열과 압력을 이용한 수성 용 매 화를 통한 재조합 거미 실크의 재료 형성

요약

여기서, 우리는 수용 성 재조합 거미 실크 단백질 용액 및 그 용액 으로부터 형성 될 수 있는 물질 형태를 생산 하는 프로토콜을 제시 한다.

초록

많은 거미 들이 일곱 종류의 실크를 생산 합니다. 6 개의 실크는 거미에 의해 생성 된 형태로 섬유입니다. 이 섬유는 수용 성이 없습니다. 거미 실크의 놀라운 기계적 성질을 재현 하기 위해, 거미는 영토와 식인 것으로 서 이종의 호스트에서 생산 되어야 합니다. 거미 실크의 합성 유사 체는 또한 수 용액에 불용 성 경향이 있다. 따라서, 재조합 거미 실크 연구의 많은 비율은 물질의 대규모 생산에 해로운 유기 용 매에 의존. 우리 그룹의 방법은 이러한 재조합 거미 실크의 용 매를 물에 강제로. 놀랍게도 이러한 열과 압력 방법을 사용 하 여 이러한 단백질을 제조할 때 필름, 섬유, 스폰지, 하이드로 겔, lyogel 및 접착제를 포함 한 재조합 거미 실크 단백질 (rSSp)의 동일한 용액 으로부터 다양 한 물질 형태를 제조할 수 있습니다. 본 문서는 서 면 재료 및 방법 만으로는 보다 쉽게 이해 되는 방식으로 용 매 화 rSSp 및 재료 형태를 생산 하는 것을 보여줍니다.

서문

거미 실크는 강도, 탄력성 및 생체 적합성의 인상적인 조합에 대 한 재료 과학자의 관심을 얻고 있다. 섬유를 다시 만드는 것은 전통적으로 연구의 추력 이었다. 이러한 노력은 재조합 거미 실크 단백질 (rSSp) 물에 대 한 용해성 뿐만 아니라 전통적인 용 매 화 기술 (차오 트로픽 제 및 세제)의 무 능력으로 수성 용 매를 달성 함으로써 방해를 받았습니다. 또한 rssp의 용 매 화 버전을 위해 개발 된 기술은 모든 rssp 변형에서 작동 하지 않으며, 종종 단백질 손실^1,2를 초래 하는 상당한 조작 및 시간이 필요 합니다. 이는 주로 섬유를 형성 하는 용 매로 서 1, 1, 3, 3 hexafluoroisopropanol (HFIP)를 사용 하는 분야에서, 그리고 다른 한정 된 물질 형태를 초래 하였다. 모든 알려진 rSSp가 HFIP에 용 해 되어 각 연구 그룹 간의 데이터 균일성을 제공 한다는 이점이 있습니다. 단점은 HFIP가 건강 문제와 환경적 고려 사항으로 인해 규모가 비싸고 실용적이 지 않은 독성 용 매 라는 점입니다.

Rssp 용 매 화에 대 한 신규 한 접근법이 개발 되어, rSSp 용 매가 선택적으로 작동 하는 가혹한 유기 용 제 HFIP 및 기타 기술 들 사이의 기술적 간극이 브릿지 되었다. 특정가 열 및 압력의 조합은 rSSp와 물의 현 탁 액에 적용 되었습니다. 결과는 100%의 용 매 화 및 rSSp의 회수 뿐만 아니라 고 단백질 농도와도 같습니다. 다양 한 물질 형태가 hfip 또는 다른 유기 용 매를 사용 하 여 달성할 수 없었던 이들 제제 로부터 가능 하다 고 결정 되었다³,⁵,⁶. 이러한 접근법의 목적은 정제 및 건조 된 재조합 거미 단백질을 수 용액에 효율적이 고 용이 하 게 가용 화 하 여 다양 한 재료 형태의 생산을 위해 활용 하는 것 이다.

섬유, 필름, 코팅, 접착제, 하이드로 겔, lyogels, 마이크로 스피어 및 스폰지 물질은 모두이 방법을 사용 하 여 동일한 수성 rSSp 솔루션에서 쉽게 accomplishable. 추가 rSSp 뿐만 아니라 다른 단백질과 함께이 방법의 지속적인 진화는 새로운 물질 형태와 대체 단백질 정제 및 가용 화로 이어질 수 있습니다.

프로토콜

1. 동결 건조 된 단백질 주식에서 재조합 거미 실크 혼합물 준비

1. 원하는 재료 형성에 필요한 제제 및 체적을 결정 합니다. 일반적인 제제의 범위는 최대 15% (w/v)입니다. 이 선택 항목을 사용 하 여 적절 한 rSSp, 농도 및 비율을 계산 합니다.
   1. 다음의 각각의 제형을 사용 하 여이 프로토콜에 기재 된 각각의 물질을 제조 한다. 하이드로 겔/스폰지/l a 겔 6% 50:50 MaSp1: MaSp2; 필름 코팅 5% 80:20 MaSp1: MaSp2; 접착제 12% 50:50 MaSp1: MaSp2; 섬유, 12.5% 80:20 MaSp1: MaSp2.
      주: 대부분의 제형은 특정 형태 및 재료에 적합 하지만 종종 겹칠 수 있는 광범위 한 제형이 있습니다. 또한 최종 rSSp 재료는 형성 및 가공 중에 맞춤화 하 여 원하는 특성을 생성할 수 있습니다. 일반적으로, 각 단백질은 적절 한 또는 유용한 매개 변수를 조사 해야 합니다.
2. 고무 줄 지 어 스크류 캡을 사용 하 여 깨끗 하 고 새로운 8 mL 오토 클레이 브 붕 규 산 유리 배양 바이 알을 선택 하십시오.
3. 캡을 제거 하 고 빈 유리병을 분석 저울에 놓습니다. 빈 유리병의 질량을 계량 하 여 균형이 0 질량을 읽습니다.
4. 원하는 동결 건조 rSSp 분말을 각각의 특정 물질에 대해 빈 바이 알에 첨가 한다.
   1. 각 물질에 대해 이러한 특정 질량을 각각의 재료에 사용 하 고, 2 mL 용액을 제조 하는 경우: 하이드로 겔/스폰지/lyogels, 60의 MaSp1 및 60 mg의 MaSp2; 필름/코팅, MaSp1의 80 mg 및 MaSp2의 20 mg; 접착제, 120의 MaSp1 및 120 mg의 MaSp2; 섬유, 200의 MaSp1 및 50 mg의 MaSp2.
5. 이미 가중치가 부여 된 rSSp 분말이 들어 있는 바이 알에 원하는 양의 초순 수 (최소 2 mL)를 추가 합니다.
   참고: 모든 용 매 화 절차에는 최소 2 mL의 용량을 권장 합니다.
6. 바이 알 캡을 밀봉 하 고, 내용물을 힘차게 소용돌이 하 여 용 매 화 과정에 사용할 수 있는 분산 및 균질 한 rSSp 혼합물을 만듭니다. 초음파 처리 또는 임 펠 러 혼합과 같은 추가적인 균질 화 접근법은, 또는 또한와 류 혼합과 함께 사용 될 수 있다.

2. 재조합 거미 실크 용 매 화

주의: 용 매 과정에서 높은가 열 및 압력이 발생 합니다. 적절 한 개인 보호 장비, 특히 고글, 긴 소매 및 내 열 장갑이이 과정에 필요 합니다.

1. 바이 알, 용기, 캡의 최종 검사를 수행 하 여 견고 하 고 단단히 조여 졌는 지 확인 하십시오. 그런 다음 일시 중단 된 rSSp 혼합물을 통상적인 전자 렌지로 옮겨 준다.
   참고: 700의 전력 범위 내 1500에 있는 마이크로파 유닛은 더 작은 내부 챔버 용량을 보유 하 고 있으며 회전 플랫폼은 더 나은 용 매 화 조건을 제공 하는 것이 좋습니다.
2. 최대 전력에서 5 초 버스트와 전자 레인지의 작동을 시작 합니다. 각 버스트를 짧게 한 후 문을 열고 조심 스럽게 침전을 방지 하 고 부유 혼합물을 유지 하기 위해 바이 알을 소용돌이.
3. 상기 혼합물 및/또는 용액이 상기 바이 알의 일부를 함유 하는 용액에 대해 직접 적외선 온도계로 측정 될 때, 적어도 130 ° c의 온도를 얻을 때까지이 마이크로파 공정을 반복 한다. 모든 고체 입자가 완전히 용 해 되어 더 이상 보이지 않는 때까지이 과정을 반복 합니다.
   참고: 바이 알과 용액을 때때로 냉각 하는 것이 좋습니다, 특히 제제가 높은 rSSp의 농도가 있는 경우. 200 ° c를 초과 하는 온도는 바이 알 씰 실패의 위험을 증가 시킵니다. 특별 한 주의가 또한 유리병 억제 실패를 초래 하는 물개에 접촉에서 과열 된 혼합물/해결책을 방지 하기 위하여 주어져야 합니다.
4. RSSp 혼합물을 용액에 성공적으로 용 매 화 시킨 후 용액 및 바이 알 캡의 온도를 개방 하기 전에 100 ° c (끓는점) 이하로 냉각 시켰다.

3. 하이드로 겔

1. 마이크로웨이브에서 제거한 후 용액 으로부터 하이드로 겔을 제조 하 고이를 냉각 및 설정할 수 있도록 한다. 완전히 냉각 되도록 하기 전에 하이드로 겔을 특정 형상으로 주조 하십시오.
   참고: 다른 Rssp는 하이드로 겔로 전환 하기 위해 다양 한 양의 시간이 필요 합니다. 예를 들어, MaSp2 같은 서 열은 MaSp1 유사 서 열에 비해 더 빠르게 하이드로 겔을 형성 하는 경향이 있다. 단백질 농도, 염도 및 pH는 또한 하이드로 겔로의 전이 속도에 직접적으로 영향을 미친다.

4. 스폰지

1. 1 차 용 매 화 용액을 먼저 허용 하 여 rSSp 스폰지를 준비 하 여 하이드로 겔을 형성 한다.
2. 하이드로 겔을 수조에 놓고이 목욕을-20°c의 냉동 실에 놓고 목욕이 완전히 얼어 붙을 때까지 기다리십시오.
3. 25 ° c에서 냉동 및 해 동 으로부터 동결 된 하이드로 겔 및 수조를 제거 하 여 스폰지 형성 과정을 완료 한다. 결과 스폰지는 이제 해 동 된 물에서 제거 할 수 있습니다.

5. lyogel

1. 형성 된 하이드로 젤을 수 욕 유무에 관계 없이 직접 동결 하 고 동결 된 하이드로 겔 샘플을 동결 건조 기로 이송 하 여 rSSp lyogel을 준비 합니다.
2. 수 분 승화가 발생 한 용기 로부터 최종 동결 건조 된 겔 물질을 제거 한다.

6. 필름 및 코팅

1. 다음 세 가지 방법 중 하나를 사용 하십시오: 솔루션 주조, 용액 분무 또는 딥 코팅으로 rSSp의 필름 또는 코팅을 생성 합니다.
   1. 가용 화 된 실크 용액을 원하는 형상의 PDMS 형태로/상으로 캐스팅 한다.
   2. 200 µ L의 필름 용액을 붓고 확산 하 고이를 테스트 또는 치료를 위해 PDMS 기판에서 벗 겨 내기 전에 건조 시키십시오.
   3. 이러한 건조를 허용 한 후, 기계적 시험을 위해 형성 된 필름을 제거 하거나 기계적 성질을 향상 시키기 위해 필름을 후 처리 한다.
2. 기판 으로부터 제거 될 수 없는 코팅 또는 필름을 제조 하기 위해, 스프레이 또는 딥 코팅을 사용 하 여 박막 층을 생성 한다.
   참고: 코트 스프레이,이 프로토콜은 마스터에 어 브러시 모델 페인트 분무기와 성공을 발견 했다.
   1. 선택한 기판을 가용 화 된 rSSp에 간단히 결합 하 고 건조 후에 반복 하 여 원하는 두께를 달성 함으로써 딥 코팅을 형성 합니다.
   2. 최종 코팅의 일관성과 효과를 높이기 위해 딥 코트를 적용 하기 전에 초기 스프레이 코트를 수행 하십시오.

7. 접착제

참고: 접착제의 형성은 다음 방법 중 하나를 통해 달성 된다.

1. 가용 화 된 rSSp를 기판에 직접 추가한 다음 용액 상단에 두 번째 기판을 적용 합니다. 조각을 함께 단단히 고정 한 다음 최소 온도 25°c의 최소 온도로 16 시간 동안 오븐에서 샘플을 건조 시키십시오.
2. 또는 스프레이 코팅으로 두 개의 기판 표면을 분무 한 다음 기판을 함께 고정 합니다.
3. 딥을 통해 rSSp를 적용 하 여 기판을 코팅 하 고 기판을 부착 하는 방법도 제조 및 접착에 사용 될 수 있다.

8. 습식 방적 섬유

1. 가용 화 된도 프 용액을 Luer 로크 팁이 있는 동심 주사기에 19G의 글라이드 바늘로 로드 합니다. 기포를 배출 하 고도 프가 주사기의 Luer Lok 끝에 앉도록 하십시오.
2. 1/16 인치 OD 및 10/32 원뿔에 대 한 PEEK 튜브의 일체형 손가락 꽉 피팅에 PEEK 튜브, 내부 직경 0.01 인치 이상 25mm를 삽입 합니다. 이 피팅을 Luer-록 암 어댑터의 PEEK 튜빙에 부착 합니다.
   1. 로드 된 주사기에 설정 된 19 게이지 바늘을 교체 합니다.
3. 응고 욕에 사용 하기 위해 99% 순수이 소 프로 판 올로 크고 깨끗 한 유리 욕을 채우십시오.
   1. 스트레칭 godets 아래에 있는 스트레칭 목욕을 채우십시오. 첫 번째 스트레치 욕조에 증류수와 20:80이 소 프로 판 올: 증류수를 두 번째 스트레칭 욕조에 80:20이 소 프로 판 올이 있습니다.
4. 상기 첫 번째 고 데는 응고 욕 후 제 1 고 뎃과 동일한 속도로 회전 하 게 되는 고 뎃 연신 시스템을 설정 한다.
   1. 스트레치 배스 1, 미들 어퍼 고 뎃, 스트레치 배스 2의 첫 번째 밑단의 속도를 동일한 속도로 조정 하 여 첫 번째 스트레칭을 시작 합니다. 이 속도는 초기 파이버 제거 속도 보다 2 배 빠릅니다.
   2. 두 번째 스트레칭을 시작 하는 최종 밑단의 속도를 조정 하 여 스트레칭 목욕 2, 마지막 상단 밑단, 그리고 같은 속도로 와인 더. 이 속도는 첫 번째 스트레치에 사용 되는 속도 또는 초기 섬유 제거 속도의 4 배 만큼 빠르게 2 배가 됩니다.
   3. 섬유를 미 끄 러 지는 것을 유지 하기 위해 중간 godets의 외부에 니트 릴 장갑을 놓으십시오.
5. 응고 욕에 용액을 천천히 돌출 시키기 시작 합니다. 자동 시스템에서는 압출 속도가 10mm/s의 제거 속도와 일치 하도록 설정 합니다.
   1. 얇은 금속 걸이 또는 집게로 사용 하 여 목욕에서 섬유를 당기기 전에 섬유 압출이 균일 해질 수 있습니다. 목욕에서 섬유를 제거 확인 PEEK 튜브 팁 사이에 루프를 생성 하 고, 섬유는 목욕을 떠나는 경로.
6. 섬유는 스트레칭 화장실에 잠겨 있지만, 스풀에 가기 전에 스트레칭 목욕 사이의 공기에 건조 등의 일련의 godets를 통해 검색 된 섬유를 안내 합니다. 이 건조는 높은 배치 중간 godets에 의해 달성 된다.
   참고: 섬유 제거 율 및/또는 압출 율은 응고 욕 바닥에 섬유를 풀링 하지 않고 충분 한 응고 시간을 허용 하기 위해 단백질 농도, 첨가제 및 단백질 유형에 따라 조정 해야 합니다.
7. 테이프를 사용 하 여 와인 더 메커니즘에 스풀에 완전히 뻗어 섬유를 연결 합니다.

결과

설명 된 rSSp 가용 화 방법 으로부터, 도 1에 보이는 바와 같이 다양 한 재료 형태가 달성 될 수 있다. 가용 화의 방법은 종래의 전자 렌지에 의해 생성 된 열 및 압력을 rSSp 및 물 현 탁 액에 적용 하는 것 이다. 중요 한 온도와 압력이 달성 되 면 단백질은 가용 화 될 것입니다. 이 가용 화 rSSp 솔루션에서 필요한 조건은 하이드로 겔, 라이 겔, 스폰지, 접?...

토론

재조합 거미 실크 단백질이 정제 된 후에는 물질 형성에 사용 될 수 있는 용액으로 제조 되어야 한다. 동결 건조 된 거미 실크 단백질을 물과 혼합 하 고이 혼합물을 마이크로파 조사에 노출 시 킴으로써, 열 및 압력을 발생 시키고, rSSp 용액을 제조할 수 있다. RSSp 가용 화의 간단 하 고 효율적인 방법으로 다양 한 재료 형태를 생산할 수 있습니다. 각 재료는 원하는 결과와 특성을 달성 하기 위해 고...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip	BD	309657	Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225142	Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap	Wheaton	225144	Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade	Pharmco-Aaper	231000099
Freezone 4.5 Plus	Labconco	7386030	Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE)	IDEX	P-629
Microwave	Magic Chef	HMD1110B	120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD	IDEX	F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID	IDEX	1531B
Sprayer: Master Airbrush	Master Airbrush	TC-60