Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Zusammenfassung

Die proteomische Profilierung von Tyrosin-Nitrat-Proteinen war aufgrund der geringen Häufigkeit der 3-Nitrotytyrosin-Modifikation eine anspruchsvolle Technik. Hier beschreiben wir einen neuartigen Ansatz für die Nitropeptidanreicherung und Profilierung unter Verwendung von Angiotensin II als Modell. Diese Methode kann für andere In-vitro- oder In-vivo-Systeme erweitert werden.

Zusammenfassung

Proteinnitration ist eine der wichtigsten post-translationalen Modifikationen (PTM) an Tyrosinrückständen und kann durch chemische Aktionen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktiven Stickstoffarten (RNS) in eukaryotischen Zellen induziert werden. Die genaue Identifizierung von Nitrationsstellen auf Proteinen ist entscheidend für das Verständnis der physiologischen und pathologischen Prozesse im Zusammenhang mit Proteinnitration, wie Entzündungen, Alterung und Krebs. Da die nitratierten Proteine auch unter induzierten Bedingungen in Zellen von geringer Fülle sind, wurden keine universellen und effizienten Methoden zur Profilierung und Identifizierung von Proteinnitrationsstellen entwickelt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Nitropeptidanreicherung mit einer chemischen Reduktionsreaktion und Biotin-Etikettierung, gefolgt von hochauflösender Massenspektrometrie. In unserer Methode können Nitropeptidderivate mit hoher Genauigkeit identifiziert werden. Unsere Methode weist zwei Vorteile gegenüber den zuvor gemeldeten Methoden auf. Erstens wird die Dimethylkennzeichnung verwendet, um das primäre Amin auf Nitropeptiden zu blockieren, die verwendet werden können, um quantitative Ergebnisse zu generieren. Zweitens wird zur Anreicherung eine Disulfidbindung verwendet, die NHS-Biotin-Reagenz enthält, die weiter reduziert und alkyliert werden kann, um das Detektionssignal auf einem Massenspektrometer zu verbessern. Dieses Protokoll wurde im aktuellen Papier erfolgreich auf das Modellpeptid Angiotensin II angewendet.

Einleitung

Die Nitration von Tyrosinrückständen in Proteinen zu 3-Nitrotyrosin reguliert viele biologische Prozesse. Aufgrund der unterschiedlichen chemischen Eigenschaften zwischen Tyrosin und 3-Nitrotyrosin kann ein nitratiertes Protein die Signalwirkung^1,2gestört haben. Daher ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, die Nitrationsstellen auf Proteinen effizient anreichern und identifizieren können. Da 3-Nitrotyrosin eine geringe Häufigkeitsmodifikation auf Proteine im Vergleich zu anderen Formen von PTM, wie Phosphorylierung und Acetylierung, ist es schwierig, endogene Nitrationsstellen direkt aus Zelllinien oder Gewebeproben zu identifizieren. Dennoch wurde die Methode der Verwendung von Massenspektrometrie (MS) entwickelt, um das Fragmentierungsmuster von Nitrotpeptid zu charakterisieren (z. B. Zhan & Desiderio³), die den Grundstein für neue Methoden der Nitroproteomik legt.

Derzeit ist ein Anreicherungsschritt gefolgt von MS die stärkste Strategie für Nitropeptid Profilierung^4,5. Die Anreicherungsmethoden können in zwei Klassen eingeteilt werden. Eine Klasse basiert auf Antikörpern, die 3-Nitrotyrosin spezifisch erkennen können, während die andere Klasse auf der chemischen Ableitung basiert, die eine Nitrogruppe auf eine Amingruppe^{reduziert 4,5}. Für die Antikörper-basierte Methode wird nitrotyrosin-Affinitätssäule für die Anreicherung verwendet, aus der das eluierte Material weiter gelöst und mit hochauflösendem MS^6,7analysiert wird. Für die chemische Ableitungsmethode sollten die Amingruppen am N-Terminus des Peptids oder Lysins im ersten Schritt entweder durch Acetylierung, isobarere te-Tags für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) oder Tandemmassen-Tags (TMT)-Reagenzien blockiert werden. Als nächstes wird ein Reduzierer verwendet, um Nitrotyrosin zu Aminotyrosin zu reduzieren, gefolgt von einer Änderung der neu gebildeten Amingruppe, die Biotinligation, Sulphydrylpeptid-Konvertierung oder andere Arten von Tagging-Systemen^8,9, ^10,11. Die meisten der bisher etablierten Protokolle basieren auf in vitro übernitrateten Proteinen statt auf endogen nitratierten Proteinen.

In der vorliegenden Studie wurde ein modifiziertes Verfahren zur chemischen Ableitung von Nitrotyrosin zur Nitropeptidanreicherung und -identifikation entwickelt, das eine erhöhte Empfindlichkeit beim MS-Nachweis zeigt und für Quantifizierungszwecke geeignet ist. Unsere jüngste Studie, die diese Methode in biologischen Systemen verwendet, hat gezeigt, dass die Nitration der lymphozytenspezifischen Proteintyrosinkinase (LCK) bei Tyr394 von RNS, die aus myeloiden abgeleiteten Suppressorzellen (MDSCs) hergestellt wird, eine wichtige Rolle bei der Immunsuppression der Tumormikroumgebung¹². Daher kann unsere Methode der Nitropeptid-Identifikation auch auf komplexe biologische Proben angewendet werden. Hier beschreiben wir unser Protokoll anhand des Modells Peptid Sgiotensin II, von dem das Fragmentierungsmuster bekannt ist und in nitroproteomischen Studien 8,^9,10,11als Beispiel weit verbreitet ist.

Protokoll

1. Nitration von Angiotensin II

1. Zur Erzeugung von nitratiertem Peptid 10 l Angiotensin II (DRVYIHPF) Mutterlösung (2 mM in Wasser) in 390 L PBS-Lösung (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7,4) bei der Endkonzentration von 50 m zu verdünnen.
2. Fügen Sie der Angiotensin-II-Lösung 10 l Peroxynitritrit (200 mM in 4,7 % NaOH) hinzu, um die Endkonzentration von Peroxynitrit 5 mM herzustellen.
   HINWEIS: Peroxynitrit ist instabil und leicht zu lösen, wenn es in saurer Form ist, so dass die Übergeordnete Lösung von Peroxynitrit in einer Grundlösung aufbewahrt und in -80 °C gelagert wird.
3. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7-8 mal 1 M HCl ein. Um die Nitrationsreaktion zu initiieren, schütteln Sie das Rohr bei 400 U/min für 5 min.
4. Verwenden Sie eine handelsübliche Reverse-Phase-SPE-Spalte (siehe Materialtabelle) für die Entaltung.
   1. Bereiten Sie 2 Lösungen für die Entsalzung, 5% Methanol in Wasser für das Waschen und 80% Methanol in Wasser für die Elution vor.
   2. Fügen Sie 500 l Methanol hinzu, gefolgt von 500 l Wasser, um die Säule vorzukonditionieren, 1 ml Pipettiertor mit der Spitze auf die Oberseite der Säule legen, den Pipettentor drücken, um den Durchfluss zu beschleunigen.
   3. Laden Sie 410 l der Probe in Schritt 1.3 auf die Säule, verwerfen Sie den Durchfluss durch.
   4. Verwenden Sie nach dem Waschen mit 500 l 5 % Methanol 300 l 80 % Methanol, um das Nitropeptid zu entleeren, das dann in der Standardeinstellung bei Raumtemperatur vollständig durch Speed-vac getrocknet wird.
      HINWEIS: Die Entsalzung ist sehr wichtig für die Reaktionen, da das im vorherigen Schritt übrig gebliebene Lösungsmittel sich negativ auf die nächsten Schritte auswirken kann.

2. Alkylierung von primären Auminen durch Dimethylkennzeichnung

1. Rekonstituieren Sie die pulverisierte Nitro-Angiotensin-II-Lösung in 100 l von 100 mM Triethylammonium-Bicarbonat (TEAB).
   HINWEIS: Der pH-Wert der Lösung sollte zwischen 7 und 9 liegen und sicherstellen, dass der Lösung kein primäres Amin hinzugefügt wird.
2. 4 l 4% Formaldehyd in die Lösung geben, kurz mischen.
   VORSICHT: Formaldehyddämpfe sind giftig; die Experimente in einer Dunstabzugshaube durchführen.
3. Fügen Sie der Lösung 4 l 0,6 M NaBH₃CN hinzu, schütteln Sie das Rohr bei 400 U/min für 1 h bei Raumtemperatur.
4. Die Etikettierreaktion durch Zugabe von 16 l 1% Ammoniaklösung zulöschen, bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren.
5. Fügen Sie 8 l Ameisensäure hinzu, um die Lösung zu säuern und die Entsalzung mit der umgekehrten Phase der SPE-Säule durchzuführen, wie in Schritt 1.4 beschrieben.

3. Reduktion von Nitrotyrosin zu Aminotyrosin

1. Rekonstituieren Sie das Dimethyl-beschriftete Nitro-Angiotensin II in 500 l PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4).
2. 10 l 1 M Natriumdithionat in die Lösung geben und bei Raumtemperatur 1 h brüten. Nach der Reduktionsreaktion wird die gelbe Farbe der Lösung deutlich.
   HINWEIS: Wiegen Sie 174,1 mg Natriumdithionat und lösen Sie es in Wasser auf, um das Endvolumen von 1 ml zu machen. Diese Lösung kann bei -20 °C nicht länger als eine Woche gelagert werden.
3. Verwenden Sie die in Schritt 1.4 beschriebene Sp-Spalte der Rückwärtsphase für die Entaltung.

4. Biotinylation, Anreicherung und Detektion

1. Rekonstituieren Sie das dimethylmarkierte Amino Angiotensin II in 500 l PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4).
2. Fügen Sie der Lösung 5 l 40 nM NHS-S-S-Biotin, gelöst in DMSO, in die Lösung ein, verwenden Sie nach 2 h Inkubation bei Raumtemperatur 1 l 5% Hydroxylamin, um die Reaktion zu löschen.
3. In der Zwischenzeit, Gleichgewicht Streptavidin Agarose Perlen durch Zugabe von 500 L PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4), Zentrifugieren bei 580 x g für 5 min bei Raumtemperatur und Wegwerfen des Überstandes. Führen Sie das Gleichgewicht 3 mal aus.
4. 100 L Streptavidin-Agarose-Perlen in das Reaktionssystem geben, 1 h auf einem Drehschüttler bei Raumtemperatur inkubieren. 4 mal mit PBS waschen (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4). Für jeden Waschschritt 500 l PBS zu den Perlen geben, gut mischen, dann bei 580 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
5. Verwenden Sie 400 l von 10 mM Dithiothreitol (DTT), um mit Agarosaperlen bei 50 °C für 45 min zu brüten, bei 580 x g für 5 min bei Raumtemperatur nach unten zu drehen und die Perlen zu entsorgen, 20 l 0,5 M Idoacetamide (IAM) in 20 min in der Dunkelheit zum Überstand hinzuzufügen.
   HINWEIS: DTT wird verwendet, um die Disulfidbindung zwischen der Verbindung von Biotin und Peptid zu brechen, letzteres wird aus Perlen freigesetzt und durch IAM weiter alkyliert.
6. Verwenden Sie die SPE-Spalte der Rückwärtsphase für die in Schritt 1.4 dargestellte Entaltung.
7. Nach dem Auflösen der trockenen Peptide in 20 l 0,1% Ameisensäure (FA) wird das Produkt jedes Abschnitts der Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) unterzogen.
   1. Trennen Sie die modifizierten Ang II Peptide durch eine 60 min Gradientenelution (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) bei einer Durchflussrate 0,300 l/min mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das 59-60 min, 2% B) mit einem Durchfluss 0,300 l/min mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC-System, das mit Nano-HPLC- direkt mit dem hochauflösenden Massenspektrometer in Verbindung steht.
      HINWEIS: Die analytische Säule ist in 75'm-ID, 150 mm Länge, verpackt mit C-18-Harz. Die mobile Phase A bestand aus 0,1 % Ameisensäure, und die mobile Phase B bestand aus 100 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure.
   2. Betreiben Sie das Massenspektrometer im datenabhängigen Erfassungsmodus, stellen Sie ein einziges Vollscan-Massenspektrum (300-1800 m/z, 60 000 Auflösung) ein, gefolgt von 20 datenabhängigen MS/MS-Scans mit 28 % normalisierter Kollisionsenergie.
   3. Offene Massenspektrendaten und identifizieren die Spitzen des Produkts in jedem Schritt, um zu bestätigen, dass die chemische Reaktion erfolgreich durchgeführt wurde.

5. Quantifizierung von Nitropeptid

1. Bereiten Sie 3 Sätze von Nitro-Angiotensin II-Lösungen aus Schritt 1.4 vor, die jeweils 2 Konzentrationen von Nitro-Angiotensin II enthalten: Set #1, 20 nmol in Tube A und 20 nmol in Tube B, jeweils in 100-l-TEAB-Lösung; Set #2, 10 nmol in Tube C und 20 nmol in Tube D, jeweils in 100 l TEAB-Lösung; Set #3, 40 nmol in Rohr E und 10 nmol in Rohr F, jeweils in 100 l TEAB-Lösung.
   Anmerkung: Die beiden Konzentrationen von Nitro-Angiotensin II in jedem Satz werden zur Dimethylkennzeichnung verwendet, um mit Formaldehyd (leicht) bzw. Formaldehyd-D2 (schwer) zu reagieren.
2. Fügen Sie der Probe, die als leicht und schwer zu kennzeichnen ist, für jeden Satz 4 l Formaldehyd und Formaldehyd-D2 hinzu. Befolgen Sie die Schritte 2.3 bis 2.5, um die Dimethylkennzeichnung abzuschließen.
3. Mischen Sie die leichten und schwer beschrifteten Proben.
4. Befolgen Sie die Schritte von 3.1 bis 4.6 für die Reduktion, Biotinylierung, Anreicherung und Detektion.

Ergebnisse

Das Flussdiagramm für Nitropeptidprofilierung in diesem Manuskript ist in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2, 3, 4 und 5 zeigen die Massenspektren von Angiotensin II, Nitro-Angiotensin II, Dimethyl beschriftetes Nitro-Angiotensin II und Dimethyl markiertes Amino Angiotensin II. Das Molekulargewicht der Verbindung kann durch die m/z-Werte des Monoisotopenspitzen in jeder Abbildung reflektiert werden, was darauf...

Diskussion

Das Protokoll beschreibt hier die Nitropeptid-Anreicherung und Profilierung. Anhand von Angiotensin II als Modellpeptid haben wir das in Abbildung 1dargestellte Verfahren veranschaulicht. Nach Erhalt des Nitro-Angiotensin II sollte das primäre Amin auf dem Peptid blockiert werden, um die weitere Aminkonjugation zu vermeiden, die einer der kritischsten Schritte innerhalb des Protokolls ist. Im aktuellen Protokoll wird die Dimethylkennzeichnung verwendet, um die primären Aumine aus zwei Grü...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acclaim pepmap 100 C18 column	Thermo-Fisher	164534
1 M TEAB solution	Sigma-Aldrich	T7408
50% hydroxylamine	Thermo-Fisher	90115
Acetonitrile	Thermo-Fisher	A955	MS Grade
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2	Toronto Research Chemicals	F691353
formic acid	Sigma-Aldrich	695076	ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo
isoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
Methanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
NHS-S-S-bition	Thermo-Fisher	21441
Oasis HLB column (10 mg)	Waters	186000383
peroxynitrite	Merck-Millipore	516620
sodium cyanoborohydrite	Sigma-Aldrich	42077	PhamaGrade
sodium dithionate	Sigma-Aldrich	157953	Technical Grade
Streptavidin Sepharose	GE Healcare	GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC	Thermo