НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Резюме

Протеомное профилирование тирозиновых белков было сложной техникой из-за низкого обилия 3-нитротирозиновой модификации. Здесь мы описываем новый подход к обогащению нитропептида и профилированию с помощью Angiotensin II в качестве модели. Этот метод может быть расширен для других систем in vitro или in vivo.

Аннотация

Нитрирование белка является одним из наиболее важных посттрансляционных модификаций (ПТМ) на тирозиновых остатках и может быть вызвано химическими действиями реактивных видов кислорода (ROS) и реактивных видов азота (RNS) в эукариотических клетках. Точное выявление участков нитации на белках имеет решающее значение для понимания физиологических и патологических процессов, связанных с нитрационной этилации белка, таких как воспаление, старение и рак. Поскольку нитовые белки имеют низкое изобилие в клетках даже в индуцированных условиях, не были разработаны универсальные и эффективные методы для профилирования и идентификации участков нитрационации белка. Здесь мы описываем протокол для обогащения нитропептида с помощью реакции химического сокращения и биотина маркировки, а затем высокого разрешения масс-спектрометрии. В нашем методе производные нитропептида можно отождествлять с высокой точностью. Наш метод обладает двумя преимуществами по сравнению с ранее заявленными методами. Во-первых, диметиловая маркировка используется для блокирования первичного амина на нитропептидах, которые могут быть использованы для получения количественных результатов. Во-вторых, для обогащения используется дисульфидная связь, содержащая реагент NHS-biotin, которая может быть дополнительно уменьшена и аклинила для усиления сигнала обнаружения на масс-спектрометре. Этот протокол был успешно применен к модели пептида Angiotensin II в текущем документе.

Введение

Нитирование остатков тирозина в белках для формирования 3-нитротирозин регулирует многие биологические процессы. Из-за различных химических свойств между тирозином и 3-нитротирозин, нитарный белок может иметь возмущенный сигнальной активности^1,2. Поэтому важно разработать методы, которые могут обогащать и идентифицировать места нитроации на белках эффективно. Как 3-нитротирозин является низким изменением изобилия на белки по сравнению с другими формами ПТМ, таких как фосфорилирование и ацетилирование, это сложно определить эндогенных нитрационных участков непосредственно из клеточных линий или образцов тканей. Тем не менее, была разработана методология использования масс-спектрометрии (МС) для характеристики фрагментации нитропептида (например, «Чжан энд Десидерио 3»), которая закладывает основу для новых методов нитропротеомики.

В настоящее время, шаг по обогащению следуют MS является наиболее мощной стратегией для нитропептида профилирования^4,5. Методы обогащения можно разделить на два класса. Один класс основан на антителах, которые могут распознавать 3-нитротирозин в частности, в то время как другой класс основан на химической производной, что снижает нитро группы амин группы^4,5. Для антител на основе метода, нитротирозин сродство колонка используется для обогащения, из которого eluted материал далее решается и анализируется с высоким разрешением MS^6,7. Для химического метода, основанного на производной, группы амина в N-терминах пептида или лизин должен быть заблокирован в первом шаге либо ацетилированием, изобариатом теги для относительной и абсолютной количественной оценки (iTRA)), или тандемных масс-тегов (TMT) реагентов. Далее, редуктор используется для уменьшения нитротирозин аминотирозин с последующим изменением вновь сформированной группы амина, которая включает в себя перевязку биотина, сульфидрявшее пептид преобразования, или другие типы систем пометки^{8,9, 10,11}. Большинство установленных до сих пор протоколов основаны на сверхнитированных белках in vitro, а не на эндогенно нитированных белках.

В настоящем исследовании разработана модифицированная процедура химического произввода нитротирозина для обогащения и идентификации нитропептида, которая показывает повышенную чувствительность при обнаружении рассеянного склероза и подходит для целей количественной оценки. Наше недавнее исследование, используюемое этот метод в биологических системах, показало, что нитрация лимфоцитов специфического белка тирозина киназы (LCK) на Tyr394 RNS, произведенная из миелоидных супрессоров (MDSCs), играет важную роль в иммуносупрессии опухолевой микросреды¹². Поэтому наш метод идентификации нитропептида может быть применен и к сложным биологическим образцам. Здесь мы описываем наш протокол с помощью модели пептида Angiotensin II, из которых фрагментация картина известна и широко используется в нитропротеомических исследований^8,9,10,11, в качестве примера.

протокол

1. Нитация Ангиотензина II

1. Для генерации нитированного пептида разбавьте 10 зл ангиотензина II (DRVYIHPF) в растворе 390 МЛ PBS (10 мм НаГ₂PO₄, 150 мМ NaCl, pH 7.4) при окончательной концентрации 50 мкм.
2. Добавьте 10 зЛ пероксинитрита (200 мм в 4,7% NaOH) в раствор Ангиотензин II, чтобы сделать окончательную концентрацию пероксинитита 5 мМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пероксинитрит нестабилен и легко решить, когда он находится в кислотной форме, поэтому родительский раствор пероксинитрита хранится в базовом растворе и хранится в -80 градусов по Цельсию.
3. Отрегулируйте значение pH раствора до 7-8 на 1 М HCl. Чтобы инициировать реакцию нитрации, встряхните трубку при 400 об/мин в течение 5 минут.
4. Для опреснения опреснения используйте коммерчески доступный столбец обратной фазы SPE (см. таблицуматериалов).
   1. Подготовьте 2 раствора для опреснения, 5% метанола в воде для мытья и 80% метанола в воде для elution.
   2. Добавьте 500 л метанола, а затем 500 л воды, чтобы предварительно состояние колонки, положить 1 мл пипетки с кончиком на верхней части колонки, нажмите пипетки для ускорения потока.
   3. Загрузите 410 л образца в шаге 1.3 на столбец, отбросьте поток через.
   4. После мытья с 500 л 5% метанола, используйте 300 л 80% метанола, чтобы утолить нитропетид, который затем полностью высушивается путем скоростного вакуума в настройке по умолчанию при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дезалостирование очень важно для реакций, так как растворитель, оставленный на предыдущем этапе, может оказать негативное влияние на следующие шаги.

2. Алкилирование первичных аминов с помощью диметиловой маркировки

1. Восстановите порошкообразный нитро-ангиотензин II в 100 л из 100 мм триэтиламмония бикарбоната (TEAB).
   ПРИМЕЧАНИЕ: значение pH раствора должно быть между 7 и 9, и убедитесь, что нет первичного амин добавляется в раствор.
2. Добавьте в раствор 4 qL 4% формальдегида, кратко перемешайте.
   ВНИМАНИЕ: Паров формальдегида являются токсичными; выполнять эксперименты в дымовой капюшон.
3. Добавьте в раствор 4 qL 0,6 M NaBH₃CN, встряхните трубку при 400 об/мин при температуре в комнате.
4. Утолить реакцию маркировки, добавив 16 л 1% раствора аммиака, инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
5. Добавьте 8 qL фомической кислоты, чтобы подкисить раствор и выполнить опреснение с помощью обратной фазы SPE столбец, как описано в шаге 1.4.

3. Снижение нитротирозина до аминотирозина

1. Восстановите диметил с маркировкой нитро-ангиотензин II в 500 л PBS (10 мМ₂PO_4,150 мм NaCl, рН 7.4).
2. Добавьте в раствор 10 зл 1 М дитионата натрия и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч. После реакции сокращения желтый цвет раствора становится ясным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Взвесьте 174,1 мг натрия dithionate и растворить его в воде, чтобы сделать окончательный объем 1 мл. Это решение может храниться при -20 градусов не более чем на неделю.
3. Используйте столбец обратной фазы SPE для опреснения, как описано в шаге 1.4.

4. Биотинилагация, обогащение и обнаружение

1. Восстановите диметил с маркировкой амино Ангиотензин II в 500 л PBS (10 мМ₂PO_4,150 мм NaCl, рН 7.4).
2. Добавьте 5 зЛ из 40 нМ NHS-S-S-biotin, растворенный в DMSO, к раствору, после 2 ч инкубации при комнатной температуре, используйте 1 кЛ 5% гидроксиламин для утоления реакции.
3. В то же время, эквилибристого стрептавидина агарозных бусинок, добавляя 500 мл PBS (10 мм₂PO₄, 150 мМ NaCl, рН 7.4), центрифугирование на 580 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и отбрасывая супернатан. Выполните равновесие 3 раза.
4. Добавьте в систему реакции 100 зЛ стрептавидин агарозные бусы, инкубацию 1 ч на роторный шейкер при комнатной температуре. Вымойте 4 раза с PBS (10 мм₂PO₄, 150 мм NaCl, рН 7,4). Для каждого шага мытья, добавить 500 л PBS в бисер, хорошо перемешать, затем центрифугу на 580 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и отказаться от супернатанта.
5. Используйте 400 мМ дитиотрийтол (DTT) для инкубации с агарозными бусинами при температуре 50 градусов по Цельсию в течение 45 минут, вращайтесь при 580 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и отбрасывайте бусы, добавляйте 20 л idoacetamide (IAM) к супернатану в течение 20 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: DTT используется для разрыва дисульфидной связи между связью биотина и пептида, последний освобождается от бисера и далее алкилируется IAM.
6. Используйте столбец обратной фазы SPE для опреснения, показанного в шаге 1.4.
7. После разрешения сухих пептидов в 20 ЗЛ 0,1% formic acid (FA), подвергните продукт каждого раздела жидкой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) анализа.
   1. Разделите модифицированные пептиды Ang II на 60 мин градиентного выращения (0-8 мин, 2% В; 8-10 мин, 5% B; 10-35 мин, 18% B; 35-50 мин, 28% B; 50-52 мин, 80% B; 52-58 мин, 80% B; 58-59 мин, 2% B; 59-60 мин, 2% B) при скорости потока 0,30 л/мин с нано-ПЛК системой, которая непосредственно взаимосвязаны с масс-спектрометром высокого разрешения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аналитическая колонка находится в 75 мкм ID, 150 мм длиной, упакованы с C-18 мизины. Мобильная фаза А состояла из 0,1% для мической кислоты, а мобильная фаза B состояла из 100% ацетонитрила и 0,1% для мической кислоты.
   2. Управляйте масс-спектрометром в режиме передачи данных, установите единый спектр полного сканирования массы (300-1800 м/з, разрешение 60 000), а затем 20 зависимых от данных MS/MS-сканирования при 28% нормализованной энергии столкновения.
   3. Откройте данные масс-спектров и определить пики продукта на каждом этапе, чтобы подтвердить химическую реакцию, успешно выполненной.

5. Количественная оценка нитропетида

1. Подготовьте 3 комплекта растворов нитро-ангиотензина II со ступени 1,4, каждый из которых содержит 2 концентрации нитро-ангиотензина II: установить #1, 20 нмоль в трубке А и 20 нмоль в трубке В, каждый в 100 йл растворе TEAB; Установите #2, 10 нмоль в трубке C и 20 нмоль в трубке D, каждый в 100 л растворе TEAB; Установите #3, 40 нмоль в трубке E и 10 нмоль в трубке F, каждый в 100 л РАСТВОР TEAB.
   Примечание: Две концентрации нитро-ангиотензина II в каждом наборе используются для маркировки диметил, чтобы реагировать с формальдегидом (легкий) и формальдегидом-D2 (тяжелый), соответственно.
2. Для каждого набора добавьте 4 злиадизм 4% формальдегида и формальдегида-D2 в образец, который будет помечен как легкий и тяжелый, соответственно. Выполните шаги 2.3 до 2.5, чтобы закончить диметиловую маркировку.
3. Смешайте легкие и тяжелые маркированные образцы.
4. Выполните шаги от 3,1 до 4,6 для сокращения, биотиниляции, обогащения и обнаружения.

Результаты

Диаграмма потока для нитропептида профилирования в этой рукописи показана на рисунке 1. Нарисунке 2, 3, 4 и 5 показаны масс-спектры Ангиотензина II, нитро-ангиотензина II, диметила с маркировкой нитро-ангиотензин II и диметил помече?...

Обсуждение

В протоколе описано обогащение нитропептида и профилирование. Используя Angiotensin II в качестве модели пептида, мы проиллюстрировали процедуру, показанную на рисунке 1. После получения нитро-ангиотензина II, первичный амин на пептид должен быть заблокирован, чтобы избежать ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acclaim pepmap 100 C18 column	Thermo-Fisher	164534
1 M TEAB solution	Sigma-Aldrich	T7408
50% hydroxylamine	Thermo-Fisher	90115
Acetonitrile	Thermo-Fisher	A955	MS Grade
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2	Toronto Research Chemicals	F691353
formic acid	Sigma-Aldrich	695076	ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo
isoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
Methanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
NHS-S-S-bition	Thermo-Fisher	21441
Oasis HLB column (10 mg)	Waters	186000383
peroxynitrite	Merck-Millipore	516620
sodium cyanoborohydrite	Sigma-Aldrich	42077	PhamaGrade
sodium dithionate	Sigma-Aldrich	157953	Technical Grade
Streptavidin Sepharose	GE Healcare	GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC	Thermo