غرس مضخة ايزوبروتيرينول الصغيرة للحث علي فشل القلب في الفئران

Summary

وقد استخدمت الاداره المزمنة لايزوبروتيرينول عن طريق مضخة الاسموزي مزروع علي نطاق واسع لتقليد فشل القلب المتقدمة في الفئران. هنا ، ونحن وصف الطرق التفصيلية في زرع المضخات الصغيرة الجراحية للاداره المستمرة ايزوبروتيرينول علي مدي 3 أسابيع ، فضلا عن تقييم تخطيط صدي لخلق نموذج ناجح.

Abstract

ايزوبروتيرينول (ISO) ، هو ناهض بيتا الكظر غير انتقائية ، والتي تستخدم علي نطاق واسع للحث علي أصابه القلب في الفئران. وفي حين يحاكي النموذج الحاد اعتلال عضله القلب المستحث بالإجهاد ، فان النموذج المزمن ، الذي يدار من خلال مضخة اوموتيك ، يحاكي فشلا قلبيا متقدما في البشر. والغرض من البروتوكول الموصوف هو إنشاء نموذج الفشل القلبي المزمن المستحث بواسطة ISO في الفئران باستخدام مضخة صغيره مزروعة. وقد استخدم هذا البروتوكول للحث علي فشل القلب في 100 + سلالات من الفئران الفطرية. يتم وصف تقنيات زرع المضخة الجراحية بالتفصيل وقد تكون ذات صله لأي شخص مهتم في خلق نموذج فشل القلب في الفئران. الاضافه إلى ذلك ، يتم عرض التغييرات الاسبوعيه أعاده تشكيل القلب علي أساس المعلمات تخطيط صدي لكل سلاله والوقت المتوقع لتطوير نموذج. وباختصار ، فان الأسلوب بسيط وقابل للتكرار. ISO المستمر تدار عن طريق مضخة صغيره مزروعة علي مدي 3 إلى 4 أسابيع كافيه للحث علي أعاده عرض القلب. وأخيرا ، يمكن تقييم نجاح إنشاء نموذج ISO في الجسم التخطيط صدي المتسلسلة مما يدل علي تضخم ، تمدد البطين ، والخلل الوظيفي.

Introduction

فشل القلب مع انخفاض إخراج كسر (HFrEF) يرافقه استجابه تعويضيه معترف بها من الجهاز العصبي الودي للحفاظ علي التوازن القلبي الوعائي¹. ولوحظ الإجهاد الدموي والآثار الضارة علي القلب والدورة الدموية مع التنشيط المزمن. وقد أصبحت هذه حجر الزاوية في العلاج الدوائي المعاصر لفشل القلب وهي أليات هامه في تطور فشل القلب والعداء العلاجي للانظمه الهرمونية العصبية¹.

تتوفر العديد من نماذج الماوس للتحقيقات الاساسيه لفشل القلب. النماذج الجينية جذابة لاستكشاف العلاجات الجزيئية والتحقيق في مسارات الإشارات. ومع ذلك ، قد لا تكون هذه النماذج ذات صله بالاشكال الشائعة لفشل القلب. وتشمل النماذج المشتركة الأخرى اليسار التنازلي الامامي (الفتي) ربط الشريان ، تضيق الوريد (تاك) ، و ايزوبروتيرينول (ISO) ، كل تهدف إلى المسببات المرضية المختلفة^{2،3،4،5 ،6}. الفتي ربط الشريان يدفع الجدار الامامي احتشاء عضله القلب التالي خلق نموذج محدد لاعتلال عضله العين الدماغية. TAC يحفز الضغط الزائد الحاد لخلق نموذج ارتفاع ضغط الدم من فشل القلب. علي الرغم من انه يمكن قياس التدرج الضغط ، مما يسمح لتقسيم الطبقات من تضخم ، والبداية الحاده لارتفاع ضغط الدم يفتقر إلى الصلة السريرية المباشرة⁴. كل من نماذج الفتي و TAC تتطلب مستوي عال من الخبرة الجراحية لتنفيذ. نموذج ISO الحاد لفشل القلب يحاكي اعتلال عضله الدم الناجم عن الإجهاد ، والمعروف أيضا باسم مرض تاكاوتوسو ، والذي يتميز بزيادة ملحوظة في الكاتيكولامينيز والنشاط في البطين الأيسر الذي يحاكي الاحتشاء القلبي الحاد^{7، 8}-الآن وفي المقابل ، فان نماذج ISO المزمنة لفشل القلب تظهر خصائص اعراض قصور القلب المتقدم ، مع مستويات مرتفعه بشكل مزمن من الكاتيكولامينيز¹. مزايا نموذج ISO المزمن هي انه يوفر التحفيز الكظر المزمن الذي يحاكي فشل القلب المتقدمة وانه من السهل نسبيا لخلق. يجب علي المحقق اختيار النموذج الذي يلخص علي أفضل وجه علم الامراض من الفائدة.

الهدف العام لهذا الأسلوب هو الحث علي فشل القلب في الفئران باستخدام مضخة صغيره مزروعة التي تطلق ISO باستمرار لتقليد التنشيط العاطفي المزمن وجدت في مرضي فشل القلب¹. الطريقة بسيطه وقابله للتكرار. علي الرغم من ان هناك اختلاف واضح بين سلالات الماوس ، ISO تدار أكثر من 3 إلى 4 أسابيع في 30 مغ/كغ/يوم كافيه للحث علي أعاده عرض القلب في معظم الفئران. علي وجه التحديد ، ISO يؤدي إلى مرحله تعويضيه الموالية لفرط التغذية خلال الأسبوع 1 تليها ترقق الجدار ، وتمدد البطين وانخفاض في وظيفة الانقباضي بحلول الأسبوع 2 و 3². ويمكن تقييم النجاح لخلق نموذج ISO في الجسم التخطيط صدي المتسلسلة مما يدل علي تضخم, تمدد, والخلل البطيني, فضلا عن الجسم السابق عن طريق التحليل النسيجي والجزيئي للانسجه القلب المقطوع لإينتراميوكارديال تراكم الدهون, التليف, الإجهاد, المبرمج, والجينات التعبير^9,10,11,12.

Protocol

هذا البروتوكول يلتزم المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانية من جامعه كاليفورنيا, لوس انجليس (ARC بروتوكول #2010-075). ينصح القراء بالتزام ببروتوكول IACUC الخاص بهم ، حيث ان العناية بالفاره وأداره تسكين قد تكون خاصه بالمؤسسة.

1. اعداد مضخة ايزوبروتيرينول الاسموزي

ملاحظه: تم تطبيق هذا الاجراء بنجاح علي الفئران الإناث البالغة من العمر 9 + الأسبوع وزنها 18 + ز من أكثر من 100 سلالات الماوس فطري ، وكذلك ، في الفئران الذكور في مجموعه فرعيه من سلالات. لا يوجد حد اقصي لوزن الجسم لهذا الاجراء. تتضمن دائما عناصر تحكم مطابقه للعمر ، حيث انه من غير المعروف ما إذا كان عمر العلاج يؤثر علي القابلية لايزوبروتيرينول الناجمة عن فشل القلب.

1. تزن وتسجل وزن الجسم لكل ماوس.
2. حساب الكمية المناسبة وتركيز ايزوبروتيرينول لكل ماوس (انظر الجدول 1 ؛ ملف تكميلي).
   ملاحظه: مضخات الاسموزي المستخدمة في هذه التجربة (جدول المواد) لديها حجم خزان 100 μl ومصممه لتسليم المخدرات بمعدلات تدفق مستمر لمده تصل إلى 28 يوما. اعداد اضافيه 20 μL من محلول ايزوبروتيرينول لكل مضخة لحساب فقدان حجم في أنبوب التعبئة اثناء تحميل مضخة.
3. تزن الكمية المناسبة من ايزوبروتيرينول (الجدول 1) باستخدام التوازن التحليلي وحلها في 120 μl من العقيمة 0.9 ٪ محلول كلوريد الصوديوم. ماصه بقوة أو دوامه لمده دقيقه واحده لأذابه تماما ايزوبروتيرينول.
   ملاحظه: اعداد مضخات اوسموتيك في خزانه السلامة البيولوجية المختبرية. وينبغي التعامل مع مضخات مع القفازات الجراحية. ينصح تقنيه معقمه في جميع انحاء اعداد مضخات الاسموزي وخلال عمليه زرع الجراحية.
4. وزن وتسجيل مضخة الاسموزي فارغه مع وسيط تدفق لها ومن ثم أزاله مدير التدفق.
5. يستنشق 120 μl من محلول ايزوبروتيرينول في حقنه 1.0 mL ونعلق 27--مقياس حاده--يميل أنبوب ملء المقدمة مع مضخات الاسموزي.
   ملاحظه: تاكد من حقنه وملء أنبوب خاليه من فقاعات الهواء.
6. اثناء الضغط علي المضخة في الوضعية المستقيمة ، ادخل أنبوب التعبئة من خلال فتحه المضخة في الأعلى حتى يقع طرف أنبوب التعبئة بالقرب من الجزء السفلي من خزان المضخة.
7. تحميل مضخة اوسموتيك عن طريق دفع المكبس حقنه ببطء حتى الحل ايزوبروتيرينول يملا ما يصل إلى افتتاح المضخة.
8. قم بازاله أنبوب التعبئة بعناية وامسح المحلول الزائد.
9. قم بإدخال مشرف التدفق لإغلاق المضخة وامسح اي حل زائد.
10. تاكد من ان أكثر من 90 ٪ من حجم الخزان قد تم ملؤها عن طريق أعاده وزنها مضخة اوسموتيك.
    ملاحظه: يتم اعداد مضخات التحكم بنفس الطريقة عن طريق ملء خزان المضخة مع محلول معقم 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم.

2. اعداد الاداات الجراحية

1. تنظيف جميع الاداات الجراحية ، بما في ذلك ألياف البصرية O-حلقه مصباح المجهر الضوء ، 2 ملقط ، حامل ابره ، المعقمات حبه الساخنة ، الخرز الزجاجي ، ومقص (جدول المواد).
2. الاداات الجراحية الاوتوكلاف في 121 درجه مئوية لمده 30 دقيقه لتعقيم الاداات قبل الجراحة.

3. ايزوبروتيرينول الاسموزي مضخة زرع الجراحية

1. الحث علي التخدير عن طريق وضع الماوس في غرفه التعريفي مع 3 ٪ ايزوفلونان في 95 ٪ O2 و 5 ٪ CO2. الحفاظ علي التخدير مع 2 ٪ ايزوفلواني عن طريق nosecone.
2. أداره 5 مغ/كغ كاربروفين s.c. إلى التوفف من الرقبة بين ريش الكتف لتسكين.
3. ضع مرهم العيون علي العينين لمنع جفاف القرنية.
4. التحقق من عمق التخدير عن طريق مراقبه معدل التنفس ، والمنعكس قرصه اصبع القدم ، ولون الغشاء المخاطي.
5. وضع الماوس في موقف ضعيف علي لوحه ساخنه. أزاله الشعر من أسفل البطن وتطهير الجلد مع بيتادين أو الكلورهسيدين.
   ملاحظه: لتقليل العدوى بعد الجراحة ، تاكد من خلو المجال الجراحي من الشعر الحادث.
6. استخدمي مقصا جراحيا لقطع شق الجلد النصفي بطول 1 سم. استخدمي مقصا غير حاد النهاية لتشريح الجلد بعناية من الجدران الصفاقيه الاساسيه.
   ملاحظه: ويفضل التسليم داخل الصفاق لاستيعاب حجم المضخة.
7. سحب الجدران البريتوني بعيدا عن الأمعاء الكامنة مع ملقط وقطع ثقب 0.8 سم في الجدران الصفاقي باستخدام مقص الجراحية غرامه.
8. ادراج مضخة اوسموتيك في التجويف البريتوني مع نهاية تدفق المشرف الأول.
9. إغلاق القبضة في الجدران الصفاقي باستخدام 5.0 الغرز القابلة للامتصاص بطريقه متقطعه. استخدم 6.0 الغرز غير القابلة للامتصاص لإغلاق الشق الجلدي بطريقه متقطعه.
10. ضع الماوس في حاضنه مخصصه للحفاظ علي الدفء والجفاف اثناء الانتعاش. تقييم الانتعاش من التخدير عن طريق مراقبه الماوس كل 30 دقيقه في الساعتين الأوليين للعودة من التنفس الطبيعي والحركة.
11. مره واحده وقد تعافي الماوس تماما من التخدير ، اعادته إلى السكن الروتيني. الاستمرار في مراقبه الحيوانية لمضاعفات يوميا تصل إلى 3 أيام وبعد ذلك كل 2 إلى 3 أيام بعد ذلك حتى نهاية التجربة.
    ملاحظه: يجب مراقبه الحيوانية لإثبات الم بعد العملية أو العدوى ، وعلامات علي فقدان الوزن ، وعدم القدرة علي الحركة ، والموقف غير طبيعي ، والفشل في العريس ، والإفراط في لعق أو العض من منطقه الشق.
12. أداره كاربروفين 5mg/kg s.c. كل 24 ح لتصل إلى 48 h وبعد ذلك حسب الحاجة.
13. أداره 0.25 ملغ/مل اموكسيسيلين في مياه الشرب لمده 5 أيام لمنع العدوى موقع الجراحية.
14. أزاله الغرز غير قابله للامتصاص بعد 7 إلى 10 أيام.

4. تقييم تخطيط صدي تحت التخدير

ملاحظه: يمكن اجراء تقييم تخطيط صدي مرارا وتكرارا لمراقبه أعاده عرض القلب التسلسلي علي مدي عده أسابيع. أجرينا قياسات تخطيط صدي علي فترات أسبوعيه علي مدي 3 أسابيع.

1. الحث علي التخدير في غرفه الحث في 1.25 ٪ إلى 1.5 ٪ من ايزوفلواني. مره واحده بشكل مناسب تخدير, تامين الماوس علي منصة تخطيط صدي مع الشريط السماح للماوس مواصله تلقي التخدير من خلال مخروط الأنف.
2. تقليل ايزوفلونان إلى جرعه الصيانة من 1% للتقليل من الآثار السلبية المتزامنة وغير الانسيابية للتخدير المفرط. تحيط علما بمعدلات التنفس والقلب في جميع انحاء الدراسة وضبط الجرعة ايزوفلواني حسب الحاجة.
3. انزعي شعر الصدر بمحلول مزيل للشعر وامسحي الصدر بدون شعر.
4. وضع هلام الموجات فوق الصوتية علي الصدر ووضع المسبار الموجات فوق الصوتية لصوره القلب.
5. في الوضع ب ، صوره البطين الأيسر (LV) في عرض المحور الطويل الparasternal. ضبط منصة تخطيط صدي لمحاذاة الصمام الابهري وقمة LV في الطائرة من شعاع الموجات فوق الصوتية.
6. أماله منصة تخطيط صدي لوضع محور LV طويلة في 90 درجه إلى شعاع الموجات فوق الصوتية وقطر LV الحد الأقصى في وسط الصورة.
7. صوره المحور القصير LV عن طريق تحويل المسبار الموجات فوق الصوتية 90 درجه.
8. في M-وضع قياس سمك الجدار LV والابعاد الداخلية.
9. ضع الماوس مره أخرى في القفص. مراقبه لعوده التنفس الطبيعي وحركات الجسم العفوية.

النتائج

في دراستنا المنشورة سابقا ، ونحن تدار جرعه ISO من 30 مغ/كغ/د أكثر من 21 يوما عن طريق مضخة الاسموزي عبر 105 الهجين الماوس لوحه التنوع (هالفيه) سلالات^2،13. قمنا بتقييم النتائج باستخدام تخطيط صدي القلب الذي اجري في خط الأساس ، الأسبوع 1 و 2 و 3 من العلاج ISO (الش?...

Discussion

لقد قمنا بتطبيق هذه الطريقة علي أكثر من 100 سلاله من الفئران الفطرية لتقييم النتائج القلبية بسبب التحفيز المزمن بيتا-ادريرجيك^2،13. ومن المعروف ان الاختلافات الكبيرة في القابلية لايزوبروتيرينول موجودة بين سلالات الماوس ويمكن تخصيصها لسلاله من الفائدة حسب ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place	Alzet	Model 1004	Includes filling tube, flow moderator and pump body
(-)-Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	16504-1G	(-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20°C.
1 ml sterile syringe	VWR	BD309602
30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator	AmScope	SKU: LED-30WR
5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture	Ethicon	J303H	5-0, absorbable
Fine Scissors - Sharp	FST	14060-09
Glass beads	FST	18000-46
Hot bead sterilizers	FST	18000-50
Iris forceps	WPI	15915
Look Sharpoint 6-0, 18" Black Nylon Monofilament Suture	LOOK	AA-2176	6-0, non-absorbable
Needle holder	WPI	15926
Normal Saline, 0.9% NaCl	Fisher	89167-772