JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה משולבת כדי לזהות תכונות פנוטיפקס ומולקולריות המאפיינות תאים סרטניים במחזור (CTCs). אנו משלבים כתמים חיים ומיקרומניפולציה רובוטית של CTCs יחיד ומקובצים עם שיטות מבוססות תא יחיד עבור ניתוח המטה והערכה של גרורות-זריעת היכולת.

Abstract

דם גרורות המועברות חשבונות עבור מקרי מוות הקשורים לסרטן, כרוך במחזור תאים סרטניים (CTCs) כי הם מצליחים בהקמת גידולים חדשים באתרים מרוחקים. CTCs נמצאים במחזור הדם של חולים כמו תאים בודדים (CTCs יחיד) או כאגרגטים רב-תאיים (אשכולות CTC ו CTC-לבן האשכולות תא דם), עם האחרון המציג יכולת גרורתית גבוה יותר. מעבר לספירה, ניתוח פנומיטיות ומולקולרי הוא חשוב במיוחד כדי לנתח את ביולוגיה של CTC ולזהות פגיעויות שניתן לשאת. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של זרימת עבודה הכוללת CTC כתמים ומיקרומניפולציה, התרבות הvivo ex כדי להעריך את יכולות ההתרבות וההישרדות של תאים בודדים, ו ב vivo גרורות-היווצרות assays. בנוסף, אנו מספקים פרוטוקול להשגת הדיסוציאציה של אשכולות CTC לתאים בודדים וחקירה של טרוגניות באשכול. עם גישות אלה, למשל, אנחנו בדיוק לכמת הישרדות ופוטנציאל מתרבים של CTCs יחיד תאים בודדים בתוך אשכולות CTC, מוביל אותנו התבוננות כי תאים בתוך אשכולות להציג הישרדות טוב יותר התפשטות לשעבר תרבויות vivo לעומת CTCs יחיד. בסך הכל, זרימת העבודה שלנו מציעה פלטפורמה כדי לנתח את המאפיינים של CTCs ברמת התא בודד, במטרה לקראת זיהוי של מסלולים הרלוונטיים גרורות והבנה טובה יותר של CTC ביולוגיה.

Introduction

ביטוי קליני של גרורות באיברים רחוקים מייצג את השלב הסופי של התקדמות הסרטן וחשבונות עבור יותר מ 90% של מקרי מוות הקשורים לסרטן1. המעבר מתוך מחלה מקומית למחלה גרורתית הוא תהליך רב שלב, לעתים קרובות מתווכת על ידי במחזור תאים סרטניים (ctcs)2,3,4. תאים אלה הם לשפוך מן הגידול העיקרי לתוך זרימת הדם מועברים לאיברים מרוחקים, שם הם יכולים extravasate ולהקים נגעים גרורתית5,6. למרות גידולים מוצקים יכולים לשחרר מספר גבוה יחסית של CTCs, רוב CTCs נועדו למות, בשל כוחות להטות גבוה במחזור, anoikis-בתיווך מוות תאים, התקפה חיסונית או יכולות מוגבלות כדי להסתגל מיקרוסביבה זרה7. לכן, זה מרכזי להקים כלים המאפשרים את הניתוח של התכונות המולקולריות של אלה CTCs כי הם מצוידים ביכולת זריעת גרורות. מחקרים האחרונים פרה וקליניים מראים כי הנוכחות והכמות של ctcs יחיד ואשכולות CTC קשורה לתוצאה גרועה יותר בחולים עם סוגים שונים של גידולים מוצקים8,9,10 , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 . אשכולות CTC הם קבוצות של שניים או יותר ctcs מחוברים זה לזה במהלך המחזור ויעילים יותר ביצירת גרורות לעומת ctcs אחד3,15,16. תאים בתוך אשכול שומרים על הדבקה חזקה תא תא באמצעות הצמתים desmosomes וחסיד, אשר עשוי לסייע להתגבר על אנואיקיס17,18. לאחרונה, הבחנו כי התקבצות של CTCs מקושרת לhypאומולציה של אתרי הכריכה של שולי-והפצת שעתוק הקשורים, המובילה ליכולת מוגברת ליזום בהצלחה את גרורות19. CTC הדיסוציאציה גורמת לשיפוצים של אתרי האיגוד המרכזיים, וכתוצאה מכך, הדיכוי של הפוטנציאל הגרורתי שלהם19. בנוסף אשכולות של תאים סרטניים, CTCs יכול גם לשייך לתא הדם הלבן (לעתים קרובות נויטרופילים) כדי לשמור על רמות התפשטות גבוהות במחזור ולהגדיל יכולת גרורתית שלהם20. עם זאת, הביולוגיה של CTCs מובנת רק בחלק ומספר שאלות נשארות פתוחות, כולל התכונות המולקולריות והפגיעויות של תאים בודדים ומקובצים באשכולות.

בשנים האחרונות הוקמו מספר אסטרטגיות שינצלו את דפוסי הביטוי של משטח התא, כמו גם תכונות פיזיות של ctcs לבידוד שלהם21,22,23,24, 25. אנטיגן-שיטות בידוד תלוי להסתמך בעיקר על הביטוי של משטח התא אפיתל מולקולה הדבקה של תא (epcam)26. השימוש התכוף ביותר (בזמן הנוכחי) הפלטפורמה היחידה של ה-FDA עבור ספירה CTC, היא מערכת CellSearch, אשר מבוססת על הליך שני שלבים כדי לבודד CTCs21. בשלב הראשון, רכיבי פלזמה מוסרים על ידי צנטריפוגה, בעוד CTCs נלכדים עם מגנטי מגנטיים מצמידים אנטי EpCAM נוגדנים. בשלב השני, הפתרון CTC-מועשר מוכתם עבור נוקלאובטים (dapi-חיוביים) תאים המבטא ציטוקרטין (CK)8,18,19, בעוד תאי דם לבנים (wbcs) מזוהים באמצעות ה סמן CD45. לבסוף, תאים שנתפסו ממוקמים על פלטפורמת הקרנה משולבת CTCs מזוהים באמצעות הביטוי של EpCAM, אקס, ו DAPI תוך שלילי עבור CD45. למרות שהדבר נחשב לסטנדרט הזהב לספירת CTC, ניתוח מולקולרי במורד הזרם מאתגר עם טכנולוגיה זו בשל האילוצים הטבועים באחזור CTC. בנוסף, בהינתן הליך הבידוד שלה, CellSearch עשוי להעדיף את העשרת CTCs עם רמות EpCAM גבוהות יותר לעומת CTCs עם ביטוי התחתון EpCAM, בשל למשל סרטן טרוגניות27 או downregulation של סמנים אפיתל 28,29. כדי להתגבר על מגבלות אלה, טכנולוגיות בלתי תלויות אנטיגן להעשרה של CTCs הופיעו. לדוגמה, CTC-ichip משלבת הפרדה הידרודינמית של תאים נוקלאוטיים, כולל ctcs ו-wbcs מרכיבי הדם הנותרים, ולאחריו דלדול אימונוגנטית של נוגדן מתויג wbcs, המאפשר טיהור של ctcs מתויגים וקיימא ב פתרון25. בנוסף, העובדה כי רוב ctcs הם קצת יותר גדול מאשר כדוריות הדם האדומות (rbcs) או wbcs הובילו לפיתוח של טכנולוגיות העשרה מבוססות CTC גודל23,30 (למשל, מערכת parsortix (זווית)) אשר עושה שימוש ב מבוססי מיקרופלואידיג טכנולוגיה, הכוללת ערוץ היצרות על פני קלטת ההפרדה, תאים מובילים לפער מסוף של 10, 8, 6.5 או 4.5 יקרומטר (גדלים שונים זמינים בהתאם לקוטר צפוי של תאים סרטניים היעד). רוב תאי הדם עוברים דרך הפער הצר, בעוד CTCs לכודים בשל גודלם (אבל גם בשל deformability התחתון שלהם) והם, לכן, נשמרים בקלטת. החזרת כיוון הזרימה מאפשרת שחרורו של CTCs שנתפסו, אשר נמצאים במצב בר קיימא ומתאים לניתוח במורד הזרם. באופן עצמאי של הפרוטוקול הנבחר עבור בידוד CTC, עם זאת, הליכים שלאחר העשרה טיפוסי עדיין להניב CTCs כי הם מעורבים עם מספר קטן יחסית של RBCs ו-WBCs, ביצוע ניתוח של CTCs טהור או בצובר מאתגרת. כדי לטפל בבעיה זו, הקמנו זרימת עבודה המאפשרת תפעול CTC ללא הטיה פוטנציאלית שהוצגה על-ידי מזהמים של תאי דם. תוספת של כתמים חיסוניים מראש, עם שילובים משתנה נוגדן, מבדיל CTCs מתאי הדם ואף מאפשר לזהות תת קבוצות CTC עם פרופילים ביטוי משטח-סמן ברורים. זה הליך להתאמה אישית מאוד יכול להיות בשילוב נוסף עם יישומים ספציפיים במורד הזרם.

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה המתחילה ממוצר CTC-מועשר (שהושג עם כל טכנולוגיית CTC העשרה של בחירה) ומשלבת מספר גישות כדי לקבל תובנה לביולוגיה של CTC ברזולוציה של תא בודד. בקיצור, זרימת העבודה שלנו מאפשרת זיהוי של CTCs יחיד, אשכולות CTC ו CTC-WBC אשכולות על ידי החיסונית לחיות, ואחריו מיקרומניפולציה תא יחיד וניתוח במורד באמצעות פרוטוקולי vivo culturing לשעבר, תא בודד רצף, ו ב vivo גרורות.

Protocol

כל ההליכים הכרוכים בדגימות דם מהחולים נערכו בהסכמת הסכמה מושכלת של המשתתפים. הליכים הופעל על פי פרוטוקולים EKNZ BASEC 2016-00067 ו-EK 321/10, שאושרו על ידי לוח הסקירה המוסרי והמוסדי (ועדת האתיקה מערב/מרכז שוויץ [EKNZ]), ובציות להכרזת הלסינקי.

כל ההליכים הנוגעים לבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיים והמוסדיות (פרוטוקול העכבר המאושר2781, המשרד הווטרינרי של באזל-סיטי).

1. הכנה לדוגמא לחולה

  1. לפני תחילת, להבטיח לעבוד עם פתרונות אספטי וחומרים לשמור על עקרות במהלך ההליך כולו.
  2. משיכת 7.5 mL של דם היקפי מחולה סרטן השד לתוך צינור 10 mL EDTA האוסף דם.
  3. מודטה את הצינורות המכילים דם לפרק זמן קצר (עד 1 h) בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר נדנדה ב 40 תנודות לדקה (osc/min).
  4. להעשיר עבור ctcs יחיד ואשכולות CTC באמצעות שיטת בידוד CTC של בחירה21,22,23,25. שחרר CTCs בפתרון 1x DPBS.
    הערה: בהתאם לטכנולוגיית CTC-העשרה שנבחרה, בתאי דם לבנים שנותרו ותאי דם אדומים עשויים להיות נוכחים. כוונן את הלחץ המשחררים כדי לשמר את מבני האשכולות CTC.
  5. . המשך מיד לשלב הבא בסעיף 3

2. הכנה לדגימת עכבר

  1. לפני תחילת, להכין מזרק 1 מ"ל אינסולין עם מחט 25G, 5 mM EDTA מסוננים פתרון, ו 2 מ"ל לאסוף דם מנורות EDTA.
  2. להבטיח לעבוד עם פתרונות אספטי וחומרים לשמור על עקרות במהלך ההליך כולו.
  3. לשטוף מראש את המזרק עם פתרון 5 מ"מ EDTA.
  4. טען את המזרק עם 100 μL של 5 מ"מ EDTA ולהסיר בועות.
  5. המתת חסד העכבר באמצעות 80% CO2 /20% O2 שאיפת הגז ולהמשיך מיד לשלב הבא.
    הערה: חלופה לשיטת האינהלציה של CO2 היא ההרדמה (3 vol% isofלינה וחמצן) בקצב הזרימה של 600 mL/min) ואחריו פריקה צוואר הרחם, או הזרקה מינון יתר של פתרון קטמין/xylazine. שיטת המתת החסד הספציפית עשויה להשתנות בהתאם לפרוטוקול העכבר המאושר.
  6. לאשר את מותו של בעל החיים על ידי היעדר פעילות נשימה, חסר רפלקס הקרנית, והטלת שתן ללא גירויים חיצוניים.
  7. בצע ניקוב לב על ידי החדרת בזהירות את המחט של מזרק pre-EDTA טעון מראש עם זווית 30 ° לתוך בית החזה מן החזה לכיוון הלב.
    הערה: עבור ניסויים מנוסים, מומלץ לפתוח את חלל החזה תחילה, לפני ביצוע ניקוב הלב, כדי להמחיש טוב יותר את הלבבות.
  8. . מעלה עד 1 מ ל של דם מבלי לשחרר את הבוכנה, לשלוף את המזרק מן החזה בעלי חיים, להסיר בבטחה את המחט, לפתוח את המכסה של 2 מ"ל הצינור דם EDTA ולחלק את הדם ישירות פנימה. סגור את המכסה ולהפוך את הצינור 10x.
  9. מודטה את הצינורות הדם המכילים עבור פרק זמן קצר (עד 1 h) ב RT על שייקר נדנדה ב 40 osc/min.
    התראה: יש להיפטר מהמחט בסילוק סיכונים ביולוגיים חדים.
    הערה: דקירות מרובות ניתן להגדיל את נפח הדם הכולל. השתמש מזרקים נפרדים טעון מראש עם EDTA עבור נסוג שונים כדי להימנע מפני משחלת דם הנוכחי במחט הקודמת.
  10. להעשיר עבור ctcs בודד ואשכולות CTC באמצעות ctcs שיטת בידוד של הבחירה21,22,23,25. שחרר CTCs בפתרון 1x DPBS.
    הערה: בהתאם לטכנולוגיית CTC-העשרה שנבחרה, כדוריות דם לבנות נותרות וכדוריות דם אדומות, עשויות להיות נוכחות. כוונן את הלחץ המשחררים כדי לשמר את מבני האשכולות CTC.
  11. . המשך מיד לשלב הבא בסעיף 3
    הערה: עבור כל ההליכים הבאים, ודא שנעשה שימוש בדם לא קבוע ומבודד טרי.

3. CTCs חיים כתמים החיסונית

  1. צנטריפוגה CTC ההשעיה התא מועשר ב 72 x g עבור 4 דקות.
    הערה: 72 x g תואם 800 rpm אם הרוטור יש קוטר של 100 מ"מ. המר את מספר כוח הג בהתאם לרוטור.
  2. בעדינות להשעות את הגלולה ב 1% הפתרון BSA ב-1x DPBS ולהוסיף 2 μg/mL של הנוגדן אנטי אדם-AF488 ו-1 μg/mL של נוגדן אנטי-אדם CD45-BV605 או 2 μg/mL נגד העכבר CD45-BV605 נוגדן בנפח כולל של 500 μL.
    הערה: עבור סרטן השד החולה הנגזר CTCs, אנטי אדם EGFR-FITC, ואנטי אדם HER2-AF488 ניתן להוסיף בנוסף anti-EpCAM ו anti-CD45. זה מאפשר לזהות טוב יותר CTCs כי הם ביטוי נמוך יותר EpCAM רמות.
  3. דגירה עבור 30 דקות ב RT ולהגן מפני אור.
  4. לשטוף ההשעיה CTCs באמצעות 1 mL של 1% BSA בפתרון 1x DPBS ו צנטריפוגה ב 72 x g עבור 4 דקות. חזור על השטיפה פעמיים.
  5. השהה מחדש תאים מוכתמים ב-2 מ ל של 1% BSA בפתרון DPBS 1x ולהעביר את הנפח הכולל 1 טוב של צלחת מצורף במיוחד בגובה 6 בארות.
  6. מודקת את הצלחת עבור 10-15 דקות ב 4 ° צ' מוגן מפני אור כדי לאפשר משקעים של CTCs ותאי דם שיורית.

4. מיקרומניפולציה של CTCs ובחירת תא בודד

הערה: לפני שתתחיל, שים לב שהמיקרומניפולציה דורשת עד 45 דקות להשלמת ההגדרה. לאחר ההגדרה, ההליך עבור זיהוי CTC ומיקרומניפולציה מחייב עד 2 דקות לכל תא (או אשכול).

  1. הקפד לסיים את הליך האיסוף CTC בתוך 2 h מסוף ההכתמים.
  2. הפעל את תוכנת המיקרומניפולציה והפעל את המיקרומניפולציה. חבר את המיקרומניפולציה למחשב ואתחל את הזרוע הרובוטית, כמו גם את שלב המיקרוסקופ על- ידי לחיצה על לחצן ההתחברות ואחריו התקן Int.
  3. סגור את ארון ההגנה לאחר כל מניפולציה של המכונה כדי להיות מסוגל לתמרן אותו דרך המחשב.
  4. נקו את המשטחים מאבק ונשפך על ידי התזת אתנול וניגוב המשטחים הפנימיים של הקבינט. סביבה נקייה תבטיח את עקרות התהליך.
  5. התקינו נימי זכוכית חדשים על הזרוע הרובוטית. עבור איסוף תא בודד, השתמש ב-20-30 יקרומטר נימי בזמן 30-50 יקרומטר עדיף לאיסוף אשכול CTC.
  6. להסיר את כל הבועות הנוכחים אבובים על ידי מאחד או מזיל את שמן המערכת.
    התראה: נימי זכוכית חדים ושבריריים. . לטפל בזהירות
  7. למלא את הטנק עיקור 1 עם 70% אתנול, את הטנק עיקור 2 עם השני ומלא סטרילי-H2O ומיכל מאגר עם סטרילי 1X dpbs.
    התראה: אל תסגור את עפעפיו של הטנקים, שכן במהלך השלבים הבאים יצטרך הקפילר לגשת בחופשיות לטנקים.
  8. לחטא את הקפילר פעמיים. עם 70% אתנול
  9. להחליף את הטנק עיקור 1 עם טנק 2 ולשטוף נימי ב H2O לפחות שלוש פעמים באמצעות הפונקציה עיקור.
  10. באמצעות תוכנת המיקרומניפולציה, התחל ניסוי חדש ובחר את סוג ניסוי האיסוף בין מצבי הבחירה האוטומטיים והידנית.
    הערה: בחר את סוג הניסוי המבוסס על נקודת הסיום של המניפולציה. מצב ידני מאפשר תמרון של זרוע רובוטית לאחר נימי נכנס לתא ההשעיה. שלב זה נחוץ לדיסוציאציה של אשכולות CTC לתאים בודדים. ניתן לשנות את סוג האיסוף במהלך הניסוי.
  11. הגדר את מגש הסיפון המציין את מיקום מיכל העיקור (נוזל 1), מיכל האגירה (נוזל 2) ומגש הפקדת (יעד 1 או 2). המטרה 1 מאפשר להפקיד לתוך הצלחות, היעד 2 מאפשר להפקיד לתוך צינורות PCR או לוחות PCR.
  12. הגדר את הטמפרטורה של המיכלים הנוזליים ומגש הפקדת היחידה שנבחרה ל -4 ° c.
    הערה: תהליך האיסוף עשוי לגזול זמן רב. לפיכך, מומלץ לצנן את המיכלים הנוזליים ואת מגש ההפקדת.
  13. הצב את לוחית ההחזקה האולטרה-נמוכה המכילה את התמיסה המתפרסמת של CTCs תחת המיקרוסקופ שבתוך ארון המיקרומניפולציה. הסר את המכסה מלוחית הרישוי וסגור את הארון. שמור את הצלחת ב-RT לשארית ההגדרה ובמהלך תהליך האיסוף.
  14. בחר באופן ידני את מטרת המיקרוסקופ לקטיף (10-20x) ואת זמן החשיפה של כל הערוצים הדרושים (ברייטפילד, FITC, וערוצי TRITC).
  15. בחר הצג ניווט היטב מסרגל הכלים כדי להמחיש ולבחור את סוג צלחת הטנדר (צלחת 6-באר).
    הערה: כל צלחת או תבנית טובה ניתן להתקין על ידי היצרן בלבד.
  16. כיול מיקום הטנדר במרכז הבאר המכיל את פתרון CTCs, אך ללא תאים במרכז שדה הראייה. כיול שבוצע בקצות הבארות יכול לגרום לכיול פגום עקב משטח היטב לא אחיד.
  17. השתמש בחיישן כדי לגעת בעדינות בתחתית הצלחת עם נימי (מהירות 0.01 מ"מ/צעד ומהירות 1%).
  18. הגדר את מיקום הטנדר 0.05 מ"מ מעל לתחתית הצלחת.
    הערה: הקפד לפתוח ולהסיר מכסים של צלחות וטנקים לפני שתמשיך. הקפילר עלול להישבר על מכסה סגור או בלתי מיוסר.
    התראה: אם הנימים נשברים במגע עם עפעפיים, ניתן למצוא זכוכית שבורה בסביבה או בפתרונות.
  19. בחר סוג תא ופרמטרי איסוף. ניתן להגדיר פרמטר איסוף ולטעון אותו בכל הפעלה. עבור איסוף של תא בודד, בחר במצב הידני.
  20. בתוך הגדרות הכנת האיסוף:
    1. הגדר את עוצמת האוויר בין שמן המערכת לבין המדגם ל-1 μl
    2. הגדר את אמצעי האחסון הנוזלי של המאגר כך שייקח לפני שכל האיסוף יהיה 0.5 μl.
      הערה: נפח האחסון הנוזלי של המאגר מותאם לנפח האיסוף המקסימלי הכולל. כרכים קטנים אינם משפיעים על יעילות האיסוף או הפקדת הפעולה.
    3. הגדר את מהירות השאיפה של נוזל החוצץ בין 1-6%.
    4. קבע את זמן ההמתנה לאחר שאיפה של המאגר ל-1.
      הערה: האפשרות של לקיחת מאגר מן היעד היטב במקום מיכל נוזלי מאגר ניתן להשתמש אם יש צורך
    5. מוגדר לשימוש חוזר נימים זכוכית ולא עיקור בין הבחירות.
      הערה: ניתן לבצע עיקור בין מבחר באופן ידני במידת הצורך. לבצע מספר שוטף ב H2O בין ברים או שניים עיקור באתנול ואחריו מספר שוטף ב H2o.
  21. בתוך הגדרות האיסוף:
    1. לשנות את הגדרות המצלמה בזמן איסוף וחשיפה זמן תחת המיקרוסקופ כדי 7,500 μs.
    2. בחר גובה איסוף קבוע.
      הערה: חיישן הכלי או פוקוס אוטומטי יכול להיבחר במקום. עם זאת, פגמים קטנים של הצלחת יכול להפריע את הרגישות של החיישן או פוקוס אוטומטי אשר עלול לגרום להשפעה של נימי לתוך הצלחת.
    3. הגדר את מהירות השאיפה של נימי הכניסה ללוחית המקור ל-7-15%.
    4. הפוך את האיסוף האינטראקטיבי לזמין.
    5. הגדר את עוצמת השאיפה ב-μl ל-0 0.05.
    6. הגדר את מהירות השאיפה ל -5%.
    7. הגדר את זמן ההמתנה לאחר השאיפה ב-s עד 0-1.
    8. הגדר את מספר החלקיקים הנירים לקפילר ל-1.
    9. הגדר ללא מספר איסוף באותו מיקום וללא פונקציות מגרדים . מאפייני השאיפה חייבים להיות מוגדרים בהתאם לסוג הניסוי (לדוגמה, מצב איסוף אוטומטי עשוי לדרוש אמצעי אחסון גדולים יותר של שאיפה).
  22. בתוך הגדרות ההפקדה:
    הערה: הגדרות הפקדת הודעה תלויות באופן מדויק על צלחת ההפקדת/השפופרת.
    1. עבור איסוף תא בודד, הגדר את מהירות הקפילר הנכנסת ללוח היעד ל -25%.
    2. הגדר את המהירות של החילוק ל-6%.
    3. קבע את זמן ההמתנה לאחר שאתה משלב את הערך של 0.
    4. להגדיר את כמות פער האוויר מושם במטרה היטב 100%.
    5. הגדר לא לשטוף לאחר הפקדת.
      הערה: ניתן לבצע עיקור לאחר הפקדת לנקות את הנימים.
    6. הגדר כמות מקסימלית של הפקדת החלקיקים לפי היטב ומספר היעדים להפצת חלקיקים ל-1.
    7. כיול גובה הפקדה על מיקום A1 מטרה 1 עבור צלחות או על מיקום A1 של היעד 2 עבור צינורות. מניחים צינור פתוח או צלחת ללא מכסה את הכיול ולהשתמש בחיישן כדי לגעת בעדינות את הפקדת היטב (מהירות 0.01 מ"מ/צעד ו 1% מהירות). הגדר את גובה הפקדת 1 מ"מ מעל לתחתית הצלחת.
  23. בתוך ההגדרות:
    1. קבע את מהירות השלב במהלך איסוף ל-5-10%.
      הערה: תנועות מהירות של הצלחת עשוי לגרום לתנועה של תאים בהשעיה וקשיים באיסוף תאים מרובים עקב השעיית מספר.
    2. הגדר מאפייני עיקור באמצעות השטיפה נפח 1 μl, 3 לולאות שטיפה ו 2 s של זמן המתנה לסבב עיקור.
    3. החל את השינויים לפני הסגירה.
  24. לנווט את נימי הזכוכית באמצעות ג'ויסטיק בבאר ולמקם אותו על גבי תא יחיד של עניין. לבחור להרים עמדות במרחק בטוח מן הגבול היטב (1 מ"מ) כמו הקפילר עלול להישבר על קצה הבאר.
  25. הוסף באופן ידני חלקיקים באמצעות הלחצן של ג'ויסטיק או בחירה ידנית מהתפריט.
  26. בחר לבחור חלקיקים שהופעלו כדי להתחיל את הקטיף.
  27. הקפילר יעצור 0.05 מ"מ מעל החלק התחתון של הצלחת ובראש מיקום הטנדר הנבחר בגלל הקטיף האינטראקטיבי (מצב ידני). בעדינות להפוך את הידית של ג'ויסטיק בכיוון השעון כדי לכבות ידנית את החלקיקים ואת הפתרון DPBS שמסביב. אמצעי האחסון המרבי אינו קבוע כאשר המצב הידני מופעל. עם זאת, הנפח המרבי המותר במזרק יהיה 25 μL.
  28. לחלק את הפתרון DPBS עודף או חלקיקים לא רצויים על ידי בעדינות לסובב את הידית של ג'ויסטיק נגד כיוון השעון. יותר מדי מחלק ישחרר את פער האוויר של המזרק ויוצרים בועות בפתרון שלך ולהתפשר על ניראות.
  29. לחץ על הבא כדי להמשיך בהפקדה.
  30. שימו לב לנימי הכניסה לצינור ה-pcr או למשטח ה-PCR, שחרור אמצעי האחסון וחוזר לנקודת ההתחלה עם נימי ריק.
    הערה: אם נותר נפח בנימי הגוף, המשך בעיקור. לאחר מכן, בדוק מחדש את ההגדרות, רמת הנפט, וגובה הנפט לפני ביצוע הקטיף החדש.
  31. המשך מנקודה 26 של סעיף 4 כדי להתחיל בקטיף חדש של תא יחיד. במהלך איסוף ייתכן שיהיה צורך להחליף את הנימים. לאחר ההתקנה, יש לבצע כיול חדש של מיקום הטנדר. בסוף הכיול, בחר את הפונקציה החל שינויים מכוילים בגובה Z לגובה הפקדה כדי לתקן את גובה ההפקדה בכיול נימי החדש ולדלג על כיול גובה ההפקדה (סעיף 4.16).
    הערה: השלבים המתוארים בסעיף 1-4 חלים על רוב שיטות ההעשרה והבידוד של CTCs. כאן אנו מדווחים על שלבים אופציונליים עבור ניתוח CTCs מסוים.

5. הקטיף והזריעה של תא יחיד לניתוח הישרדות והתפשטות

  1. להבטיח לעבוד עם פתרונות אספטי וחומרים לשמור על עקרות במהלך ההליך כולו.
  2. להכין צלחת 384 היטב להכיל CTCs בודד עבור culturing עם 20 μL CTC culturing מדיה31. ודא כי CTCs הם הנזרע בנפחים קטנים של המדיום לאחר מניפולציה (למשל, 10-20 μL עבור לוחית 384 היטב).
  3. . תסובב את התמיסה לתחתית הצלחת מניחים 384 לוחית למטרה 1 ולשמור ב 4 ° c.
  4. בצע את כל השלבים עם המיקרומניפולציה המתוארים בסעיף 4 כדי להגדיר את המיקרומניפולציה ולהתחיל באיסוף חדש.
    הערה: בחירות מרובות של תאים בודדים יגרמו להיווצרות רשימת איסוף. החלקיקים ייאספו ויופקדו בזה אחר זה בבארות עוקבות (ראו סעיף 4.22.6). עם זאת, המצב האינטראקטיבי (מצב ידני) יעצור את הנימים ממש לפני השאיפה, ולכן המאפשר לניסויים לשלוט בצעד קריטי זה ולהבטיח איסוף מוצלח. תנועות מהירות של הצלחת עשוי לגרום לתנועת התאים בהשעיה וקשיים באיסוף תאים מרובים.
  5. לאחר הפקדת, חזור על שלב 4 כדי להתחיל באיסוף חדש.
  6. בסוף הקטיף, צנטריפוגה את הצלחת ב 72 x עבור 4 דקות כדי להבטיח כי התאים שנאספו ממוקמים בחלק התחתון של הבאר.

6. CTC שבירת אשכול ואיסוף תא יחיד לרצף

  1. ודא לעבוד עם פתרונות אספטי וחומרים כדי לשמור על עקרות במהלך ההליך כולו.
  2. להכין צינורות PCR יחיד או צלחת PCR שיכילו את התאים היחידים של האשכול שבור עם הסכום הכולל 2.5 μL תא המורכב 1 U/μL של מעכבי RNA.
  3. במהירות לסובב את הפתרון לתחתית הצינור. הניחו את מיכלי הפקדת היעד 2 והמשיכו ב -4 ° c.
  4. בצע את כל השלבים המתוארים בסעיף 4 עם המיקרומניפולציה כדי להגדיר את המיקרומניפולציה.
  5. . תתחילו בקטיף חדש הקפילר יעצור 0.05 מ"מ מעל לתחתית הצלחת ובראש אשכול CTC הנבחר בגלל הקטיף האינטראקטיבי (מצב ידני).
  6. בעדינות להפוך את הידית של ג'ויסטיק בכיוון השעון כדי לכבות ידנית את האשכול ואת הפתרון DPBS שמסביב. לחלק את נפח האספירין כולל אשכול CTC על ידי הפיכת הכפתור בעדינות של ג'ויסטיק נגד כיוון השעון.
  7. חזור על השאיפה/הסילוק של האשכול CTC המתואר בשלב 6 עד שהתאים היחידים היוצרים את האשכול יפרקו.
    הערה: יותר מדי מחלק תשחרר את פער האוויר של המזרק ויוצרים בועות בפתרון שלך ולהתפשר על ניראות.
  8. עקבו אחר מיקום התאים היחידים. הוסף ידנית את החלקיקים באמצעות הלחצן של ג'ויסטיק או בחירה ידנית מהתפריט.
    הערה: בחירות מרובות של תאים בודדים יגרמו להיווצרות רשימת איסוף. החלקיקים ייאספו ויופקדו בזה אחר זה בצינורות PCR/בארות רצופים (ראו סעיף 4.22.6). עם זאת, המצב האינטראקטיבי (מצב ידני) יעצור את הנימים ממש לפני השאיפה, ולכן, המאפשר לניסויים לשלוט בצעד קריטי זה ולהבטיח איסוף מוצלח.
  9. בחר לבחור חלקיקים שהופעלו כדי להתחיל את הקטיף.
    הערה: כמות התמיסה של תא לישישר תאפשר תא בודד לחלוטין. עם זאת, חשיפה ארוכה של התוכן למטה לסוכן lysed עלול לבזות DNA או mRNA. לכן, המשך מיד לשלב הבא.
  10. סגור מיד את הצינורית המכילה את התא היחיד שנאסף והעבר על קרח יבש לצורך הקפאה.
  11. במהירות לסובב את הצינור ולבדוק את העדר טיפות על צידי הצינור כדי להבטיח lyse תקין של התא הופקד.
  12. חזור על משלב 5 כדי להתחיל באיסוף חדש.
    הערה: שלב המיקרוסקופ יזוז מחלקיק נוסף אחד למשנהו במהירות המתוארת בסעיף 4.23.1. השעיית CTCs בלוח המצורף האולטרה-נמוך עשוי לנוע, וגורם לאיסוף פגום עקב היספוזיציה.

7. בידוד CTCs להזרקת העכבר

  1. להבטיח לעבוד עם פתרונות אספטי וחומרים לשמור על עקרות במהלך ההליך כולו.
  2. הכינו צינור PCR עם 5 μL של מעבד 1x DPBS.
  3. במהירות לסובב את הפתרון לתחתית הצינור. הניחו את מיכלי הפקדת היעד 2 והמשיכו ב -4 ° c.
  4. בתוך הגדרות ההפקדה מחילים שינוי בשלב 4.22.6: הגדר את כמות ההפקדה המרבית ל1,000 ומספר היעדים שבהם יש לפזר חלקיקים ל-1. שלב זה מבטיח שהתאים שיאספו יופקדו באותה צינורית במשך 1,000 פעמים.
  5. השתמש רק במצב האינטראקטיבי (מצב ידני) כדי לשלוט במדויק בשלב האיסוף ולשמור על פתרון שנאסף ללא תאי זיהום.
    הערה: אם נחוצים יותר מ-1,000 תאים, הגדל את מספר היעדים שבהם יש לפזר חלקיקים כדי להימנע מאובדן דגימה לאחר 1,000 תאים.
  6. המשך בשלבים של סעיף 4.26 כדי להתחיל באיסוף חדש. חזור על שלב 6 כדי לבצע ביצוע מרובים. הערות ביאורים למספר התאים שנאספו בכל אחד מהאוספים כדי לעקוב אחר מספר התאים הזמינים עבור הזרקת העכבר.
  7. בסוף הקטיף, צנטריפוגה את הצינור ב 72 x g עבור 4 דקות (ראה סעיף 3.1.) ו לאכול supernatant.
  8. השהה מחדש את CTCs שנאסף לתוך מאגר הבחירה, מתאים להזרקת העכבר. עבור הזרקת שומן החלב, השהה מחדש את CTCs שנאספו ביחס 1 עד 1 של 1x DPBS ו ממברנה מרתף מחולץ, ולשמור ב 4 ° c עד הזריקה. השהה מחדש את CTCs שנאסף ב-DPBS בלבד.
    הערה: נפח הפתרון תלוי רק במספר ה-CTCs שייזרק. מומלץ להזריק בתוך משטח שומן החלב או באופן מרבי מקסימום של 100 μL לכל עכבר. בעת חישוב עוצמת הקול, תמיד לשקול את הנפח מת עבור המניפולציה וטעינת המזרק.

תוצאות

זרימת העבודה המוצגת מאפשרת הכנת CTCs בודדים, בין CTCs יחיד או מופרדים מאשכולות CTC. CTCs מהחולים או הגידול הנושאת עכברים מועשרים מדם שלם עם שיטות CTC-העשרה זמין ולאחר מכן מוכתם עם נוגדנים נגד סמנים הקשורים לסרטן (למשל, EpCAM, ירוק) ו-WBC ספציפיים סמנים (למשל, CD45, אדום) (איור 1A

Discussion

האפיון המולקולרי של CTCs מחזיק בהבטחה לשפר את הבנתנו את התהליך הגרורתי ולהדריך את התפתחות הטיפולים החדשים נגד גרורות. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של הפרוטוקולים הללו המאפשרים CTC מיקרומניפולציה וניתוח במורד הזרם, כולל שניהם תא יחיד המבוסס על מבוססי תאים, ניתוח ביטוי גנים בהשתלה vivo עבור פ...

Disclosures

N.A. ו-עב מפורטים כממציאים ביישומי פטנטים המתייחסים למחזור תאי הגידול ולטיפול בסרטן. N.A. הוא יועץ בתשלום עבור חברות התרופות וביטוח עם עניין ביופסיה נוזלית.

Acknowledgements

אנו מודים לכל המטופלים שתרמו דם עבור המחקר שלנו, כמו גם כל קלינאים מעורבים ואחיות לימוד. אנו מודים לינס אברדט, בירק, ו ד ר קאטארינה Uhlig מ-ALS פתרונות מעבדה אוטומטיות GmbH לתמיכה רציפה. אנו מודים לכל חברי מעבדת Aceto למשוב ולדיונים. מחקר במעבדה Aceto נתמך על ידי מועצת המחקר האירופי, האיחוד האירופי, המדע הלאומי למדעים הלאומית, הסרטן השוויצרי ליג, באזל סרטן הליגה, שני הקנטונים של בזל דרך ETH ציריך, ואוניברסיטת בזל.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-human EpCAM-AF488Cell Signaling TechnologyCST5198clone: VU1D9
1X DPBSInvitrogen14190169no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plateCorning3471
Anti-human CD45-BV605Biolegend304041clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC GeneTexGTX11400clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488 Biolegend324410clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605Biolegend103139clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTABD366643for human blood collection
Cell CelectorALSCC1001core unit 
CellD softwareALSversion 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2R&D Systems3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTASarstedt41.3395.005for mouse blood collection
PCR tubesCorningPCR-02-L-C
RLT PlusQuiagen1053393
SUPERase  In RNase InhibitorThermo FisherAM2696 1 U/µL 

References

  1. Talmadge, J. E., Fidler, I. J. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Cancer Research. 70 (14), 5649-5669 (2010).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).
  4. Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review). International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).
  5. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  6. Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
  7. Pantel, K., Speicher, M. R. The biology of circulating tumor cells. Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).
  8. Hou, J. M., et al. Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).
  9. Long, E., et al. High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness. Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).
  10. Wang, C., et al. Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).
  11. Mu, Z., et al. Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).
  12. Zhang, D., et al. Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy. Cancer Cell International. 17, 6 (2017).
  13. Zheng, X., et al. Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer. Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).
  14. Chang, M. C., et al. Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).
  15. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  16. Cheung, K. J., et al. Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).
  17. Giuliano, M., et al. Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize. Cancer Research. 78 (4), 845-852 (2018).
  18. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, 33 (2016).
  19. Gkountela, S., et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding. Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).
  20. Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. , (2019).
  21. Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment?. Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).
  22. Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
  23. Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10 (9), e0138032 (2015).
  24. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
  25. Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147 (2013).
  26. Went, P. T., et al. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).
  27. Soysal, S. D., et al. EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer. British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).
  28. Yu, M., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
  29. Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
  30. Zheng, S., et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).
  31. Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved