Implantación de una minibomba de isoproterenol para inducir insuficiencia cardíaca en ratones

Resumen

La administración crónica de isoproterenol a través de una bomba osmótica implantada se ha utilizado ampliamente para imitar la insuficiencia cardíaca avanzada en ratones. Aquí, describimos métodos detallados en la implantación quirúrgica de minibombas para la administración continua de isoproterenol durante 3 semanas, así como, evaluación ecocardiográfica para la creación exitosa del modelo.

Resumen

El isoproterenol (ISO), es un agonista beta-adrenérgico no selectivo, que se utiliza ampliamente para inducir lesiones cardíacas en ratones. Mientras que el modelo agudo imita la cardiomiopatía inducida por el estrés, el modelo crónico, administrado a través de una bomba osmótica, imita la insuficiencia cardíaca avanzada en los seres humanos. El propósito del protocolo descrito es crear el modelo de insuficiencia cardíaca crónica inducida por ISO en ratones utilizando una minibomba implantada. Este protocolo se ha utilizado para inducir insuficiencia cardíaca en más de 100 cepas de ratones endogámicos. Las técnicas sobre la implantación de bombas quirúrgicas se describen en detalle y pueden ser relevantes para cualquier persona interesada en crear un modelo de insuficiencia cardíaca en ratones. Además, se presentan los cambios semanales de remodelación cardíaca basados en parámetros ecocardiográficos para cada cepa y el tiempo esperado para el desarrollo del modelo. En resumen, el método es simple y reproducible. La ISO continua administrada a través de la minibomba implantada durante 3 a 4 semanas es suficiente para inducir la remodelación cardíaca. Por último, el éxito para la creación del modelo ISO puede evaluarse in vivo mediante ecocardiografía en serie que demuestra hipertrofia, dilatación ventricular y disfunción.

Introducción

La insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (HFrEF) va acompañada de una respuesta compensatoria bien reconocida del sistema nervioso simpático para mantener la homeostasis cardiovascular¹. Estrés hemodinámico y efectos nocivos en el corazón y la circulación se observaron con activación crónica. Estos se han convertido en la piedra angular de la farmacoterapia contemporánea para la insuficiencia cardíaca y son mecanismos importantes en la progresión de la insuficiencia cardíaca y el antagonismo terapéutico de los sistemas neurohormonales¹.

Hay varios modelos de ratón disponibles para investigaciones básicas de insuficiencia cardíaca. Los modelos genéticos son atractivos para explorar terapias moleculares e investigar las vías de señalización. Sin embargo, estos modelos pueden no ser relevantes para las formas comunes de insuficiencia cardíaca. Otros modelos comunes incluyen ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (LAD), constricción transaortica (TAC) e isoproterenol (ISO), cada uno apuntando a una etiología patológica diferente^{2,3,4,5 ,6}. La ligadura de la arteria LAD induce un infarto de miocardio de pared anterior creando así un modelo específico para la cardiomiopatía isquémica. TAC induce sobrecarga de presión aguda para crear un modelo hipertensivo de insuficiencia cardíaca. Aunque se puede medir el gradiente de presión, lo que permite la estratificación de la hipertrofia, la aparición aguda de la hipertensión carece de relevancia clínica directa⁴. Los modelos LAD y TAC requieren un alto nivel de experiencia quirúrgica para ejecutarse. El modelo ISO agudo de insuficiencia cardíaca imita la cardiomiopatía inducida por el estrés, también conocida como enfermedad de Takotsubo, que se caracteriza por un marcado aumento de las catecolaminas y la actividad en el ventrículo izquierdo que imita el infarto agudo de miocardio^{7, 8}. Por el contrario, los modelos ISO crónicos de insuficiencia cardíaca presentan síntomas características de insuficiencia cardíaca avanzada, con niveles crónicamente elevados de catecolaminas¹. Las ventajas del modelo ISO crónico son que proporciona estimulación adrenérgica crónica que imita la insuficiencia cardíaca avanzada y que es relativamente fácil de crear. El investigador debe elegir un modelo que recapitule mejor su patología de interés.

El objetivo general de este método es inducir la insuficiencia cardíaca en ratones utilizando una mini bomba implantada que libera ISO continuamente para imitar la activación simpática crónica que se encuentra en pacientes con insuficiencia cardíaca¹. El método es simple y reproducible. Aunque hay una clara variación entre las cepas de ratón, ISO administrado durante 3 a 4 semanas a 30 mg/kg/día es suficiente para inducir la remodelación cardíaca en la mayoría de los ratones. Específicamente, ISO conduce a una fase compensatoria pro-hipertrófica durante la semana 1 seguida de adelgazamiento de la pared, dilatación ventricular y disminución de la función sistólica para la semana 2 y 3^2. El éxito para la creación del modelo ISO puede evaluarse in vivo mediante ecocardiografía en serie que demuestra hipertrofia, dilatación y disfunción ventricular, así como ex vivo a través de la evaluación histológica y molecular del tejido cardíaco cosechado para intramiocardio acumulación de lípidos, fibrosis, estrés urgencial, apoptosis y expresión génica^9,10,11,12.

Protocolo

Este protocolo se adhiere a las directrices de cuidado animal de la Universidad de California, Los Angeles (protocolo ARC #2010-075). Se aconseja a los lectores que se adhieran a su propio protocolo aprobado por la IACUC, ya que el cuidado del ratón periprocedimiento y la gestión de la analgesia pueden ser específicos de la institución.

1. Preparación de la bomba osmótica isoproterenol

NOTA: Este procedimiento se ha aplicado con éxito en ratones hembra de más de 9 semanas que pesan 18+ g de más de 100 cepas de ratón endogámicas, así como, en ratones macho en un subconjunto de cepas. No hay límite máximo de peso corporal para este procedimiento. Incluya siempre controles coincidentes con la edad, ya que se desconoce si la edad del tratamiento afecta la susceptibilidad inducida por isoproterenol al desarrollo de insuficiencia cardíaca.

1. Pesar y registrar el peso corporal de cada ratón.
2. Calcular la cantidad y concentración adecuadas de isoproterenol para cada ratón (Ver Tabla 1 ; Archivo Suplementario).
   NOTA: Las bombas osmóticas utilizadas en este experimento(Tabla de Materiales)tienen un volumen de depósito de 100 l y están diseñadas para suministrar medicamentos a caudales continuos durante un máximo de 28 días. Prepare una solución adicional de 20 ml de isoproterenol por bomba para tener en cuenta la pérdida de volumen en el tubo de llenado durante la carga de la bomba.
3. Pesar la cantidad adecuada de isoproterenol(Tabla 1) utilizando una balanza analítica y disolverla en 120 sL de solución estéril de NaCl al 0,9%. Pipetear vigorosamente o vórtice durante 1 min para solubilizar completamente isoproterenol.
   NOTA: Prepare las bombas osmóticas en un gabinete de bioseguridad de laboratorio. Las bombas deben manipularse con guantes quirúrgicos. Se recomienda una técnica estéril durante la preparación de las bombas osmóticas y durante el procedimiento de implantación quirúrgica.
4. Pesar y grabar la bomba osmótica vacía junto con su moderador de flujo y luego eliminar el moderador de flujo.
5. Aspirar 120 l de solución de isoproterenol en una jeringa de 1,0 ml y conecte el tubo de llenado de punta contundente de calibre 27 suministrado con las bombas osmóticas.
   NOTA: Asegúrese de que la jeringa y el tubo de llenado estén libres de burbujas de aire.
6. Mientras sostiene la bomba en posición vertical, inserte el tubo de llenado a través de la abertura de la bomba en la parte superior hasta que la punta del tubo de llenado se sifique cerca de la parte inferior del depósito de la bomba.
7. Cargue la bomba osmótica empujando el émbolo de la jeringa lentamente hasta que la solución de isoproterenol se llene hasta la abertura de la bomba.
8. Retire cuidadosamente el tubo de llenado y limpie el exceso de solución.
9. Inserte de nuevo el moderador de flujo para cerrar la bomba y limpiar cualquier exceso de solución.
10. Confirme que más del 90% del volumen del depósito se ha llenado repesando la bomba osmótica.
    NOTA: Las bombas de control se preparan de la misma manera llenando el depósito de la bomba con una solución estéril de NaCl al 0,9%.

2. Preparación de instrumentos quirúrgicos

1. Limpie todos los instrumentos quirúrgicos, incluyendo el iluminador de microscopio de luz de anillo tórtuo de fibra óptica, 2 fórceps, soporte de aguja, esterilizadores de cuentas calientes, cuentas de vidrio y tijeras (Tabla de materiales).
2. Instrumentos quirúrgicos de autoclave a 121oC durante 30 min para esterilizar instrumentos antes de la cirugía.

3. Implantación quirúrgica de bomba osmótica isoproterenol

1. Inducir la anestesia colocando el ratón en una cámara de inducción con 3% de isoflurano en 95% de O2 y 5% de CO2. Mantener la anestesia con 2% de isoflurano a través de un nosecone.
2. Administrar 5 mg/kg de carprofeno s.c. al cuello entre los omóplatos para la analgesia.
3. Coloque pomada oftálmica en los ojos para prevenir la deshidratación corneal.
4. Compruebe la profundidad de la anestesia monitoreando la tasa de respiración, el reflejo de pellizcar de los dedos de los dedos y el color de la membrana mucosa.
5. Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla calentada. Retire el vello de la parte inferior del abdomen y desinfecte la piel con betadina o clorhexidina.
   NOTA: Para minimizar la infección postoperatoria, asegúrese de que el campo quirúrgico esté libre de cabello incidente.
6. Use un par de tijeras quirúrgicas para cortar una incisión de la piel de línea media de 1 cm de largo. Usa un par de tijeras contundentes para diseccionar cuidadosamente la piel de las paredes peritoneales subyacentes.
   NOTA: Se prefiere una entrega intraperitoneal para acomodar el tamaño de la bomba.
7. Tire de las paredes peritoneales lejos del intestino subyacente con fórceps y corte un agujero de 0,8 cm en las paredes peritoneales usando tijeras quirúrgicas finas.
8. Inserte la bomba osmótica en la cavidad peritoneal con el extremo del moderador de flujo primero.
9. Cierre la bodega en las paredes peritoneales usando 5.0 suturas absorbibles de manera interrumpida. Utilice suturas 6.0 no absorbibles para cerrar la incisión cutánea de forma interrumpida.
10. Coloque el ratón en una incubadora dedicada para mantenerlo caliente y seco durante la recuperación. Evaluar la recuperación de la anestesia mediante el monitoreo del ratón cada 30 minutos en las primeras dos horas para el retorno de la respiración y el movimiento normal.
11. Una vez que el ratón se haya recuperado completamente de la anestesia, devuélvalo a la vivienda de rutina. Continúe monitoreando al animal en busca de complicaciones diarias hasta 3 días y luego cada 2 a 3 días después hasta el final del experimento.
    NOTA: Los animales deben ser monitoreados en busca de evidencia de dolor o infección postoperatorio, signos de pérdida de peso, falta de movilidad, postura anormal, falta de aseo y lamer o morder excesivamente el área de la incisión.
12. Administrar carprofeno 5mg/kg s.c. cada 24 h durante un máximo de 48 h y posteriormente según sea necesario.
13. Administrar 0,25 mg/ml de amoxicilina en agua potable durante 5 días para prevenir infecciones en el sitio quirúrgico.
14. Retire las suturas no absorbibles después de 7 a 10 días.

4. Evaluación ecocardiográfica bajo anestesia

NOTA: La evaluación ecocardiográfica se puede realizar repetidamente para controlar la remodelación cardíaca en serie durante varias semanas. Realizamos mediciones ecocardiográficas a intervalos semanales durante 3 semanas.

1. Inducir la anestesia en una cámara de inducción al 1,25% a 1,5% del isoflurano. Una vez que esté adecuadamente sedado, fije el ratón sobre la plataforma de ecocardiografía con cinta adhesiva que permite al ratón continuar recibiendo anestesia a través de un cono nasal.
2. Disminuir el isoflurano a una dosis de mantenimiento de 1% para minimizar los efectos cronotrópicos e inotrópicos negativos de la sobresedación. Tome nota de las frecuencias respiratorias y cardíacas a lo largo del estudio y ajustar la dosis de isoflurano según sea necesario.
3. Retire el pelo del pecho con una loción depilatoria y limpie el pecho libre de pelo.
4. Coloque el gel de ultrasonido en el pecho y coloque la sonda de ultrasonido para obtener una imagen del corazón.
5. En el modo B, idee el ventrículo izquierdo (LV) en la vista parasternal del eje largo. Ajuste la plataforma de ecocardiografía para alinear la válvula aórtica y el ápice LV en el plano del haz de ultrasonido.
6. Incline la plataforma de ecocardiografía para colocar el eje largo LV a 90 grados al haz de ultrasonido y el diámetro máximo del LV en el centro de la imagen.
7. Imagen del eje corto LV girando la sonda de ultrasonido 90 grados.
8. En modo M, mida el espesor de la pared LV y las dimensiones internas.
9. Vuelva a colocar el ratón en la jaula. Monitor para el retorno de la respiración normal y movimientos espontáneos del cuerpo.

Resultados

En nuestro estudio publicado anteriormente, administramos una dosis ISO de 30 mg/kg/d durante 21 días a través de la bomba osmótica a través de 105 cepas del Panel híbrido de diversidad de ratones (HMDP)^2,13. Evaluamos los resultados utilizando ecocardiograma realizado al inicio, semana 1, 2 y 3 del tratamiento ISO(Figura 1). Al igual que un estudio previo donde los autores estudiaron el impacto del isoproterenol entre 23 cepas ...

Discusión

Hemos aplicado este método a más de 100 cepas de ratones endogámicos para evaluar los resultados cardíacos debido a la estimulación beta-adrenérica crónica^2,13. Se sabe que existen diferencias significativas en la susceptibilidad al isoproterenol entre las cepas de ratón y pueden personalizarse para la cepa de interés según sea necesario¹⁶. Esto puede deberse a la variación en la función del receptor beta-adrenérgico entre las...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place	Alzet	Model 1004	Includes filling tube, flow moderator and pump body
(-)-Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	16504-1G	(-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20°C.
1 ml sterile syringe	VWR	BD309602
30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator	AmScope	SKU: LED-30WR
5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture	Ethicon	J303H	5-0, absorbable
Fine Scissors - Sharp	FST	14060-09
Glass beads	FST	18000-46
Hot bead sterilizers	FST	18000-50
Iris forceps	WPI	15915
Look Sharpoint 6-0, 18" Black Nylon Monofilament Suture	LOOK	AA-2176	6-0, non-absorbable
Needle holder	WPI	15926
Normal Saline, 0.9% NaCl	Fisher	89167-772