توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Summary

وقد كان التنميط البروتيني للبروتينات التيروزين-نترات تقنية صعبة بسبب وفرة منخفضة من التعديل 3-nitrotyrosine. هنا نحن نوصف نهج جديد لإثراء nitropeptide والتنميط باستخدام أنجيوتنسين الثاني كنموذج. ويمكن توسيع هذه الطريقة لأنظمة أخرى في المختبر أو في الجسم الحي.

Abstract

المعايرة البروتينية هي واحدة من أهم التعديلات بعد الترجمة (PTM) على بقايا التيروزين ويمكن أن يسببها الإجراءات الكيميائية من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وأنواع النيتروجين التفاعلية (RNS) في الخلايا eukaryotic. تحديد دقيق لمواقع التغذية على البروتينات أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات الفسيولوجية والمرضية المتعلقة بالنفية البروتين، مثل الالتهاب والشيخوخة والسرطان. وبما أن البروتينات النتراتية قليلة الوفرة في الخلايا حتى في ظل الظروف المستحثة، لم يتم تطوير أي أساليب عالمية وفعالة لتحديد خصائص مواقع التغذية البروتينية وتحديدها. هنا نحن وصف بروتوكول لإثراء nitropeptide باستخدام تفاعل خفض المواد الكيميائية ووضع العلامات البيوتين، تليها قياس الطيف الكتلي عالية الدقة. في طريقتنا، يمكن تحديد مشتقات نيتروبتيد بدقة عالية. أسلوبنا يعرض اثنين من المزايا مقارنة مع الأساليب التي تم الإبلاغ عنها سابقا. أولاً، يستخدم وضع العلامات ثنائي الميثيل لمنع الأمين الأساسي على nitropeptides، والتي يمكن استخدامها لتوليد نتائج كمية. وثانياً، تستخدم رابطة ثاني كبريتيد تحتوي على كاشف من NHS-البيوتين للتخصيب، ويمكن زيادة تخفيضه وألوكيلة لتعزيز إشارة الكشف على مطياف الكتلة. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على نموذج الببتيد أنجيوتنسين الثاني في الورقة الحالية.

Introduction

النِيْتَرَة من بقايا التيروزين في البروتينات لتشكيل 3-nitrotyrosine ينظم العديد من العمليات البيولوجية. بسبب الخصائص الكيميائية المختلفة بين التيروزين و 3-nitrotyrosine، قد يكون البروتين النترات اضطراب نشاط إشارة^1،2. لذلك، من المهم تطوير الأساليب التي يمكن أن تثري وتحدد مواقع التغذية على البروتينات بكفاءة. كما 3-nitrotyrosine هو تعديل وفرة منخفضة على البروتينات مقارنة مع أشكال أخرى من PTM، مثل الفوسفورية والاسيتيل، فإنه من الصعب تحديد مواقع النخلة الذاتية مباشرة من خطوط الخلايا أو عينات الأنسجة. ومع ذلك، تم تطوير منهجية استخدام قياس الطيف الكتلي (MS) لوصف نمط التجزؤ من nitrotpeptide (علىسبيل المثال، زان وDesiderio 3)، الذي يضع الأساس لأساليب جديدة من nitroproteomics.

حاليا، خطوة الإثراء تليها MS هي الاستراتيجية الأقوى لnitropeptide التنميط^4،5. ويمكن تصنيف أساليب الإثراء إلى فئتين. ويستند فئة واحدة على الأجسام المضادة التي يمكن أن تعترف 3-nitrotyrosine على وجه التحديد، في حين أن الطبقة الأخرى تقوم على اشتقاق الكيميائية التي تقلل من مجموعة نيترو إلى مجموعة أمين^4،5. للأسلوب القائم على الأجسام المضادة، يتم استخدام عمود تقارب النيتروتيروزين للتخصيب، والتي يتم من خلاله حل المادة المُشار عنها وتحليلها من خلال دقة عالية MS^6،7. بالنسبة للأسلوب القائم على الاشتقاق الكيميائي، يجب حظر مجموعات الأمين في المحطة N من الببتيد أو يسين في الخطوة الأولى إما عن طريق أسيتيليشن، علامات متساوية الشبه لكمية نسبية ومطلقة (iTRAQ)، أو علامات كتلة جنبا إلى جنب (TMT) الكواشف. بعد ذلك، يتم استخدام المخفض للحد من النيتروتيروزين إلى أمينالتيوسين متبوعا بتعديل مجموعة الأمين شكلت حديثا، والتي تشمل ربط البيوتين، تحويل الببتيد الكبريتات، أو أنواع أخرى من أنظمة الوسم^{8،9، 10,11}. وتستند معظم البروتوكولات التي أنشئت حتى الآن على البروتينات في المختبر الإفراط في النترات، بدلا من البروتينات النترات الذاتية.

في هذه الدراسة، تم تطوير إجراء معدل للاشتقاق الكيميائي من النيتروتيروزين لإثراء nitropeptide وتحديد، والذي يظهر حساسية معززة أثناء الكشف عن التصلب المتعدد ومناسبة لغرض القياس الكمي. حددت دراستنا الأخيرة التي تستخدم هذه الطريقة في النظم البيولوجية أن النفية من البروتين التيروزين كيناز (LCK) محددة اللمفاوية (LCK) في Tyr394 من قبل RNS المنتجة من الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع (MDSCs) يلعب دورا هاما في كبت المناعة من الورم microenvironment¹². ولذلك، يمكن تطبيق طريقة تحديد nitropeptide لدينا على العينات البيولوجية المعقدة كذلك. هنا، ونحن نوصف بروتوكوللدينا باستخدام نموذج الببتيد أنجيوتنسين الثاني، الذي هو معروف نمط التجزؤ وتستخدم على نطاق واسع في الدراسات nitroproteomic^8،9،10،11، على سبيل المثال.

Protocol

1. نِيأيشن أنجيوتنسين الثاني

1. لتوليد الببتيد النترات، تمييع 10 ميكرولتر من الأنجيوتنسين الثاني (DRVYIHPF) محلول الأم (2 مللي م في الماء) في 390 ميكرولتر PBS الحل (10 m NaH₂PO₄، 150 m NaCl، درجة الألف 7.4) في التركيز النهائي من 50 ميكرومتر.
2. إضافة 10 ميكرولتر من البيروكسينيتريت (200 مللي أمبير في 4.7٪ النوى) إلى الحل أنجيوتنسين الثاني لجعل التركيز النهائي من البيروكسينيتريت 5 mM.
   ملاحظة: Peroxynitrite غير مستقر وسهلة لحل عندما يكون في شكل حمض، لذلك يتم الاحتفاظ الحل الأم من peroxynitrite في الحل الأساسي وتخزينها في -80 درجة مئوية.
3. ضبط قيمة رقم الولل للمحلول إلى 7-8 في 1 M HCl. لبدء رد فعل النيستريون، هز الأنبوب في 400 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
4. استخدم عمود SPE للمرحلة العكسية المتاحة تجارياً (راجع جدولالمواد) لإزالة الملح.
   1. إعداد 2 حلول لdesalting، 5٪ الميثانول في الماء للغسيل و 80٪ الميثانول في الماء للالأوتيون.
   2. إضافة 500 μL من الميثانول، تليها 500 μL من الماء إلى الشرط المسبق للعمود، وضع 1 مل pipettor مع طرف على الجزء العلوي من العمود، اضغط على pipettor لتسريع تدفق.
   3. تحميل 410 μL من العينة في الخطوة 1.3 على العمود، تجاهل التدفق من خلال.
   4. بعد الغسيل مع 500 ميكرولتر من 5٪ الميثانول، واستخدام 300 μL من 80٪ من الميثانول إلى elute nitropeptide، الذي يتم بعد ذلك تجفيفها بالكامل عن طريق سرعة-vac في الإعداد الافتراضي في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: إزالة الملحمهم جدا ً لردود الفعل، حيث أن المذيب الأيسر في الخطوة السابقة قد يكون له تأثير سلبي على الخطوات التالية.

2- ألكيلة الأمينات الأولية بواسطة وسم ثنائي الميثيل

1. إعادة تشكيل مسحوق نيترو-أنجيوتنسين الثاني في 100 ميكرولتر من 100 مللي m ثلاثي إيثيل الأمونيوم بيكربونات (TEAB) الحل.
   ملاحظة: يجب أن تكون قيمة الرقم الpH الحل بين 7 و 9 وتأكد من عدم إضافة أمين الأساسي في الحل.
2. أضف 4 ميكرولتر من الفورمالديهايد 4% إلى الحل، اخلطه لفترة وجيزة.
   تحذير: أبخرة الفورمالديهايد سامة; إجراء التجارب في غطاء محرك الدخان.
3. أضف 4 ميكرولتر من 0.6 M NaBH₃CN إلى الحل، هز الأنبوب في 400 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
4. تُقَدَم ردّة فعل الوسم بإضافة 16 ميكرولتر من محلول الأمونيا 1%، وتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
5. إضافة 8 μL من حمض الفورميك لحمض الحل وتنفيذ desalting باستخدام عكس المرحلة SPE العمود كما هو موضح في الخطوة 1.4.

3. الحد من النيتروتيروزين إلى أمينيروسين

1. إعادة تشكيل ثنائي ميثيل المسمى نيترو-أنجيوتنسين الثاني في 500 ميكرولتر من PBS (10 m NaH₂PO₄, 150 m M NaCl, pH 7.4).
2. إضافة 10 ميكرولتر من 1 م ثنائي الصوديوم إلى محلول واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. بعد رد فعل التخفيض، يصبح اللون الأصفر للحل واضحًا.
   ملاحظة: وزن 174.1 ملغ ثنائي ثيونات الصوديوم وحله في الماء لجعل الحجم النهائي هو 1 مل. يمكن تخزين هذا الحل في -20 درجة مئوية لا يزيد عن أسبوع.
3. استخدام العمود SPE المرحلة العكسية لdesalting كما هو موضح في الخطوة 1.4.

4. التخصيب الحيوي، والتخصيب، والكشف

1. إعادة تشكيل ثنائي ميثيل المسمى الأمينية أنجيوتنسين الثاني في 500 ميكرولتر من PBS (10 m NaH₂PO₄, 150 m M NaCl, pH 7.4).
2. إضافة 5 μL من 40 NM NHS-S-S-البيوتين، وتذوب في DMSO، إلى الحل، بعد 2 ح الحضانة في درجة حرارة الغرفة، واستخدام 1 μL من هيدروكسيلامين 5٪ لإرواء رد الفعل.
3. في هذه الأثناء، توازن ستربفيدين خرز أغاروز بإضافة 500 ميكرولتر من PBS (10 mM NAH₂PO_4،150 mM NaCl، درجة الـ 7.4 درجة الألف)، ودرجة حرارة 580 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ونبذ supernatant. أداء التوازن 3 مرات.
4. إضافة 100 μL ستربتينين خرز أجاروز إلى نظام رد الفعل، احتضان 1 ح على الهزاز الدوارة في درجة حرارة الغرفة. غسل 4 مرات مع PBS (10 m NaH₂PO_4،150 m كلوريد الصوديوم، وpH 7.4). لكل خطوة الغسيل، إضافة 500 ميكرولتر من PBS إلى الخرز، وتخلط جيدا، ثم الطرد المركزي في 580 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل supernatant.
5. استخدام 400 μL من 10 m dithiothreitol (DTT) لحضانة مع خرز الأغاروز في 50 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، وتدور في 580 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل الخرز، إضافة 20 μL من 0.5 M idoacetamide (IAM) إلى سوبرناتان لمدة 20 دقيقة في الظلام.
   ملاحظة: DTT يستخدم لكسر السندات ثاني كبريتيد بين صلة البيوتين والببتيد، وهذا الأخير هو الافراج عن الخرز ومزيد من الألكيلة من قبل IAM.
6. استخدام العمود SPE المرحلة العكسية لdesalting هو موضح في الخطوة 1.4.
7. بعد حل الببتيدات الجافة في 20 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ (FA)، وإخضاع المنتج من كل قسم إلى الكروماتوغرافيا السائلة مع الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (LC-MS / MS) تحليل.
   1. فصل الببتيدات أنج الثاني المعدلة بواسطة 60 دقيقة التدرج (0-8 دقيقة، 2 في المائة باء؛ 8-10 دقائق، 5 في المائة باء؛ 10-35 دقيقة، 18 في المائة باء؛ 35-50 دقيقة، 28 في المائة باء؛ 50-52 دقيقة، 80 في المائة باء؛ 52-58 دقيقة، 80 في المائة باء؛ 58-59 دقيقة، 2 في المائة باء؛ 59-60 دقيقة، 2 في المائة ب) بمعدل تدفق 0.300 ميكروغرام/دقيقة مع نظام نانو-HPLC الذي هو واجهة مباشرة مع مطياف كتلة عالية الدقة.
      ملاحظة: العمود التحليلي هو في 75 μm ID، 150 مم طول، معبأة مع الراتنج C-18. المرحلة المتنقلة أ تألفت من 0.1٪ حمض الفورميك، والمرحلة المتنقلة B تتكون من 100٪ الأسيتونيتريل و 0.1٪ حمض الفورميك.
   2. تشغيل مطياف الكتلة في وضع الاستحواذ المعتمد على البيانات، تعيين طيف كتلة مسح كامل واحد (300-1800 م /ض، 60 000 القرار) تليها 20 بيانات تعتمد على MS / MS بمسح في 28% تطبيع طاقة الاصطدام.
   3. بيانات الأطياف الكتلية المفتوحة وتحديد قمم المنتج في كل خطوة للتأكد من أن التفاعل الكيميائي قد تم تنفيذه بنجاح.

5. الكمية من نيتروببتيد

1. إعداد 3 مجموعات من حلول نيترو-أنجيوتنسين الثاني من الخطوة 1.4، كل مجموعة تحتوي على 2 تركيزات من نيترو-أنجيوتنسين الثاني: تعيين #1، 20 نمول في أنبوب A و 20 نمول في أنبوب B، كل في 100 محلول الكهب ميكرون; تعيين #2، 10 نمول في أنبوب C و 20 نمول في أنبوب D، كل في 100 محلول ميكروب ميكرون؛ تعيين #3، 40 نمول في أنبوب E و 10 نمول في أنبوب F، كل في 100 محلول ميكروب ميكرون.
   ملاحظة: يتم استخدام تركيزين من نيترو-أنجيوتنسين الثاني في كل مجموعة لوضع العلامات ثنائي ميثيل، للرد مع الفورمالديهايد (الضوء) والفورمالديهايد-D2 (الثقيلة)، على التوالي.
2. لكل مجموعة، إضافة 4 μL من 4٪ الفورمالديهايد والفورمالديهايد-D2 إلى العينة التي وصفت بأنها خفيفة وثقيلة، على التوالي. اتبع الخطوات من 2.3 إلى 2.5 لإنهاء وضع العلامات ثنائي الميثيل.
3. اخلطي العينات الخفيفة والثقيلة.
4. اتبع الخطوات من 3.1 إلى 4.6 للحد من التخصيب الحيوي والتخصيب والكشف.

النتائج

يظهر المخطط الانسيابي لتنميط النيتروببتيد في هذه المخطوطة في الشكل 1. الشكل 2و 3و 4 و 5 تظهر الأطياف الكتلية للأنجيوتنسين الثاني، نيترو-أنجيوتنسين الثاني، ثنائي ميثيل المسمى نيترو-أنجيوتنسين الثاني و ثنائي ميثيل المسمى الأمينية ?...

Discussion

يصف البروتوكول هنا ال [نيتروببتيد] إغناء وتوصيف. باستخدام أنجيوتنسين الثاني كما الببتيد نموذج, أوضحنا الإجراء المبين في الشكل 1. بعد الحصول على نيترو-أنجيوتنسين الثاني، ينبغي أن يتم حظر الأمين الأساسي على الببتيد لتجنب مزيد من اقتران الأمين، والتي هي واحدة من الخطوات الأك?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acclaim pepmap 100 C18 column	Thermo-Fisher	164534
1 M TEAB solution	Sigma-Aldrich	T7408
50% hydroxylamine	Thermo-Fisher	90115
Acetonitrile	Thermo-Fisher	A955	MS Grade
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2	Toronto Research Chemicals	F691353
formic acid	Sigma-Aldrich	695076	ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo
isoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
Methanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
NHS-S-S-bition	Thermo-Fisher	21441
Oasis HLB column (10 mg)	Waters	186000383
peroxynitrite	Merck-Millipore	516620
sodium cyanoborohydrite	Sigma-Aldrich	42077	PhamaGrade
sodium dithionate	Sigma-Aldrich	157953	Technical Grade
Streptavidin Sepharose	GE Healcare	GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC	Thermo