفس السرعة. وسوف تكون هذه السرعة 2x بأسرع سرعه أزاله ألياف الاوليه.
   2. البدء في الامتداد الثاني عن طريق ضبط سرعات الهه النهائية في حوض الاستحمام الممتد 2 ، واخر الهه العليا ، والترجيع إلى نفس السرعة. هذه السرعة سوف تكون 2x بأسرع سرعه المستخدمة لتمتد الاولي أو 4x سرعه أزاله ألياف الاوليه.
   3. وضع قفازات النتريل علي الخارج من godets المتوسطة للحفاظ علي ألياف من الانزلاق.
5. البدء في البثق ببطء الحل في حمام التخثر. في النظام الألى تعيين معدل البثق لتتناسب مع سرعه الازاله من 10 ملم/ثانيه.
   1. السماح البثق ألياف لتصبح موحده قبل سحب ألياف من الحمام باستخدام هوك معدنيه رقيقه أو ملقط. التحقق من أزاله ألياف من الحمام خلق حلقه بين تلميح الأنابيب نظره خاطفه والمسار ألياف مغادره الحمام الحمام.
6. دليل ألياف المستردة من خلال سلسله من godets بحيث يتم غمر ألياف في الحمامات تمتد ولكن التجفيف في الهواء بين الحمامات تمتد وقبل الذهاب إلى بكره. ويتحقق هذا التجفيف من قبل الأعلى وضعت godets المتوسطة.
   ملاحظه: معدل أزاله ألياف و/أو معدل البثق سوف تحتاج إلى تعديل استنادا إلى تركيز البروتين ، والمواد المضافة ، ونوع البروتين للسماح وقت التخثر وافره دون تجمع ألياف علي الجزء السفلي من حمام التخثر.
7. نعلق ألياف امتدت بالبالكامل إلى التخزين المؤقت علي اليه الترجيع باستخدام الشريط.

النتائج

من الطريقة الموصوفة لأذابه rSSp ، يمكن تحقيق مجموعه متنوعة من الاشكال المادية كما هو موضح في الشكل 1. طريقه الاذابه هي لتطبيق الحرارة والضغط ، المتولدة من الميكروويف التقليدية ، إلى تعليق rSSp والماء. عندما يتم تحقيق درجات الحرارة الحرجة والضغوط ، فان البروتي...

Discussion

بعد المؤتلف البروتينات الحرير العنكبوت يتم تنقيته لديهم ثم ان تكون مستعدة في الحل الذي يمكن استخدامه لتشكيل المواد. عن طريق خلط البروتين الحرير العنكبوت بالتجميد مع الماء وتعريض هذا الخليط لتشعيع الميكروويف ، لتوليد الحرارة والضغط ، فمن الممكن لاعداد محلول rSSp. ويمكن إنتاج مجموعه واسعه م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip	BD	309657	Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225142	Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225144	Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade	Pharmco-Aaper	231000099
Freezone 4.5 Plus	Labconco	7386030	Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)	IDEX	P-629
Microwave	Magic Chef	HMD1110B	120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD	IDEX	F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID	IDEX	1531B
Sprayer: Master Airbrush	Master Airbrush	TC-60