JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم سير عمل متكامل لتحديد السمات الظاهرية والجزيئية التي تميز الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs). نحن الجمع بين المناعية الحية والروبوتية الجزئية من CTCs واحده ومجمعه مع التقنيات القائمة علي خليه واحده للتحليل المصب وتقييم القدرة الانبثاث البذر.

Abstract

حسابات الانبثاث المنقولة بالدم لمعظم الوفاات المرتبطة بالسرطان وينطوي علي تعميم الخلايا السرطانية (CTCs) التي تنجح في إنشاء أورام جديده في مواقع بعيده. يتم العثور علي CTCs في مجري الدم من المرضي كخلايا واحده (CTCs واحد) أو كمجاميع متعددة الخلية (التجمعات CTC وخلايا الدم البيضاء CTC) ، مع الاخيره عرض قدره اعلي المنتشر. والي جانب التعداد ، فان التحليل الظاهري والجزيئي مهم للغاية لتشريح بيولوجيا لجنه مكافحه الإرهاب ولتحديد أوجه الضعف القابلة للتنفيذ. هنا ، ونحن نقدم وصفا مفصلا لسير العمل الذي يتضمن المناعية CTC والجزئيات ، والثقافة الحية السابقة لتقييم قدرات التكاثر والبقاء علي قيد الحياة من الخلايا الفردية ، وفي الجسم الحية الانبثاث-اختبارات تشكيل. الاضافه إلى ذلك ، نقدم بروتوكولا لتحقيق تفكك مجموعات لجنه مكافحه الإرهاب في الخلايا الفردية والتحقيق في التجانس داخل المجموعات. ومن خلال هذه النهج ، علي سبيل المثال ، نقوم بتحديد كميات البقاء والقدرة التكاثرية لوحدات التحويلات الاحاديه والخلايا الفردية داخل مجموعات لجنه مكافحه الإرهاب ، مما يؤدي بنا إلى ملاحظه ان الخلايا داخل التكتلات تعرض البقاء والانتشار بشكل أفضل في ex الثقافات المجرية مقارنه مع ctcs واحد. وعموما ، يوفر سير العمل لدينا منصة لتشريح خصائص CTCs علي مستوي الخلية الواحدة ، والتي تهدف إلى تحديد مسارات ذات الصلة الانبثاث وفهم أفضل لعلم الاحياء CTC.

Introduction

المظهر السريري من الانبثاث في الاجهزه البعيدة يمثل المرحلة النهائية من تطور السرطان وتمثل أكثر من 90 ٪ من الوفاات المرتبطة بالسرطان1. الانتقال من الموضعية إلى المرض المنتشر هو عمليه متعددة الخطوات ، وغالبا ما توسط من خلال تعميم الخلايا السرطانية (ctcs)2،3،4. يتم إلقاء هذه الخلايا من الورم الأساسي في الدورة الدموية ويتم نقلها إلى الأعضاء البعيدة ، حيث قد اكسترافاساتي وإنشاء آلافات المنتشرة5،6. علي الرغم من ان الأورام الصلبة يمكن ان تطلق عددا كبيرا نسبيا من CTCs ، فان معظم CTCs مقدر لها ان تموت ، وذلك بسبب قوي القص العالية في الدورة الدموية ، وموت الخلايا بوساطة الدهن ، والهجوم المناعي أو القدرات المحدودة للتكيف مع البيئة الخارجية7 ولذلك ، فانه من الاهميه بمكان لإنشاء الاداات التي تمكن من تشريح السمات الجزيئية لتلك CTCs التي هبت مع القدرة الانبثاث البذر. وتشير الدراسات السريرية والسريرية الاخيره إلى ان وجود وكميه من التكتلات ctcs واحد ومكافحه الإرهاب يرتبط بنتيجة اسوا في المرضي الذين يعانون من أنواع مختلفه من الأورام الصلبة8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14 . مجموعات CTC هي مجموعات من اثنين أو أكثر من ctcs تعلق علي بعضها البعض اثناء الدورة الدموية وأكثر كفاءه في تشكيل الانبثاث بالمقارنة مع ctcs واحده3،15،16. الخلايا داخل كتله الحفاظ علي التصاق خليه خليه قويه من خلال ديموسيميس والتقاطعات ملتصقة ، والتي قد تساعد علي التغلب علي anoikis17،18. في الاونه الاخيره ، لاحظنا ان تجميع CTCs يرتبط بنقص ميثيل المواقع الملزمة لعوامل النسخ المرتبطة بالتكاثر والانتشار ، مما يؤدي إلى زيادة القدرة علي البدء بنجاح الورم الخبيث19. نتائج التفكك العنقودية CTC في أعاده عرض مواقع الربط الرئيسية ، التالي ، وقمع المحتملة المنتشرة19. بالاضافه إلى مجموعات من الخلايا السرطانية ، CTCs يمكن ان تقترن أيضا إلى خلايا الدم البيضاء (العدلات في معظم الأحيان) للحفاظ علي مستويات الانتشار العالية في الدورة الدموية وزيادة قدرتها المنتشرة20. ومع ذلك ، لا يفهم بيولوجيا CTCs الا جزئيا وتبقي عده اسئله مفتوحة ، بما في ذلك السمات الجزيئية الاساسيه ونقاط الضعف في الخلايا المفردة والمجمعة.

في السنوات الاخيره ، تم وضع العديد من الاستراتيجيات التي تستغل أنماط التعبير علي سطح الخلية وكذلك الخواص الفيزيائية لهذه التحويلات لعزلها21، 22،23،24، 25. مستضد تعتمد أساليب العزل في الغالب علي التعبير عن سطح الخلية الظهاريه خليه التصاق جزيء (epcam)26. الأكثر استخداما و (في الوقت الحاضر) الوحيد الذي وافقت عليه هيئه الاغذيه والعقاقير لتعداد لجنه مكافحه الإرهاب ، هو نظام CellSearch ، والذي يستند إلى اجراء من خطوتين لعزل CTCs21. في الخطوة الاولي ، يتم أزاله مكونات البلازما بواسطة طرد ، في حين يتم التقاط CTCs مع السوائل الحديدية المغناطيسية إلى جانب الأجسام المضادة لمكافحه EpCAM. في الخطوة الثانية ، يتم تلطيخ المحلول المخصب من قبل لجنه مكافحه الإرهاب للخلايا الموجبة (dapi) التي تعبر عن الكيراتين الخلوي (CK)8،18،19، في حين يتم تحديد خلايا الدم البيضاء باستخدام عموم الكريات البيضاء علامة CD45. وأخيرا ، يتم وضع الخلايا الملتقطة علي منصة فحص متكاملة ويتم تحديد CTCs من خلال التعبير عن EpCAM و CKs و DAPI بينما تكون سالبه ل CD45. علي الرغم من ان هذا يعتبر معيار الذهب لتعداد لجنه مكافحه الإرهاب, التحليل الجزيئي المصب تحديا مع هذه التكنولوجيا بسبب القيود المتاصله في استعاده لجنه مكافحه الإرهاب. بالاضافه إلى ذلك ، نظرا لاجراء العزلة ، cellsearch قد صالح إثراء ctcs مع مستويات epcam اعلي مقارنه ctcs مع التعبير epcam اقل ، بسبب علي سبيل المثال إلى السرطان تغاير27 أو دوونريجوليشن من علامات الظهاريه 28و29. وللتغلب علي هذه القيود ، برزت تكنولوجيات مستقله لإثراء هذه التحويلات. فعلي سبيل المثال ، تدمج لجنه مكافحه الإرهاب الفصل الهيدروديناميكي للخلايا النواة ، بما في ذلك CTCs والكريات الكربون الجوفية من مكونات الدم المتبقية ، تليها نضوب المناعية المغناطيسية من الأجسام المضادة للأجسام الموسومة ، مما يسمح تنقيه CTCs غير الموسومة وقابله للحياة في الحل25. بالاضافه إلى ذلك ، حقيقة ان معظم ctcs هي أكبر قليلا من خلايا الدم الحمراء (rbcs) أو الكريات الحمر أدت إلى تطوير تكنولوجيات التخصيب علي أساس الحجم CTC23،30 (علي سبيل المثال ، نظام parsortix (زاوية)) الذي يجعل استخدام التكنولوجيا القائمة علي microfluidic ، والتي تتالف من قناه تضييق عبر كاسيت الفصل ، والخلايا الرائدة إلى فجوه طرفيه من اما 10 ، 8 ، 6.5 أو 4.5 μm (احجام مختلفه متاحه تبعا لقطر المتوقع من الخلايا السرطانية المستهدفة). معظم خلايا الدم تمر من خلال الفجوة الضيقة ، في حين الحصول علي المحاصرين CTCs بسبب حجمها (ولكن أيضا بسبب انخفاض الخلايا) ، التالي ، يتم الاحتفاظ بها في الكاسيت. العودة إلى اتجاه التدفق يتيح الإفراج عن CTCs الملتقطة ، والتي هي في حاله قابله للحياة ومناسبه للتحليل المصب. وبمعزل عن البروتوكول الذي تم اختياره لعزل لجنه مكافحه الإرهاب ، فان الإجراءات النموذجية لما بعد التخصيب لا تزال تسفر عن عمليات CTCs مختلطة مع عدد صغير نسبيا من RBCs و bcs ، مما يجعل تحليل CTCs النقية واحده أو السائبة صعبه. ولمعالجه هذه المسالة ، انشانا سير عمل يسمح بالتلاعب باللجنة دون تحيز محتمل أدخلته ملوثات خلايا الدم. أضافه المناعي مسبقا ، مع مجموعات الأجسام المضادة المتغيرة ، ويميز CTCs من خلايا الدم ، وحتى يسمح لتحديد المجموعات الفرعية CTC مع ملامح التعبير السطحية مميزه متميزة. هذا الاجراء قابل للتخصيص للغاية يمكن بعد ذلك الجمع بين التطبيقات النهائية المحددة.

هنا ، ونحن وصف سير العمل الذي يبدا من المنتجات المخصبة CTC (الحصول عليها مع اي تكنولوجيا التخصيب CTC من الاختيار) ويجمع بين العديد من النهج للحصول علي نظره ثاقبه في علم الاحياء CTC في دقه خليه واحده. وباختصار ، فان سير العمل لدينا يتيح تحديد ctcs واحده ، وتجمعات ctc ومجموعات ctc-مكافحه الحرائق عن طريق المناعة الحية ، تليها الجزئي خليه واحده والتحليل المصب باستخدام بروتوكولات السابقة المجرية زراعه ، خليه واحده التسلسل ، وفي اختبارات الانبثاث الجسم الحيوي.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات المتعلقة بعينات الدم من المرضي بناء علي موافقه مستنيرة موقعه من المشاركين. وأجريت الإجراءات وفقا للبروتوكولين EKNZ BASEC 2016-00067 و EK 321/10 ، التي وافق عليها مجلس المراجعة الاخلاقيه والمؤسسية (لجنه الأخلاقيات شمال غرب/وسط سويسرا [EKNZ]) ، وامتثالا لإعلان هلسنكي.

وقد أجريت جميع الإجراءات المتعلقة بالماشية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والكانتونات (التي وافق عليها بروتوكول الفاره #2781 ، مكتب الطب البيطري الكانتونيه في مدينه بازل).

1. اعداد عينه المريض

  1. قبل البدء ، وضمان العمل مع العقيم الحلول والمواد للحفاظ علي العقم خلال الاجراء بأكمله.
  2. سحب 7.5 مل من الدم المحيطي من مريض سرطان الثدي في أنبوب جمع الدم أدتا 10 مل.
  3. احتضان الأنابيب المحتوية علي الدم لفتره زمنيه قصيرة (حتى 1 ساعة) في درجه حرارة الغرفة (RT) علي شاكر هزاز في 40 التذبذب في الدقيقة الواحدة (osc/min).
  4. إثراء لوحدات ctcs واحده ومجموعات ctc باستخدام طريقه عزل ctc من الاختيار21،22،23،25. الإفراج عن CTCs في حل DPBS 1x.
    ملاحظه: قد تكون خلايا الدم البيضاء المتبقية وخلايا الدم الحمراء موجودة ، وذلك حسب التكنولوجيا المختارة لإثراء اللجنة. ضبط ضغط الإفراج من أجل الحفاظ علي هياكل الكتلة CTC.
  5. انتقل فورا إلى الخطوة التالية في القسم 3.

2. اعداد عينه الماوس

  1. قبل البدء ، واعداد حقنه الانسولين 1 مل مع ابره 25G ، 5 مم أدتا تصفيه الحل ، وأنابيب جمع الدم 2 مل أدتا.
  2. ضمان العمل مع المحاليل والمواد العقيمة للحفاظ علي العقم اثناء العملية بأكملها.
  3. قبل غسل الحقنه مع 5 مم الحل أدتا.
  4. تحميل حقنه مع 100 μL من 5 مم أدتا وأزاله فقاعات.
  5. موت ببطء الماوس باستخدام 80 ٪ CO2 /20 ٪ O2 استنشاق الغاز والمضي قدما علي الفور إلى الخطوة التالية.
    ملاحظه: بديل لطريقه استنشاق CO2 هو التخدير الايزوفلواني (3 المجلد ٪ ايزوفلونان والأكسجين (الناقل الغاز) في معدل تدفق 600 مل/دقيقه) تليها خلع عنق الرحم ، أو حقن الجرعات الزائدة من محلول الكيتامين/اكسيليازين. قد تختلف طريقه القتل الرحيم معينه اعتمادا علي بروتوكول الماوس المعتمدة.
  6. تاكيد وفاه الحيوانية بسبب عدم وجود نشاط التنفس ، وفقدان منعكس القرنية ، والتبول دون المحفزات الخارجية.
  7. قم باجراء ثقب في القلب عن طريق إدخال ابره الحقنه المحملة مسبقا بشكل دقيق بزاوية 30 درجه في الصدر من القص نحو القلب.
    ملاحظه: بالنسبة للتجربة عديمي الخبرة ، فمن المستحسن لفتح تجويف الصدر أولا ، قبل اجراء ثقب القلب ، لتصور أفضل للقلب.
  8. استرداد ما يصل إلى 1 مل من الدم. دون الإفراج عن الغطاس, سحب حقنه من الصدر الحيوانية, أزاله الابره بأمان, فتح غطاء أنبوب جمع الدم 2 مل أدتا والاستغناء عن الدم مباشره داخل. إغلاق الغطاء وعكس الأنبوب 10x.
  9. احتضان الأنابيب المحتوية علي الدم لفتره زمنيه قصيرة (تصل إلى 1 ساعة) في RT علي شاكر هزاز في 40 osc/min.
    تحذير: يجب التخلص من الابره في التخلص من المخاطر البيولوجية الامنه بشكل حاد.
    ملاحظه: الثقوب المتعددة ممكنة لزيادة حجم الدم الكلي. استخدام المحاقن منفصلة محمله مسبقا مع أدتا لسحب مختلفه لتجنب شفط الدم المتخدر الموجودة في الابره السابقة.
  10. إثراء لوحدات ctcs واحده والتجمعات CTC باستخدام طريقه عزل ctcs من الاختيار21،22،23،25. الإفراج عن CTCs في حل DPBS 1x.
    ملاحظه: اعتمادا علي التكنولوجيا المختارة لإثراء اللجنة ، قد تكون خلايا الدم البيضاء المتبقية وخلايا الدم الحمراء موجودة. ضبط ضغط الإفراج من أجل الحفاظ علي هياكل الكتلة CTC.
  11. انتقل فورا إلى الخطوة التالية في القسم 3.
    ملاحظه: بالنسبة لجميع الإجراءات التالية ، تاكد من استخدام الدم غير الثابت والمعزول حديثا.

3. CTCs يعيش المناعي

  1. الطاردة المركزية لجنه مكافحه الإرهاب المخصب خليه التعليق في 72 x g ل 4 دقيقه.
    ملاحظه: 72 x g يتوافق مع 800 دوره في الدقيقة إذا كان الدوار قطرها 100 ملم. تحويل رقم القوه وفقا للدوح.
  2. أعاده التعليق برفق بيليه في محلول 1 ٪ جيش صرب الجمهورية في 1x DPBS وأضافه 2 ميكروغرام/مل من المضادة للإنسان AF488 الجسم الأضداد و 1 ميكروغرام/مل من المضادة للإنسان CD45-BV605 الأضداد أو 2 ميكروغرام/مل المضادة للماوس CD45-BV605 الأضداد في حجم إجمالي 500 μL.
    ملاحظه: لسرطان الثدي CTCs المستمدة من المريض ، ومكافحه الإنسان EGFR-FITC ، ومكافحه الإنسان HER2-AF488 يمكن أضافه بالاضافه إلى ذلك إلى مكافحه EpCAM والمضادة لCD45. وهذا يسمح لتحديد أفضل CTCs التي تعبر عن مستويات EpCAM اقل.
  3. احتضان لمده 30 دقيقه في RT وحماية من الضوء.
  4. غسل CTCs التعليق باستخدام 1 مل من الجيش الصربي البوسني 1 ٪ في محلول DPBS 1x و طرد في 72 x g ل 4 دقيقه. كرر هذا الغسيل مرتين.
  5. أعاده تعليق الخلايا الملونة في 2 مل من 1 ٪ من الجيش الصربي البوسني في محلول DPBS 1x ونقل الحجم الكلي في 1 بئر من 6 ابار لوحه المرفقات منخفضه جدا.
  6. احتضان لوحه لمده 10-15 دقيقه في 4 درجه مئوية محمية من الضوء للسماح الترسيب من CTCs وخلايا الدم المتبقية.

4. الجزئي من CTCs وانتقاء خليه واحده

ملاحظه: قبل البدء ، يجب ان تدرك ان التفصيلية يتطلب ما يصل إلى 45 دقيقه لاعداد كامله. وبمجرد الاعداد ، يتطلب الاجراء الخاص بتحديد الهوية والضبط الجزئي لل CTC ما يصل إلى دقيقتين لكل خليه (أو مجموعه).

  1. تاكد من إنهاء الاجراء الانتقاء CTC في غضون 2 h من نهاية تلطيخ.
  2. بدء تشغيل البرامج التفصيلية والتبديل علي الجزئي. قم بتوصيل الجهاز الجزئي بالكمبيوتر وتهيئه الذراع الروبوتية وكذلك مرحله المجهر عن طريق الضغط علي زر الاتصال متبوعا بجهاز Int.
  3. إغلاق مجلس الوزراء حماية بعد كل التلاعب في الجهاز لتكون قادره علي المناورة من خلال الكمبيوتر.
  4. نظف الأسطح من الاتربه والانسكابات عن طريق رش الايثانول ومسح الأسطح الداخلية لمجلس الوزراء. فالبيئة النظيفة ستضمن عقم العملية.
  5. تثبيت الشعرية الزجاجية الجديدة علي الذراع الروبوتية. لانتقاء خليه واحده ، استخدم 20-30 μm الشعرية بينما 30-50 μm الأفضل لانتقاء الكتلة CTC.
  6. أزاله جميع الفقاعات الموجودة في الأنابيب عن طريق الاستغناء أو شفط زيت النظام.
    تحذير: الشعرية الزجاجية حاده وهشه. التعامل مع الحذر.
  7. ملء خزان التعقيم 1 مع 70 ٪ الايثانول ، وخزان التعقيم 2 مع العقيمة النيوداز خاليه H2O وخزان العازلة مع 1X dpbs معقمه.
    تحذير: لا تغلق أغطيه الخزانات ، لأنه خلال الخطوات التالية سوف تحتاج إلى الشعرية بحريه الوصول إلى الدبابات.
  8. تعقيم الشعرية مرتين مع 70 ٪ الايثانول.
  9. استبدال خزان التعقيم 1 مع خزان 2 وغسل الشعرية في H2O علي الأقل ثلاث مرات باستخدام وظيفة التعقيم.
  10. باستخدام برنامج التشغيل الجزئي ، أبدا تجربه جديده واختر نوع تجربه الانتقاء بين أوضاع الاختيار التلقائي واليدوي.
    ملاحظه: اختر نوع التجربة استنادا إلى نقطه نهاية المعالجة. الوضع اليدوي يتيح المناورة من الذراع الروبوتية بعد الشعرية يدخل تعليق الخلية. هذه الخطوة ضرورية لتفكك مجموعات CTC إلى خلايا فرديه. من الممكن تغيير نوع الانتقاء اثناء التجربة.
  11. تكوين صينية سطح السفينة تحديد موضع خزان التعقيم (السائل 1) ، خزان العازلة (السائل 2) وعلبه الإيداع (الهدف 1 أو 2). الهدف 1 يسمح للإيداع في لوحات ، والهدف 2 يسمح للإيداع في أنابيب PCR أو لوحات PCR.
  12. تعيين درجه حرارة الخزانات السائلة وعلبه الإيداع المختارة إلى 4 درجه مئوية.
    ملاحظه: يمكن ان تستغرق عمليه الانتقاء وقتا طويلا. ولذلك ينصح تبريد الخزانات السائلة وعلبه الإيداع
  13. ضع اللوحة المرفقة فائقه الانخفاض التي تحتوي علي محلول CTCs الذي تم إصداره تحت المجهر داخل الخزانة الجزئية. أزاله الغطاء من لوحه وإغلاق مجلس الوزراء. احتفظ باللوحة في RT لبقية الاعداد واثناء اجراء الانتقاء.
  14. حدد يدويا هدف المجهر للانتقاء (10-20x) ووقت التعرض لجميع القناات اللازمة (برايفيلد ، FITC ، وقناات TRITC).
  15. حدد إظهار الملاح جيدا من شريط الاداات لتصور وحدد نوع من لوحه بيك أب (6-حسنا لوحه).
    ملاحظه: يمكن تثبيت اي لوحه أو تنسيق جيد من قبل الشركة المصنعة فقط.
  16. معايره موقف بيك أب في منتصف البئر التي تحتوي علي حل CTCs ، ولكن مع عدم وجود خلايا في وسط مجال الرؤية. يمكن ان تؤدي المعايرة التي تتم علي حواف الآبار إلى معايره خاطئه بسبب السطح الجيد غير المستو.
  17. استخدام جهاز الاستشعار للمس بلطف الجزء السفلي من لوحه مع الشعرية (سرعه 0.01 مم/الخطوة وسرعه 1 ٪).
  18. تعيين موقف لاقط 0.05 مم فوق الجزء السفلي من لوحه.
    ملاحظه: تاكد من فتح وأزاله أغطيه من لوحات والدبابات قبل المضي قدما. قد يكسر الشعرية علي غطاء مغلقه أو غير مزاله.
    تحذير: في حاله انقطاع الشعيرات الشعرية عند ملامسه الاغطيه ، يمكن العثور علي الزجاج المكسور في المناطق المحيطة أو في الحلول.
  19. حدد نوع الخلية ومعلمات الانتقاء. يمكن اعداد معلمه الانتقاء وتحميلها عند كل بدء تشغيل. لانتقاء الخلايا المفردة ، حدد الوضع اليدوي.
  20. ضمن إعدادات اعداد الانتقاء :
    1. تعيين حجم الفجوة الجوية بين زيت النظام والعينة إلى 1 μl
    2. تعيين وحده تخزين السائل المخزن المؤقت لتناول قبل كل انتقاء إلى 0.5 μl.
      ملاحظه: يتم ضبط وحده التخزين السائل المخزن المؤقت إلى وحده التخزين القصوى للاقط الإجمالي. لا تؤثر وحدات التخزين الصغيرة علي كفاءه الانتقاء أو الإيداع.
    3. تعيين سرعه الطموح من السائل العازلة بين 1-6 ٪.
    4. تعيين وقت الانتظار بعد طموح المخزن المؤقت إلى 1 s.
      ملاحظه: يمكن استخدام خيار تناول المخزن المؤقت من الهدف جيدا بدلا من خزان السائل العازلة إذا لزم الأمر
    5. تعيين لأعاده استخدام الشعيرات الدموية الزجاجية وعدم التعقيم بيناللقطات.
      ملاحظه: يمكن اجراء التعقيم بين اللقطات يدويا إذا لزم الأمر. أداء يغسل متعددة في H2o بين الاختيارات أو اثنين من التعقيم في الايثانول تليها يغسل متعددة في ح2س.
  21. ضمن إعدادات الانتقاء :
    1. تغيير إعدادات الكاميرا اثناء الانتقاء ووقت التعرض تحت المجهر إلى 7,500 μs.
    2. حدد ارتفاع الانتقاء الثابت.
      ملاحظه: يمكن اختيار أداه الاستشعار أو التركيز البؤري التلقائي بدلا من ذلك. ومع ذلك, عيوب صغيره من لوحه يمكن ان يزعج حساسية الاستشعار أو التركيز البؤري التلقائي الذي قد يسبب تاثير الشعرية في لوحه.
    3. تعيين سرعه الطموح من الشعرية دخول لوحه المصدر إلى 7-15 ٪.
    4. تمكين الانتقاء التفاعلي.
    5. تعيين حجم الطموح في μl إلى 0-0.05.
    6. تعيين سرعه الطموح إلى 5 ٪.
    7. تعيين وقت الانتظار بعد الطموح في s إلى 0-1.
    8. تعيين عدد الجزيئات المنتقية في الشعرية إلى 1.
    9. تعيين لا انتقاء متعددة في نفس الموضع وليس وظائف تجريف . يجب تعيين خصائص الشفط وفقا لنوع التجربة (علي سبيل المثال ، قد يتطلب وضع الانتقاء التلقائي كميات أكبر من الطموح).
  22. ضمن إعدادات الإيداع :
    ملاحظه: إعدادات الإيداع تعتمد بدقه علي لوحه الإيداع/أنبوب.
    1. لاختيار خليه واحده ، وتحديد سرعه الشعرية إدخال لوحه الهدف إلى 25 ٪.
    2. اضبط سرعه الاستغناء عن 6%.
    3. تعيين وقت الانتظار بعد الاستغناء في s إلى 0.
    4. تعيين كميه الفجوة الجوية الاستغناء في الهدف جيدا إلى 100 ٪.
    5. لا تضع اي شطف بعد الإيداع.
      ملاحظه: يمكن اجراء التعقيم بعد إيداع لتنظيف الشعرية.
    6. تعيين الحد الأقصى لكميه إيداع الجزيئات في بئر وعدد الأهداف لتوزيع الجزيئات إلى 1.
    7. معايره ارتفاع الإيداع علي الموضع A1 من الهدف 1 للوحات أو في الموضع A1 من الهدف 2 للأنابيب. وضع أنبوب مفتوح أو لوحه دون غطاء للمعايرة واستخدام جهاز استشعار للمس برفق الإيداع جيدا (سرعه 0.01 مم/الخطوة وسرعه 1 ٪). تعيين ارتفاع الإيداع 1 مم فوق الجزء السفلي من اللوحة.
  23. ضمن الإعدادات:
    1. تعيين سرعه المرحلة اثناء الانتقاء إلى 5-10%.
      ملاحظه: قد تؤدي الحركات السريعة للوحه إلى حركه الخلايا في التعليق والصعوبات في انتقاء الخلايا المتعددة بسبب سوء التموضع.
    2. تعيين خصائص التعقيم باستخدام حجم الشطف إلى 1 μl ، 3 حلقات الشطف و 2 ليالي من وقت الانتظار لكل جولة التعقيم.
    3. تطبيق التغييرات قبل الإغلاق.
  24. انتقل الشعرية الزجاج باستخدام عصا التحكم في البئر ووضعه علي راس خليه واحده من الفائدة. اختيار التقاط المواقع علي مسافة أمنه من الحدود جيدا (1 ملم) كما قد كسر الشعرية علي حافه البئر.
  25. أضافه الجسيمات يدويا باستخدام زر عصا التحكم أو تحديد يدويا من القائمة.
  26. حدد اختيار الجزيئات المنشطة لبدء الانتقاء.
  27. سوف الشعرية وقف 0.05 مم فوق الجزء السفلي من لوحه وعلي راس موقف لاقط المحدد بسبب الانتقاء التفاعلي (الوضع اليدوي). برفق بدوره مقبض الباب من عصا التحكم في اتجاه عقارب الآن ليستنشق يدويا الجسيمات والحل DPBS المحيطة بها. لم يتم إصلاح وحده التخزين القصوى عند تشغيل الوضع اليدوي. ومع ذلك ، فان حجم الحد الأقصى المسموح به في الحقنه سيكون 25 μL.
  28. الاستغناء عن الحل DPBS الزائدة أو الجزيئات غير المرغوب فيها عن طريق تحويل بلطف مقبض عصا التحكم عكس عقارب الذراع. سوف الاستغناء كثيرا الإفراج عن الفجوة الجوية من حقنه تشكيل فقاعات في الحل الخاص بك والمساومة علي الرؤية.
  29. اضغط علي التالي للمتابعة مع الإيداع.
  30. مراقبه الشعرية دخول أنبوب PCR إيداع أو لوحه PCR ، والإفراج عن حجم والعودة إلى البداية موقف مع الشعرية فارغه.
    ملاحظه: إذا كان هناك حجم اليسار في الشعرية ، والمضي قدما في التعقيم. ثم ، أعد فحص الإعدادات ومستوي الزيت وارتفاع الزيت قبل اجراء انتقاء جديد.
  31. انتقل من النقطة 26 من القسم 4 لبدء عمليه انتقاء خليه واحده جديده. اثناء الانتقاء قد يكون من الضروري استبدال الشعرية. بعد التثبيت ، يجب اجراء معايره جديده لموضع التقاط. في نهاية المعايرة ، حدد وظيفة تطبيق التغييرات معايره في Z-الارتفاع لإيداع الارتفاع من أجل تصحيح ارتفاع الودائع إلى المعايرة الشعرية الجديدة وتخطي معايره ارتفاع الودائع (القسم 4.16).
    ملاحظه: تنطبق الخطوات الموضحة في القسم 1-4 علي معظم أساليب الإثراء والعزل CTCs. هنا نقوم بالإبلاغ عن الخطوات الاختيارية لتحليل CTCs محدده.

5-انتقاء الخلايا الواحدة وبذرها لتحليل البقاء والانتشار

  1. ضمان العمل مع المحاليل والمواد العقيمة للحفاظ علي العقم اثناء العملية بأكملها.
  2. اعداد لوحه جيدا 384 لاحتواء CTCs واحده منتقاة لزراعه مع 20 μL لجنه مكافحه الإرهاب الخياطة وسائل الاعلام31. ضمان ان يتم المصنفة CTCs في كميات صغيره من المتوسطة بعد التلاعب (علي سبيل المثال ، 10-20 μL لصفيحه بئر 384).
  3. تدور أسفل الحل إلى الجزء السفلي من لوحه. مكان 384 جيدا لوحه في الهدف 1 والحفاظ علي 4 درجه مئوية.
  4. تنفيذ كافة الخطوات مع التفصيلية الموضحة في القسم 4 لاعداد التفصيلية وبدء انتقاء جديد.
    ملاحظه: ستؤدي التحديدات المتعددة للخلايا المفردة إلى تشكيل قائمه انتقاء. سيتم اختيار الجزيئات وإيداعها واحدا تلو الآخر في الآبار المتعاقبة (انظر القسم 4.22.6). ومع ذلك ، فان الوضع التفاعلي (الوضع اليدوي) وقف الشعرية الحق قبل الطموح ، التالي السماح لمجرب للسيطرة علي هذه الخطوة الحاسمة وضمان الانتقاء الناجح. قد تؤدي الحركات السريعة للوحه إلى حركه الخلايا في التعليق والصعوبات في انتقاء الخلايا المتعددة.
  5. بعد الإيداع ، كرر الخطوة 4 لبدء انتقاء جديد.
  6. في نهاية القطف ، الطرد المركزي لوحه في 72 x g ل 4 دقيقه للتاكد من ان يتم وضع الخلايا المنتقية في الجزء السفلي من البئر.

6. لجنه مكافحه الإرهاب كسر العنقودية واختيار خليه واحده للتسلسل

  1. ضمان العمل مع العقيم الحلول والمواد للحفاظ علي العقم خلال العملية برمتها.
  2. اعداد أنابيب PCR واحد أو لوحه PCR التي سوف تحتوي علي خلايا واحده من الكتلة المكسورة مع إجمالي 2.5 μL خليه حل ليسينج يتكون من 1 U/μL من مثبطات RNA.
  3. بسرعة تدور أسفل الحل إلى الجزء السفلي من الأنبوب. وضع الحاويات إيداع في الهدف 2 والحفاظ علي 4 درجه مئوية.
  4. تنفيذ جميع الخطوات الموضحة في القسم 4 مع الجزئي لاعداد الجزئي.
  5. بدء انتقاء جديد. سوف الشعرية وقف 0.05 مم فوق الجزء السفلي من لوحه وعلي راس الكتلة المحددة CTC بسبب الانتقاء التفاعلي (الوضع اليدوي).
  6. برفق بدوره مقبض الباب من عصا التحكم في اتجاه عقارب الذراع ليستنشق يدويا الكتلة والحل DPBS المحيطة بها. الاستغناء عن حجم الشفط بما في ذلك الكتلة CTC عن طريق تحويل بلطف مقبض عصا التحكم عكس عقارب السنه.
  7. كرر التطلع/التخلص من مجموعه CTC الموصوفة في الخطوة 6 إلى ان تنفصل الخلايا المفردة التي تشكل الكتلة عن بعضها البعض.
    ملاحظه: سوف الاستغناء كثيرا الإفراج عن الفجوة الجوية من حقنه تشكيل فقاعات في الحل الخاص بك والمساومة علي الرؤية.
  8. اتبع بالعين موقف الخلايا المفردة. أضافه الجسيمات يدويا باستخدام زر عصا التحكم أو اختيار يدويا من القائمة.
    ملاحظه: ستؤدي التحديدات المتعددة للخلايا المفردة إلى تشكيل قائمه انتقاء. سيتم اختيار الجزيئات وإيداعها واحدا تلو الآخر في أنابيب/ابار PCR المتعاقبة (انظر القسم 4.22.6). ومع ذلك ، فان الوضع التفاعلي (الوضع اليدوي) وقف الشعرية الحق قبل الطموح ، التالي ، مما يسمح لمجرب للسيطرة علي هذه الخطوة الحرجة وضمان الانتقاء الناجح.
  9. حدد اختيار الجزيئات المنشطة لبدء الانتقاء.
    ملاحظه: سيسمح مقدار الحل ليسينج الخلية خليه واحده إلى lyse تماما. ومع ذلك ، قد التعرض طويلة من المحتوي تفكيك إلى عامل ليسينج تتحلل الحمض النووي أو mrna. لذلك ، انتقل فورا إلى الخطوة التالية.
  10. علي الفور إغلاق الأنبوب الذي يحتوي علي خليه واحده منتقاة ونقل علي الجليد الجاف لتجميد المفاجئة.
  11. تدور بسرعة أنبوب والتحقق من عدم وجود قطرات علي جانبي الأنبوب لضمان lyse السليم للخلية المودعة.
  12. كرر من الخطوة 5 لبدء انتقاء جديد.
    ملاحظه: مرحله المجهر سوف تتحرك من الجسيمات المضافة واحد إلى آخر في السرعة الموصوفة في القسم 4.23.1. قد تتحرك تعليق CTCs في لوحه المرفقات المنخفضة جدا ، مما يتسبب في الانتقاء الخاطئ بسبب سوء التموضع.

7. CTCs العزلة لحقن الماوس

  1. ضمان العمل مع المحاليل والمواد العقيمة للحفاظ علي العقم اثناء العملية بأكملها.
  2. اعداد أنبوب PCR مع 5 μL من المعقمة 1x DPBS.
  3. بسرعة تدور أسفل الحل إلى الجزء السفلي من الأنبوب. وضع الحاويات إيداع في الهدف 2 والحفاظ علي 4 درجه مئوية.
  4. ضمن إعدادات الإيداع تطبيق تغيير في الخطوة 4.22.6: تعيين الحد الأقصى للإيداع الجسيمات لكل بئر إلى 1,000 وعدد الأهداف لتوزيع الجزيئات إلى 1. تضمن هذه الخطوة ان يتم إيداع الخلايا المنتقية في نفس الأنبوب ل1,000 مرات.
  5. استخدم الوضع التفاعلي فقط (الوضع اليدوي) للتحكم بدقه في خطوه الانتقاء والاحتفاظ بالحل المنتقي خاليا من خلايا الملوثات.
    ملاحظه: إذا كانت هناك حاجه إلى أكثر من 1,000 الخلايا ، زيادة عدد الأهداف لتوزيع الجسيمات لتجنب فقدان العينة بعد الخلايا 1,000.
  6. متابعه الخطوات من المقطع 4.26 لبدء انتقاء جديد. كرر الخطوة 6 لتنفيذ العديد من الpickings. أضافه تعليق توضيحي لعدد الخلايا التي تم تجميعها في كل انتقاء من أجل تتبع عدد الخلايا المتوفرة لحقن الماوس.
  7. في نهاية القطف ، الطرد المركزي الأنبوب في 72 x g ل 4 دقيقه (انظر القسم 3.1.) ويستنشق supernatant.
  8. أعاده تعليق CTCs التي تم جمعها في المخزن المؤقت للاختيار ، ومناسبه لحقن الماوس. لحقن لوحه الدهون الثديية ، أعاده تعليق CTCs التي تم جمعها في 1 إلى 1 نسبه من DPBS 1x والغشاء الطابق السفلي المعاد تشكيله ، والحفاظ علي 4 درجه مئوية حتى الحقن. للحقن في الوريد ، أعاده تعليق CTCs التي تم جمعها في DPBS فقط.
    ملاحظه: حجم الحل يعتمد بشكل صارم علي عدد CTCs التي سيتم حقنها. وينصح لحقن في لوحه الدهون الثديية أو عن الوريد بحد اقصي 100 μL لكل ماوس. عند حساب وحده التخزين ، دائما النظر في حجم القتلى للتلاعب والتحميل حقنه.

النتائج

يسمح سير العمل المعروض اعداد CTCs الفردية ، اما من CTCs واحده أو مفصوله عن المجموعات CTC. يتم تخصيب CTCs من المرضي أو الفئران الحاملة للورم من الدم كله مع الأساليب المتاحة لإثراء CTC ومن ثم ملطخه بالأجسام المضادة ضد علامات السرطان المرتبطة (علي سبيل المثال ، EpCAM ، الأخضر) وعلامات مك...

Discussion

التوصيف الجزيئي لctcs يحمل الوعد بتحسين فهمنا للعملية المنتشرة وتوجيه تطوير العلاجات الجديدة المضادة للانبثاث. نقدم هنا وصفا مفصلا لتلك البروتوكولات التي تمكن من التحليل الجزئي للجنة مكافحه الإرهاب والتحاليل النهائية ، بما في ذلك الاختبارات الوظيفية أحاديه الخلية وتحليل التعبير الجيني ?...

Disclosures

يتم سرد N.A. و ب. كمخترعين في تطبيقات براءات الاختراع التي تتعلق بتعميم الخلايا السرطانية وعلاج السرطان. N.A. هو استشاري مدفوع الأجر لشركات الادويه والتامين المهتمة بالخزعة السائلة.

Acknowledgements

نشكر جميع المرضي الذين تبرعوا بالدم للدراسة لدينا ، وكذلك جميع الأطباء المعنيين والممرضات الدراسة. نشكر ينس ايبرهارت ، أوى بيركه ، والدكتورة كاثارينا Uhlig من حلول المختبر الألى المحدودة GmbH للحصول علي الدعم المستمر. ونشكر جميع أعضاء مختبر اسيالي علي التعقيبات والمناقشات. ويدعم البحث في مختبر Aceto من قبل مجلس البحوث الأوروبي ، والاتحاد الأوروبي ، والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم ، والرابطة السويسرية للسرطان ، ورابطه بازل للسرطان ، وكانتونين من بازل من خلال ETH زيورخ ، وجامعه بازل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-human EpCAM-AF488Cell Signaling TechnologyCST5198clone: VU1D9
1X DPBSInvitrogen14190169no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plateCorning3471
Anti-human CD45-BV605Biolegend304041clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC GeneTexGTX11400clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488 Biolegend324410clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605Biolegend103139clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTABD366643for human blood collection
Cell CelectorALSCC1001core unit 
CellD softwareALSversion 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2R&D Systems3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTASarstedt41.3395.005for mouse blood collection
PCR tubesCorningPCR-02-L-C
RLT PlusQuiagen1053393
SUPERase  In RNase InhibitorThermo FisherAM2696 1 U/µL 

References

  1. Talmadge, J. E., Fidler, I. J. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Cancer Research. 70 (14), 5649-5669 (2010).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).
  4. Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review). International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).
  5. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  6. Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
  7. Pantel, K., Speicher, M. R. The biology of circulating tumor cells. Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).
  8. Hou, J. M., et al. Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).
  9. Long, E., et al. High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness. Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).
  10. Wang, C., et al. Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).
  11. Mu, Z., et al. Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).
  12. Zhang, D., et al. Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy. Cancer Cell International. 17, 6 (2017).
  13. Zheng, X., et al. Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer. Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).
  14. Chang, M. C., et al. Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).
  15. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  16. Cheung, K. J., et al. Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).
  17. Giuliano, M., et al. Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize. Cancer Research. 78 (4), 845-852 (2018).
  18. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, 33 (2016).
  19. Gkountela, S., et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding. Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).
  20. Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. , (2019).
  21. Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment?. Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).
  22. Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
  23. Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10 (9), e0138032 (2015).
  24. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
  25. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147 (2013).
  26. Went, P. T., et al. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).
  27. Soysal, S. D., et al. EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer. British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).
  28. Yu, M., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
  30. Zheng, S., et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).
  31. Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved