قياس الإرشاد المنوي والحركية داخل الجهاز التناسلي المخنث

Summary

يجب ان السائل المنوي التنقل بنجاح من خلال القناة لتسميد البويضة. هنا ، نقوم بوصف فحص لقياس هجره السائل المنوي داخل الرحم خنثى. ويمكن لهذا الفحص ان يوفر بيانات كميه عن توزيع السائل المنوي داخل الرحم بعد التزاوج ، وكذلك عن سرعه الاتجاه الاتجاهي ، وتردد الانعكاس.

Abstract

الإخصاب الناجح هو أمر أساسي للاستنساخ الجنسي ، ولكن لا يعرف سوي القليل عن أليات التي توجه السائل المنوي إلى البويضات داخل الجهاز التناسلي الأنثوي. بينما في المختبر الدراسات تشير إلى ان السائل المنوي من التسميد الحيوانية داخليا يمكن ان تستجيب لمختلف العظة من المناطق المحيطة بها, عدم القدرة علي تصور سلوكهم داخل الجهاز التناسلي الأنثوي يخلق تحديا لفهم هجره النطاف والتنقل في بيئتها الاصليه. هنا ، ونحن وصف الأسلوب باستخدام c. اليجس التي تتغلب علي هذا القيد ويستفيد من البشرة الشفافة. C. وتزاوج الذكور اليجس الملونة مع صبغ الميتوكوندريا مع البالغين المخنثين ، والتي تعمل بوصفها الإناث المعدلة ، وإيداع فلوريسسينتلي المسمي السائل المنوي في الرحم خنثى. ويمكن بعد ذلك تعقب الهجرة وحركيه السائل المنوي المسمي مباشره باستخدام مجهر التحصين الموسع الفلوري في خنثى الحية. في البرية من نوع الحيوانية ، حوالي 90 ٪ من العنبر المسمي الزحف من خلال الرحم والوصول إلى موقع الإخصاب ، أو spermatheca. يمكن أخذ صور الرحم 1 ح بعد التزاوج لتقييم توزيع السائل المنوي داخل الرحم والنسبة المئوية للسائل المنوي التي وصلت إلى spermatheca. بدلا من ذلك ، يمكن ان تؤخذ الصور الفاصلة الزمنيه علي الفور بعد التزاوج لتقييم سرعه السائل المنوي ، وسرعه الاتجاه وتردد عكس. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة مع الاداات الوراثية والجزيئية الأخرى المتاحة لل c. اليجس لتحديد أليات الوراثية والجزيئية الجديدة التي هي مهمة في تنظيم توجيه السائل المنوي والحركية داخل الجهاز التناسلي الأنثوي.

Introduction

أليات الجزيئية التي تنقل النطاف (المشار اليها باسم السائل المنوي) من خلال الجهاز التناسلي الأنثوي نحو البويضة ليست مفهومه جيدا ، ولكنها أساسيه للاستنساخ الجنسي. حركيه السائل المنوي ديناميكية للغاية وتعتمد علي إشارات الاتصال القوية التي تغير سرعه السائل المنوي والحركية الاتجاهية^1،2،3،4،^{5،6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12}. c. وقد أصبحت ايليناليس نموذجا قويا لدراسة حركه النطاف في الجسم الحي لان البشرة الشفافة المخنثة تسمح بتتبع السائل المنوي المباشر في الخلية الواحدة القرار^{2,3, 8و10}. الغرض من هذه الورقة هو توفير طرق لتقييم حركه السائل المنوي داخل الرحم الخنثى المخنث.

في الأنواع الحيوانية حيث يلتقي السائل المنوي والبويضات في البيئة الخارجية (اي البيئات الملكية) ، تستجيب السائل المنوي للإشارات الكيميائية التي تفرزها البويضات. ترشد هذه الإشارات اتجاه حركه السائل المنوي ، وتقربها من مصدر الاشاره⁴،^6،11. ومع ذلك ، يعرف اقل بكثير عن حركه السائل المنوي في الأنواع التي تسميد داخليا. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية في هيكل الجهاز التناسلي للإناث ، الذي يتعذر الوصول اليه بالمجهر في معظم الأنواع. في المختبر الدراسات في البشر, الفئران, والخنازير, علي سبيل المثال, تقديم أدله علي ان السكان الفرعيين من السائل المنوي يمكن ان تستجيب لتشيمواتراكتانتس, تدفق السوائل, والتدرجات الحرارية^1,5,7,^{9, 12}-الآن مع هذه الانظمه ، وعدم القدرة علي تصور وتتبع حركه النطاف في الجسم الآخر يضع قيودا خطيره علي استراتيجيات لاكتشاف أليات الرئيسية التي تنظم هذه الوظائف.

للتغلب علي هذه القيود ، قمنا بتطوير أساليب باستخدام الديدان الخيطية c. اليجس لتصور مباشره السائل المنوي بعد التلقيح ، لقياس المعلمات الفردية الهجرة المنوية في الجسم المجري ، وقياس قدره السكان المنوية لاستهداف موقع الإخصاب. وتسهل هذه الأساليب ، بالاضافه إلى مجموعه أدوات الجزيئات والجينات الخاصة ب c. ، اكتشاف جزيئات الإشارات الكيميائية وآلات الجزيئية التي تنظم سلوكيات حركيه السائل المنوي. علي سبيل المثال ، يمكن اجراء الشاشات الجينية في المخنثين أو الذكور لتحديد الجينات الضرورية لحركه النطاف الفعالة في الجسم الحيوي¹³. يمكن حقن الجزيئات في الغدد التناسلية لاختبار التاثيرات علي تنشيط السائل المنوي ، وسرعه الهجرة ، والحركة الاتجاهية³. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام الطرق الموصوفة لمراقبه هجره النطفة المارقة إلى مواقع الجسم التي يتم الاستعانة بها في الرحم ولتقييم منافسه المني^10،14.

C. اليجانيين موجودة في الطبيعة كالمخنثين والذكور (انظر الشكل 1). الغدة التناسلية المخنثة لديها اثنين من الاسلحه علي شكل حرف U التي هي صور متطابقة لبعضها البعض. خلال المرحلة L4 يرقات ، والخلايا الجرثومية الأكثر القريبة (اي الخلايا بالقرب من spermatheca) الخضوع للسائل المنوي. كل الخلايا المنوية الاساسيه يدخل الانقسام الأول وتنتج أربعه النطاف المنوية. ويتم دفع هذه المبيدات المنوية إلى المبيدات المنوية إلى جانب البويضة الناضجة الاولي والخضوع لعمليات النطاف¹⁵. الكبار المخنثين التبديل من النطاف إلى التكوين. البويضات تنضج في خط التجميع الأزياء علي طول الغدد التناسلية ، مع البويضة الأكثر نضجا في نهاية القريب من الغدد التناسلية ، بجانب spermatheca. وهناك حاجه إلى إشارات MSP من السائل المنوي لتحريك نضوج ميوتيك والاباضه^16,17. من ناحية أخرى ، لدي الذكور c.اليجان ، علي شكل J الغدد التناسلية التي تنتج فقط السائل المنوي. يتم تخزين المبيدات المنوية في الحويصلة المنوية. عند التزاوج مع المخنثين أو الإناث ، والذكور ادراج كانسيلوس بالقرب من الذيل في الفرج. يتم تنشيط المبيدات المنوية اثناء القذف ، عندما تاتي في اتصال مع السائل المنوي¹⁸. C. السائل المنوي التي لا تسبح لأنها ليست ساريه. بدلا من ذلك ، فانها تزحف عبر الجهاز التناسلي ، وذلك باستخدام الكاذب للتنقل. ومن الثابت ان السائل المنوي الذكور ، والتي هي أكبر في الحجم ، لديها ميزه تنافسيه علي النطاف خنثى¹⁴.

في هذا الأسلوب ، والذكور c. اليجريس بمثابه المتبرع العنبر وتزاوج إلى hermaprhodites الكبار. الذكور البالغين ملطخه بصبغه الميتوكوندريا الفلورية لإنتاج السائل المنوي المسمي. وبمجرد إيداعه من خلال الفرج المخنث ، يجب ان يزحف السائل المنوي حول الاجنه في الرحم نحو النطاف ، أو موقع الإخصاب. البشرة الشفافة للنموذج c. اليجس يسمح للتصور المباشر لكل السائل المنوي الفردية كما انه يتنقل من خلال الجهاز التناسلي الأنثوي. في السنوات الاخيره ، استخدم معملنا بنجاح هذه الطريقة لإثبات اهميه فئة F-سلسله بروستاغلينات في توجيه السائل المنوي من الفرج إلى spermatheca^19،20. الميكانيكية الجزيئية التي تنظم تخليقها من قبل خنثى والاستجابة من قبل السائل المنوي لا تزال قيد التحقيق. ومع ذلك ، فان هذه الطريقة لتقييم حركيه السائل المنوي والهجرة تسهل بشكل كبير تحديد اللاعبين الرئيسيين الذين يتحكمون في السائل المنوي والاتصال بالبويضات في التسميد الداخلي للحيوانات. يصف البروتوكول التالي خطوه بخطوه كيفيه اجراء هذا الفحص.

Protocol

ملاحظه: يتم تنفيذ كافة الخطوات في هذا البروتوكول في درجه حرارة الغرفة (~ 20-22 درجه مئوية) أو في حاضنات درجه حرارة ثابته تعيين إلى 16 درجه مئوية أو 20 درجه مئوية. وتزرع الذكور وخنثى c. اليجان باستخدام ظروف الثقافة القياسية و NA22 أو OP50 e. القولونية كمصدر للغذاء^21,22. البرية من نوع N2 المخنثين والضباب-2 (q71) وتستخدم الذكور في الاجراء أدناه.

1. اليوم 1: اختيار L4 المرحلة المخنثين للتزاوج

1. للحصول علي نتائج متناسقة ، يجب مزامنة جميع المخنثين بشكل نشط لأعاده إنتاج البالغين. اختيار 20-30 L4 المرحلة المخنثين إلى 6 سم البذور الخيطية المتوسطة النمو (NGM) لوحه. احتضان الخنثى في 20 درجه مئوية ل 28-30 ساعة.
   ملاحظه: فقط 12-15 سيتم استخدام المخنثين للتزاوج. ال [هرثروتس] متبقي فائضه.

2. اليوم 1: تلطيخ الذكور مع صبغ الميتوكوندريا الفلورسنت (ميتو صبغ)

1. جعل لوحه تلطيخ الذكور عن طريق وضع نقطه من e. كولاي (نقطه الغذاء) في وسط لوحه ngm غير مصنفه. لجعل نقطه الغذاء ، واستخدام نهاية الزجاج التحريك قضيب لكشط e. كولاي من البكتيريا في الحديقة من لوحه المصنفة وإيداعه علي لوحه غير مصنفه. يجب ان تكون النقطة ~ 5-7 مم في القطر.
2. مزيج معا 2 μL من 1 ملم ميتو صبغ (انظر جدول المواد) في dmso و 10 μl من مسنومكس العازلة (3 غرام من خ₂بو₄، 6 غرام من Na₂hpo₄، 5 غرام من كلوريد الصوديوم ، 1 مل من 1 م mgso₄، H₂O إلى 1 L. أضافه mgso₄ بعد الاوتوكلاف). ماصه كل من المحلول ميتو صبغ علي نقطه الطعام علي لوحه تلطيخ الذكور. السماح لصفيحه جافه في الظلام (~ 30 دقيقه).
   ملاحظه: ميتو صبغ حساس للضوء. درع كل الحل ، لوحات ، والديدان التي تحتوي علي ميتو صبغ من الضوء. تخزين 1 مم الأسهم في-20 درجه مئوية.
3. اختيار ~ 100 1-3 اليوم البالغ من العمر الذكور²³ إلى ميتو صبغ نقطه الطعام الملون علي لوحه تلطيخ الذكور. التفاف لوحه في رقائق ألومنيوم واحتضان بين عشيه وضحيها في 16 درجه مئوية. للتزاوج, استعملت ~ 50-60 ذكريه لكل 12-15 [هرثرويتس]. إذا كان هناك حاجه إلى أكثر من ~ 100 الذكور ، وجعل لوحات تلطيخ أكثر لمنع اكتظاظ الذكور.
   ملاحظه: ويمكن أيضا ان الذكور ملطخه بالاحتضان في 10 μM ميتو صبغ محلول في العازلة مسنومكس لمده 3 ساعات علي زجاج الساعة. الحفاظ علي الديدان مغطاه لمنع التبخر والتعرض للضوء. بعد 3 ساعات ، استخدم ماصه pipet-x باستور لنقل الذكور إلى لوحه NGM المصنفة بعشره سم. نقل اقل قدر ممكن من محلول ميتو صبغ. التفاف لوحه في رقائق ألومنيوم واحتضان بين عشيه وضحيها في 16 درجه مئوية.

3. اليوم الثاني: التزاوج

1. اختيار الذكور الملون من اليوم 1 علي لوحه جديده ، NGM المصنفة. اترك الصحن في الظلام حتى التزاوج. تضمن هذه الخطوة أزاله البكتيريا الملطخة بصبغ الميتين الزائدة حول الذكور. يمكن المرحل من البكتيريا الملونة ميتو صبغ المفرطة علي لوحه التزاوج وصمه عار الانسجه خنثى.
2. جعل لوحه التزاوج عن طريق إسقاط 2 μL من خليط e. كولاي سميكه علي لوحه ngm غير المصنفة. السماح للبكتيريا سميكه الجافة لجعل نقطه التزاوج. سيتم نقل الذكور والمخنثين إلى هذه النقطة للتزاوج. لجعل القولونية سميكه ، تدور أسفل 3 مل من بين عشيه وضحيها e. القولونية وأعاده تعليق البكتيريا بيليه في 1 مل من مسنومكس. ويمكن تخزين هذا الخليط في 4 درجه مئوية وأعاده استخدامها لمده تصل إلى 6 أشهر.
   ملاحظه: ويمكن تعديل سمك الحل e. كولاي . إذا كان الحل رقيقه جدا ، والذكور قد الزحف بعيدا عن نقطه التزاوج بدلا من تجميع عليه للتزاوج. التزاوج النقاط المصنوعة من e. القولونية حلول التي سميكه جدا قد يقلل من كفاءه التزاوج.
3. في حين ان لوحه التزاوج من الخطوة 3.2 هو التجفيف ، وتخلط معا 300 μL من 1 ٪ (ث/ف) Tricaine (ثلاثي) ، 300 μL من 0.1 ٪ (ث/ف) تيترايسوزول (تيت) ، و 900 μL من مسنومكس.
   ملاحظه: تخزين 1 ٪ (ث/الخامس) Tricaine و 0.1 ٪ (ث/ف) تيترايسوزول كما الاقتباسات في-20 درجه مئوية. تجنب الذوبان المتكرر للتجميد.
4. نقل 600 μL من الحل تيت/تراي إلى زجاج الساعة.
5. نقل 12-15 الخنثى اختار في اليوم 1 إلى الحل Tet/تراي في زجاج الساعة. احتضان لمده 30 دقيقه لشل الخنثى. الحفاظ علي الزجاج ووتش مغطاه لمنع الحل Tet/ثلاثي من التبخر.
   ملاحظه: من المهم ان يتم تخدير المخنثين لمده لا تقل عن 30 دقيقه. وقت اقل يمكن ان يؤدي إلى دوده متحركة اثناء اكتساب الصورة ، والتي يمكن يزعج مع التصوير.
6. في حين يتم احتضان المخنثين ، واختيار 50-60 الذكور الملون من الخطوة 3.1 علي نقطه التزاوج (الخطوة 3.2). تخزين لوحه في الظلام حتى الخطوة 3.8.
7. بعد الحضانة 30 دقيقه في الحل تيت/تراي ، استخدم الزجاج باستير ماصه pipet-x لنقل المخنثين غير المعباه من الزجاج ووتش علي لوحه NGM غير مصنفه. أزاله السائل قدر الإمكان والسماح للسوائل الزائدة الجافة.
   ملاحظه: لا تدع المخنثين الجافة بشكل مفرط. بمجرد تبخر جميع السائل مرئية ، تبدا الخطوة التالية.
8. نقل الخنثى التخدير من لوحه NGM غير مصنفه علي نقطه التزاوج مع الذكور الملطخة. احتضان في الظلام لمده 30 دقيقه للسماح للذكور لزميله مع المخنثين.
9. بعد التزاوج لمده 30 دقيقه ، جبل المخنثين فورا للتصوير الفاصل الزمني أو نقل الخنثى علي لوحه NGM جديده المصنفة للراحة لمده 1 ساعة قبل التصوير.
   ملاحظه: وتستخدم أشرطه الفيديو الفاصلة الزمنيه من الرحم خنثى لقياس سرعه السائل المنوي والتردد عكس. يتم استخدام الصور الثابتة للرحم الماخوذه من 1 ساعة بعد التزاوج لقياس توزيع السائل المنوي أو توجيه spem.

4. اليوم 2: تصاعد الديدان لتصور

1. إنشاء لوحه تصاعد مع 2 ٪ اجنشا في ح₂س
   ملاحظه: يمكن اجراء 2 ٪ اجنشا في السائبة ، ونقلت إلى أنابيب اختبار الزجاج ، وتخزينها في 4 درجه مئوية. عند الحاجة ، يمكن ميكرووافيد كل قسامه قبل كل استخدام وتخزينها في كتله الحرارة لمنعه من ترسيخ.
   1. لجعل لوحه المتصاعدة ، محاذاة ثلاثه الشرائح المجهر الزجاجي جنبا إلى جنب مع لمس حواف طويلة. ضع قطعتين من شريط الإخفاء فوق بعضهما البعض علي كل من الشرائح الخارجية. هذه الشرائح الزجاجية الخارجية مع الشريط سيكون بمثابه الدعم بحيث سمك اللوحة الناتجة اجبرز سيكون "اثنين من الشريط العميق".
   2. مكان ~ 75 μL من ذاب 2 ٪ اجنشا علي الشريحة المركزية (وهذا هو الشريحة بدون شريط). وضع علي الفور الشريحة المجهر الزجاجي الجديد علي راس الاجثار. يجب ان تكون هذه الشريحة الزجاجية العلوية متعامدة مع الشرائح الأخرى ، مع كل نهاية يستريح علي شريط الشرائح الدعم اثنين.
   3. السماح لل الاغاروزها تتصلب (~ 30 s). قم بازاله الشريحة الزجاجية العلوية بعناية عن طريق تحريكها من اللوحة التي تم التخلص منها.
2. وضع 10-15 μL من الحل تيت/تراي علي 2 ٪ لوحه اجبرزت. نقل المخنثين تزاوج علي وساده. اعتني بنقل البكتيريا الصغيرة قدر الإمكان.
3. وضع زلة الغطاء فوق الديدان علي وساده اجبرزت.

5. اليوم الثاني: اعداد اكتساب الصور

ملاحظه: ويمكن استخدام اي النطاق الخاطئ تستقيم مجهزه بالتحصين-فلوري ، 10x و 60x الأهداف ، وكاميرا رقميه للحصول علي الصور لتوزيع السائل المنوي. البرمجيات القادرة علي الحصول علي الصور المنقضية زمنيا مطلوبه لتقييم سرعه السائل المنوي ، وسرعه الاتجاه ، وتردد الانعكاس.

1. صوره الاستحواذ 1 ح بعد التزاوج
   1. جبل الشريحة علي مرحله المجهر. ننظر من خلال قطع العين لمسح الديدان علي وساده اجبرز باستخدام الهدف 10x مع فلتر الانبعاثات الأحمر فلوري (فلتر TRITC). مره واحده وقد تم العثور علي دوده ، بدوره لفتره وجيزة علي ضوء مضان لمعرفه ما إذا كان الدودة قد تزاوج. إذا كان السائل المنوي مرئيا داخل الرحم ، فقم بالتبديل إلى هدف 60x.
      ملاحظه: الضغط الذي تم إنشاؤه بواسطة الهدف 60x علي كوفيرسليب قد يضر بعض الديدان الهشة ، مما تسبب في الأمعاء أو الغدد التناسلية لقذف من الحيوانية. المسح الضوئي لتزاوج ناجحه باستخدام الهدف 10x يمكن ان تقلل من التعرض الديدان للضغط المضافة. لا تعرض الديدان التزاوج لفترات ممتدة من ضوء الفلورسنت.
   2. باستخدام المجهر التفاضلي تباين التداخل (DIC) ، ضع الدودة بحيث يتم عرض كل من الفرج و spermatheca واحد. التركيز علي الصورة من خلال التركيز علي مركز spermatheca. تحقق من التعرض لكل من قنوات DIC و TRITC. في DIC ، يجب ان تكون هياكل الدودة الداخلية مرئية بوضوح. في TRITC ، يجب ان تكون النطاف الفردية مرئية كثقوب مميزه.
      ملاحظه: يجب ان تلتقط كل صوره الرحم من الفرج إلى واحده من النطاف. إذا كان الرحم طويلا جدا لاحتواءه علي صوره واحده ، يمكن التقاط صورتين منفصلتين. وليس من الضروري ان تؤخذ جميع الصور في نفس مستوي التعرض. ومع ذلك ، من المهم ان السائل المنوي الفردي يمكن تمييزه وتحديده كميا في الصور الفلورية.
   3. الحصول علي الصور DIC والفلورية لكل الرحم.
   4. كرر الخطوات 5.1.1-5.1.3 حتى تم الحصول علي جميع المخنثين تزاوج.
2. التقاط مقاطع فيديو بفواصل زمنيه
   1. افحص اللوحة التي تم العثور عليها وحدد موقع الخنثى التي تحتوي علي السائل المنوي المسمي داخل الرحم ، كما هو موضح في الخطوة 5.1.1 و 5-1-2
   2. تكوين البرنامج للحصول علي الصور الفاصلة الزمنيه في القناات DIC و TRITC. عموما ، يتم التقاط الصور الفاصلة الزمنيه علي فترات 15-30 s لمده 10-20 دقيقه لكل رحم.

6-القياس الكمي

1. القياس الكمي لتوزيع النطاف علي صور الرحم الماخوذه 1 ساعة بعد التزاوج
   1. بدءا من الفرج علي طرف واحد والنطاف من ناحية أخرى ، تقسم الرحم إلى الثلثين. ستمثل هذه المناطق الثلاثة. تحتوي المنطقة 1 (Z1) علي الفرج والمنطقة 3 (Z3) تحتوي علي spermatheca.
   2. عد يدويا عدد السائل المنوي داخل كل ثلث من الرحم ، والإبلاغ عن الرقم في كل منطقه كنسبه مئوية من إجمالي السائل المنوي في الرحم بأكمله. ويرد أدناه مثال علي ذلك.
      
      ملاحظه: في بعض الأحيان ، يجب تعديل شده الاشاره لصوره قناه TRITC بحيث يمكن ان تكون كل النطاف التي تم التقاطها في الصورة مرئية ومحدده كميا.
2. تتبع السائل المنوي في صور الفاصل الزمني
   ملاحظه: في هذه الورقة ، استخدمنا البرمجيات NIS-عناصر للتحليل. في الأقسام أدناه ، نعطي تعليمات لتتبع السائل المنوي يدويا باستخدام هذا البرنامج (الخطوة 6.2.1) وكذلك برنامج المصدر المفتوح ImageJ/فيجي (الخطوة 6.2.2).
   1. تتبع السائل المنوي مع عناصر NIS
      1. افتح الملف nd2 مع سلسله الفاصل الزمني التي سيتم تعقبها. للبدء في التتبع ، افتح لوحه التتبع عن طريق النقر بزر الأيمن في البرنامج واختيار عناصر التحكم في التحليل | التعقب.
      2. في لوحه التتبع ، حدد تعريف عائد الاستثمار الجديد. حدد كل منطقه من مناطق الاهتمام (ROI) بالنقر فوق كل السائل المنوي الذي سيتم تتبعه. ستظهر علامة ملونه علي السائل المنوي المحدد. انقر فوق إنهاء عند تحديد كافة rois.
      3. وبمجرد التعرف علي ROIs ، انتقل إلى الإطار التالي في سلسله الفاصل الزمني. اسحب علامة عائد الاستثمار إلى الموضع الجديد لنطفه في الصورة. استمر في القيام بذلك حتى لا يمكن تعقب السائل المنوي بعد الآن. ستظهر الخطوط المنقطة التي تربط كل موقع من المواقع التي تم وضع علامة ROI من خلال جميع إطارات الصورة الفاصلة الزمنيه.
         ملاحظه: يجب ان يتم تعقب السائل المنوي فقط في المنطقة 2 كالسائل المنوي في المناطق 1 و 3 تميل إلى التحرك في نمط دائري حتى في البرية من نوع الحيوانية.
      4. تصدير جميع البيانات القابلة للقياس الكمي (علي سبيل المثال ، طول المسير ، والوقت ، وموضع XY ، وما إلى ذلك) من السائل المنوي المتعقب إلى مستند Excel بالنقر فوق تصدير في لوحه التتبع.
   2. تتبع السائل المنوي مع فيجي
      1. تحويل صور قناه TRITC في سلسله الفاصل الزمني إلى ملفات .tif. حفظ كافة الملفات من سلسله واحده في مجلد واحد.
      2. استيراد الصور إلى فيجي باستخدام داله الاستيراد بيوتنسيق. استيراد الصور من سلسله ذات فاصل زمني واحد كمكدس زائد واحد.
      3. فتح TrackMate في فيجي²⁴ عبر الإضافات | التتبع | تتبع يدوي مع TrackMate. سيتم فتح مربع دياجلوجوي.
      4. حدد أداه TrackMate في شريط أدوات فيجي. انقر نقرا مزدوجا فوق السائل المنوي الذي سيتم تعقبه. ستظهر دائره خضراء ذات خطوط متقطعه. قد يتم وضع هذه الدائرة من خلال النقر داخل الدائرة والسحب إلى الموضع المطلوب. قد يتم تغيير حجم هذه الدائرة عن طريق الضغط في نفس الوقت علي مفتاح ALT وتمرير الماوس.
      5. مره واحده وقد تم تعيين حجم وموضع تعقب ، انقر علي الدائرة مره أخرى. ستتحول الخطوط الخضراء المتقطعة إلى خط اخضر صلب. في وقت واحد ضرب التحول ومفاتيح L لتشغيل وضع التتبع. سيتم الاشاره إلى ذلك في شريط الاداات فيجي.
      6. الانتقال إلى الإطار التالي في سلسله الفاصل الزمني. لتعيين الموقع الجديد لنطفه المتعقبة في الإطار الجديد ، مرر الماوس فوق النقطة الجديدة واضغط علي المفتاح A . سيظهر المتعقب الآن في الموقع الجديد ، سيظهر خط يربط المواقع التي تم وضع المتعقب فيها في الإطارات السابقة.
      7. بعد اكتمال التتبعات ، انقر فوق تحليل في مربع الحوار trackmate لإنشاء البيانات المطلوبة.
   3. لحساب السرعة ، تقسيم طول المسار الإجمالي لنطفه بحلول الوقت المنقضي.
   4. لحساب السرعة الاتجاهية ، ارسم خطا من خلال الرحم بدءا من الفرج لافتا نحو النطاف. قياس المسافة التي هاجرت السائل المنوي علي طول هذا الخط من البداية إلى نهاية التتبع. تقسيم هذه المسافة بالوقت المنقضي. تشير القيم السالبة إلى ان السائل المنوي قد هاجر بعيدا عن النطاف.
   5. لتسجيل تردد الانعكاس ، عد عدد المرات التي ولد فيها تتبع السائل المنوي زاوية اقل من 90 درجه مئوية خلال ثلاثه إطارات متتابعة متتالية للوقت.

النتائج

لتوليد النتائج المبينة في هذه الورقة ، كان الضباب-2 (q71) الذكور ملطخه بصبغ ميتو وتزاوج إلى النوع البري ، المخنثين N2. ويقدم الشكل 2 مخططا عاما للأسلوب ، بما في ذلك اعداد الدودة ، والتزاوج ، والتحليل. كما يظهر الفيلم 1 ، الجهاز التناسلي للكبار المخنثين لديه اثنين من الاسلحه التي هي مراه الصور من بعضها البعض. عند التزاوج ، يتم إيداع السائل المنوي المسمي في الرحم المخنث من خلال الفرج. يتحرك السائل المنوي حول الاجنه النامية داخل الرحم باتجاه النطاف ، حيث يتم تخزينها حتى الإخصاب. كما الخلايا الجرثومية في خنثى الكبار تتطور إلى البويضات ، يتم دفع القريبة ، البويضة الأكثر نضجا في spermatheca عن طريق الانقباضات الخلية غمد. الإخصاب يحدث في حين ان البويضة في spermatheca.

لقياس توزيع السائل المنوي والهجرة من خلال الجهاز التناسلي الأنثوي ، ينقسم الرحم المخنث إلى ثلاث مناطق (الفيلم 1 ، الشكل 3 ا). المنطقة 1 تمتد علي الثلث الأول من الرحم ، بدءا من الفرج. وتمتد المنطقة الثانية إلى الثلث الأوسط من الرحم ، وتمتد المنطقة الثالثة إلى الثلث الأخير من الرحم وتشمل المبيد المنوي. توجيه السائل المنوي السليم باستخدام نوع البرية ، N2 الخنثى والضباب -2 (q71) الذكور ينبغي ان يؤدي إلى حوالي 90 ٪ من السائل المنوي المسمي الوصول إلى spermatheca ، أو المنطقة 3 (الشكل 3b).  Matings التي تؤدي في عدد قليل جدا (الشكل 3C، اقل من 10-15 السائل المنوي) أو كثيره جدا (الشكل3c، الرحم مليئه السائل المنوي) النطفة في الرحم لا ينبغي ان تحسب. في تزاوج التي تؤدي إلى اقل من 10-15 السائل المنوي ، 3-4 السائل المنوي المارقة قد انحراف البيانات بشكل كبير. المثل ، عندما يتم ملء الرحم تماما مع السائل المنوي ، لا يمكن لنطفه الهجرة بشكل مناسب. قد يبدو السائل المنوي متناثرا في جميع انحاء الرحم من بعض المسوخ التي تعرض النمط الظاهري الفقراء توجيه السائل المنوي. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، يجب ان لا تملا السائل المنوي كل صرير الرحم ، كما راينا في الشكل 3D. ويعتبر القياس الكمي لكل ذراع من الغدد التناسلية عينه واحده ، أو واحده ن.

وتؤخذ الصور الفاصلة الزمنيه لقياس سرعه السائل المنوي وتردد الانعكاس. يجب ان يتم تتبع السائل المنوي فقط في المنطقة 2 (الشكل 4A) لان السائل المنوي في المناطق 1 و 3 (الفيلم1) يميل إلى التحرك في نمط دائري حتى داخل الحيوانية من النوع البري. الوقت-laspe الصور التي اتخذت علي فترات 15-30 s وعاده ما تستخدم لتتبع السائل المنوي. يتم تحديد كميه السائل المنوي فقط التي يمكن اتباعها في إطارات متتالية لأكثر من 2.5-3 دقيقه. في الشكل 4B-M، فان السائل المنوي الذي يتميز بالنقاط الحمراء والزرقاء يستوفي هذا المعيار ، في حين ان السائل المنوي الذي تميزه النقطة الخضراء لا. ولذلك ، فان القيم المحددة في الشكل 4N يتم قياسها كميا بالنسبة للمني الذي تميزت به النقاط الحمراء والزرقاء (الشكل4n) ، في حين لم يتم تحديد كميات تلك الخاصة بالسائل المنوي الموسوم بالنقطة الخضراء.

الشكل 1: الرسوم الكاريكاتورية للكبار c. الفاسقات خنثى والذكور. وتصنف الهياكل التناسلية الرئيسية في هذا الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: رسم تخطيطي لاعداد العينات والحصول علي البيانات. وتزاوج الذكور الملطخة بصبغ ميتو لمتزامنة البالغين المخنثين. تؤخذ الصور الفاصلة الزمنيه لتزاوج الخنثى علي الفور بعد التزاوج للتقاط البيانات للسرعة المنوية وتردد الانعكاس. تؤخذ الصور الثابتة لتزاوج المخنثين 1 ح بعد التزاوج لتقييم توزيع السائل المنوي داخل الرحم. راجع النص للحصول علي مزيد من التفاصيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: القياس الكمي لتوزيع السائل المنوي داخل الرحم المخنث. (ا). التخطيطي لل c. الفاسقات الرحم خنثى. V = الفرج ، E = الجنين ، S = spermatheca ، O = البويضة ، Z1-Z3 = المناطق 1-3 المستخدمة لقياس توزيع السائل المنوي. (ب-د). اندمجت DIC + TRITC (اللوحات اليسرى) و TRITC فقط (لوحات الحق) صور من البرية من نوع خنثى الرحم 1 ح بعد التزاوج إلى الضباب-2 (q71) الذكور ملطخه بصبغ ميتو. تظهر السائل المنوي احمر. الخطوط العريضة الصفراء تشير إلى موقع spermatheca. شريط المقياس: 20 μm. Z1 ، Z2 ، Z3 التحديد الكمي في B تمثل النسبة المئوية في المئة السائل المنوي في كل منطقه ± الانحراف المعياري. الصور في c و D تمثل تزاوج التي أسفرت عن عدد قليل جدا (ج) أو كثيره جدا (د) السائل المنوي للقياس الكمي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: قياس سرعه السائل المنوي وتردد الانعكاس اثناء الهجرة عن طريق الرحم. (ا). DIC + tritc صوره مدمجه من الرحم خنثى التي تحتوي علي السائل المنوي الفلورسنت (الأحمر). V = الفرج ، الأصفر = spermatheca ، Z1-Z3 = ثلاث مناطق من الرحم ، الصندوق الأسود: المنطقة 2. (B-M). الفاصل الزمني الصور قناه TRITC التكبير في المنطقة 2 (المربع الأسود في A). تم الحصول علي الصور علي فترات 20 ثانيه. تم تتبع 3 النطفة الفردية في كل صوره (الأحمر والأخضر ، والنقاط الزرقاء). النقاط الملونة في لوحه M يمثل مسار كل السائل المنوي من B-L. شريط مقياس = 20μm. (ن). المعادلات والتعاريف للسرعة المنوية ، وسرعه ناقلات وتردد عكس. (س). السرعة ، ومعدل سرعه الموجات وعكس تردد السائل المنوي تتبع في لوحات B-L بالنقاط الحمراء والزرقاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1: فيلم من حركه السائل المنوي والهجرة. وقد تزاوج النوع الوحشي خنثى إلى الضباب-2 (q71) الذكور ملطخه بصبغ ميتو. الفيلم هو مركب من الصور الفاصلة الزمنيه التي اتخذت في فترات زمنيه مختلفه. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

Discussion

قدره السائل المنوي علي التنقل في المسالك التناسلية الانثويه الملتوية والعثور علي البويضات أمر بالغ الاهميه للاستنساخ الجنسي. تشير الدراسات الحديثة باستخدام السائل المنوي للحيوانات المخصبة داخليا إلى انها تستجيب بنشاط للإشارات البيئية المختلفة ، بما في ذلك الإشارات الكيميائية وتدفق السوائل وتدرجات درجه الحرارة^{1و5و7 9 , 12}-بيد ان هذه الملاحظات نتجت إلى حد كبير عن التجارب المختبرية ولم يعرف سوي القليل عن سلوك النطاف والاتصالات داخل الجهاز التناسلي. ومن العوائق الرئيسية التي تحول دون الحصول علي البيانات المجرية عن هجره السائل المنوي وحركيته انعدام الرؤية في معظم المناطق الانجابيه للإناث. الطريقة التي وصفناها هنا باستخدام c. اليجس يتغلب علي هذا القيد. كما تظهر النتائج التمثيلية ، فان البشرة الشفافة تسمح بالتصور المباشر وتتبع كل السائل المنوي عند دقه الخلية الواحدة في كائن حي وسليم.

جيم- اليجان له جنسان. الذكور ، مع النمط الجيني XO ، تنتج فقط السائل المنوي ، وفي هذا الأسلوب ، وتستخدم كمتبرعين العنبر. المخنثين ، مع النمط الجيني XX ، يتم تعديل الإناث. الغدد التناسلية الخاصة بهم الخضوع لأول مره النطاف خلال مرحله اليرقات الرابعة والتحول إلى oogenesis في سن الرشد²⁵. يستخدم هذا الفحص المخنثين الكبار ، الذين توفر الانسجه الانجابيه نموذجا للجهاز التناسلي الأنثوي. استخدام كلا الجنسين في هذا الفحص يسمح لنا لتحديد المسارات الوراثية والجزيئية في كل من الذكور والإناث التي قد تنظم توجيه السائل المنوي والحركية. بالاضافه إلى المجموعة الكاملة من التقنيات الوراثية والجزيئية المتاحة ل c. اليجايليس، يمكن ان يؤدي هذا الأسلوب إلى رؤى جديده في هجره المني وحركيته وكذلك السائل المنوي والاتصال بالبويضات.

وهناك بضع خطوات حاسمه في هذا البروتوكول تستدعي مزيدا من النظر ، بالاضافه إلى التفاصيل الواردة في القسم الخاص بالبروتوكول.

الديدان
الضباب-2 (q71)، وهو-5 (e1490)، أو له-8 (e1489) الذكور متحولة يمكن استخدامها بدلا من الذكور N2. هذه الطفرات زيادة وتيره الذكور في الثقافات ، ولكن لا تؤثر علي التزاوج الذكور أو وظائف العنبر¹³. الإناث ، مثل الضباب-2 (q71) الإناث ، ويمكن استخدامها بدلا من المخنثين. ومع ذلك ، يجب ان تكون الإناث قبل تزاوج مع الذكور للسماح التنمية البويضة السليمة. ان وجود الاجنه المخصبة من هذا التزاوج المسبق يضمن أيضا ان الرحم طويل بما يكفي لتقييم توزيع السائل المنوي بشكل صحيح. إذا تم تقييم متحولة أو الخنثى التجريبية ، وتشمل مجموعه (ق) السيطرة. علي سبيل المثال ، يجب ان يقترن متحولة المخنثين مع النوع الوحشي N2 المخنثين كعنصر تحكم للمتغيرات الأخرى في الفحص. وينبغي أيضا ان تغذي البكتيريا التي تم تغذيتها بالبكتيريا التي تحتوي علي البلازميدات لاختبارات تداخل الحمض الريبي النيبالي ببكتريا تحتوي علي مكافحه النواقل الفارغة. المسافة من الفرج ، حيث يتم تلقيح السائل المنوي ، إلى spermatheca ، موقع الإخصاب ، يمكن ان تختلف تبعا لعدد البيض في الرحم (اي ، الرحم يتوسع مع زيادة عدد البيض). إذا تم اجراء مقارنات بين الأنماط الجينية ، حدد المخنثين الذين تحتوي الرحم علي اعداد مماثله من البيض. لا تقم بتحديد الخنثى التي تحتوي علي أجنه الفقس أو اليرقات المتحركة. ويمكن القيام بدوره زمنيه لتحديد العمر الأمثل الذي يجب ان يكون فيه المخنثين.

انتقاء المخنثين والذكور
ومن المهم ان المخنثين التقطت لهذا الفحص ليست من لوحات متضخمة أو تجويع. الغذاء والعظة فرمون تعدل التعبير عن DAF-7 ، وهو TGFß homolog. وقد أظهرت المسار DAF-7 تنظيم تخليق السلسلة F-البروستاغلينات التي تلعب دورا هاما في توجيه السائل المنوي إلى spermatheca²⁰. قد يؤدي قطف المخنثين من الصفائح المكتظة أو المتعطشة إلى عدم توجيه السائل المنوي الضعيف المرتبط بهدف الاهتمام. كثافة لوحات لا يبدو ان تؤثر علي السائل المنوي الذكور. ومع ذلك ، فان الذكور الذين هم صغار جدا أو كبار السن قد يؤدي إلى انخفاض كفاءه التزاوج (اي النسبة المئوية من الخنثى علي لوحه التزاوج التي لديها ما يكفي من السائل المنوي في الرحم لقياس). 1-3 الذكور البالغين من العمر اليوم هي الأمثل لهذا الفحص²³.

تخدير المخنثين
في ايدينا ، والجمع بين تيترايسوزول و Tricaine يضمن ان يتم تعبئة الديدان ، وتبقي علي قيد الحياة اثناء التزاوج واكتساب الصورة. ويمكن أيضا استخدام التخدير الأخرى ، مثل الصوديوم الأزيد. ومع ذلك ، فان أزيد الصوديوم شديد السمية ويجب توحيد الظروف. لا ينصح بتقنيات التعبئة باستخدام الخرز المجهري ، والحجرات الصغيرة ، وغرف ميكروفلويديكس لأنها تتداخل مع التزاوج.

الذكور تلطيخ
وقد استخدمت لصبغ ميتو المستخدمة في هذه المخطوطة ، MitoTrackerCMXRos ، علي نطاق واسع لوضع العلامات المنوية ، فضلا عن الميتوكوندريا الأخرى ، في c. اليجايليس. السائل المنوي المسمي مع هذا ميتو صبغ يعمل بشكل كامل ، والحفاظ علي قدرته علي تنشيط ، والهجرة ، تسميد البويضات ، وإنتاج ذريه قابله للحياة^26،27. وقد استخدمت الاصباغ الميتوكوندريا الأخرى, مثل رونامامين 6g و DiOC6 لوصمه العار c. اليجس الميتوكوندريا^28,29. ومع ذلك ، الشروط لهذه الاصباغ تحتاج إلى ان تكون موحده لوضع العلامات المنوية في هذا الفحص. بالاضافه إلى أليات الوسم mitochrondrial ، والبقع الحمض النووي ، مثل Syto17 ، ويمكن أيضا ان تستخدم لتسميه السائل المنوي لاختبارات الهجرة³⁰. في حين ان هذه التقنيات الوسم هي سهله نسبيا وسريعة لأداء, ويمكن أيضا ان تستخدم استراتيجيات المحورة وراثيا لتوليد السائل المنوي التي تعبر عن علامات الفلورسنت تحت المروجين محدده^31,32.

التزاوج
التزاوج النقاط التي هي سميكه جدا قد يقلل من كفاءه التزاوج. وينبغي توخي الحذر لنقل البكتيريا الصغيرة قدر الإمكان عند نقل الذكور وتخدير المخنثين علي نقطه التزاوج.

جعل منصات اجثار ووضع زلة الغطاء
فقاعات الهواء يمكن ان تتولد في منصات اجبرزت. وقد ينكسر الضوء اثناء الحصول علي الصورة أو ، عندما يكون كبيرا بما فيه الكفاية ، يتسبب في سقوط الديدان ، مما يجعل من المستحيل الحصول علي الصورة (الصور). المثل ، قد يتم إنشاء فقاعات الهواء علي طول الخنثى عندما يتم وضع زلة الغطاء عليها علي وساده اجبرزت. هذه الفقاعات ينكسر الضوء ويؤدي إلى انخفاض جوده الصورة. الممارسة سوف تساعد علي تقليل حدوث فقاعات الهواء.

التحديد الكمي
عند التحديد الكمي لتوزيع السائل المنوي ، قد يكون لمختلف الطائرات z من خلال رحم الدودة اختلافات طفيفه في توزيع السائل المنوي. نجد ان أخذ صوره واحده تركز علي spermatheca يعطينا نتائج قابله للتكرار مشابهه للنتائج التي تم الحصول عليها من خلال المتوسط عده أقسام z. نوصي بتركيز الصورة علي مركز الspermatheca ، ولكن يمكن تغيير الطائرات المحورية قليلا استنادا إلى احتياجات المجرب. بيد انه من الاهميه بمكان ان تؤخذ جميع الصور بنفس الطريقة. وعلاوة علي ذلك ، من المهم ان يتم احتساب فقط السائل المنوي التي هي في التركيز. انها السلطة التقديرية المضادة في تحديد معايير السائل المنوي في التركيز. غير انه من الاهميه بمكان ان تطبق المعايير بصوره منهجيه علي كل دوده يتم تحديدها كميا. لتتبع النطفة ، والعديد من البرامج توفر قدرات التتبع التلقائي. ومع ذلك ، نجد ان التتبع اليدوي يتفوق علي خوارزميه التتبع التلقائي للبرنامج لسببين رئيسيين: 1) وفره من نوى بالمثل الحجم داخل المساحة المحصورة يجعل من الصعب علي البرنامج للتمييز بين السائل المنوي الفردية وإنشاء ROIs محدده لكل السائل المنوي. 2) كما يذهب السائل المنوي في والخروج من التركيز ، والتحول كثافتها ، مما يجعل من الصعب علي البرنامج لتتبع السائل المنوي علي مدي فترات طويلة من الزمن.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Material
60 mm x 15 mm Petri dish	Fisher	FB0875713A
Agar	Fisher	BP1423-500
Sodium Chloride	Fisher	S671-3
Peptone	Fisher	BP1420-500
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
LB broth, Miller	Fisher	1426-2
Escherichia coli strain NA22	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	NA22	Either this or OP50 E. coli can be used for C. elegans maintenance and assay. Both may be purchased at the CGC
N2	CGC	N2
fog-2(q71)	CGC	CB4108
Platinum wire 0.25 mm dia	Alfa Aesar	10288
5 3/4" Disposable Pasteur pipet	Fisher	13-678-20A
Watch glass	Fisher	02-612A
5 mm Dia. Glass rod	Fisher	50-121-5269
MitoTracker CMXRos (Mito-dye)	Fisher	M7512	Shield from light, store at -20 °C
Monopostassium phosphate	Fisher	P285-500
Disodium phosphate	Fisher	S374-1
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500
Dimethyl sulfoxide	Fisher	BP231-1	DMSO
Aluminum foil	Fisher	01-213-102
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma	E10521-10G	Tricaine is the common name. Store in aliquotes at -20 °C.
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G	Store in aliquotes at -20 °C
Agarose	Fisher	BP1356-100
Coverslips	Fisher	12-548-A	18 x 18-1
Frosted microscope slides	Fisher	12-552-3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
16 °C and 20 °C incubators	Fisher	97-990E	Same model, set at different temperatures.
Upright Microscope with epi-fluorescence illuminator, camera, and 10x and 60x objectives	Nikon
Software with image acquisition and tracking capabilities	Nikon	NIS-elements AR
Stereo-microscope	Nikon	SMZ800N	Any stereo-microscope that can be used to visualize C. elegans may be used with this protocol