التلقائي الفئران واحد بيليه الوصول مع إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد من مخلب ومسارات أرقام

Summary

القوارض المهرة الوصول يستخدم عادة لدراسة المهارات البارعة، ولكن يتطلب وقتا كبيرا والجهد لتنفيذ المهمة وتحليل السلوك. نحن نصف نسخة آلية من الوصول المهرة مع تتبع الحركة وإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد من مسارات الوصول.

Abstract

القوارض المهرة الوصول يستخدم عادة لدراسة المهارات البارعة، ولكن يتطلب وقتا كبيرا والجهد لتنفيذ المهمة وتحليل السلوك. وقد تم مؤخرا تطوير عدة إصدارات آلية من الوصول المهرة. هنا، ونحن نصف النسخة التي تقدم تلقائيا الكريات للفئران في حين تسجيل الفيديو عالية الوضوح من زوايا متعددة بمعدلات إطارات عالية (300 إطارا في الثانية). يتم تعقب مخلب والأرقام الفردية مع DeepLabCut، خوارزمية التعلم الآلي لتقدير تشكل بلا علامات. ويمكن أيضا أن يتزامن هذا النظام مع التسجيلات الفسيولوجية، أو أن تستخدم لتحريك التدخلات الفسيولوجية (على سبيل المثال، التحفيز الكهربائي أو البصري).

Introduction

يعتمد البشر بشكل كبير على المهارة البارعة، التي تعرف بأنها حركات تتطلب حركات متعددة المفاصل والأرقام منسقة بدقة. وتتأثر هذه المهارات بمجموعة من أمراض الجهاز العصبي المركزي الشائعة بما في ذلك الآفات الهيكلية (مثل السكتة الدماغية، والورم، والآفات التي لإزالة التميّز)، والأمراض العصبية (مثل مرض باركنسون)، والتشوهات الوظيفية للمحرك الدوائر (على سبيل المثال، خلل التوتر). وبالتالي فإن فهم كيفية تعلم المهارات البارعة وتنفيذها من قبل دوائر السيارات المركزية ينطوي على إمكانية تحسين نوعية الحياة بالنسبة لأعداد كبيرة من السكان. وعلاوة على ذلك، من المرجح أن يؤدي هذا الفهم إلى تحسين الأداء الحركي لدى الأشخاص الأصحاء عن طريق الاستفادة المثلى من استراتيجيات التدريب وإعادة التأهيل.

تشريح الدوائر العصبية الكامنة وراء المهارة البارعة في البشر محدودة بالاعتبارات التكنولوجية والأخلاقية، مما يستلزم استخدام النماذج الحيوانية. وتستخدم الرئيسيات غير البشرية عادة لدراسة حركات الأطراف حاذق نظرا لتشابه نظمها الحركية وذخيرة السلوكية للبشر¹. ومع ذلك، فإن الرئيسيات غير البشرية مكلفة مع فترات طويلة من الجيل، مما يحد من أعداد مواضيع الدراسة والتدخلات الوراثية. وعلاوة على ذلك، في حين أن الأدوات العلمية العصبية المطبقة على الرئيسيات غير البشرية أكبر منها بالنسبة للبشر، فإن العديد من التطورات التكنولوجية الحديثة إما غير متوفرة أو محدودة بشكل كبير في الرئيسيات.

القوارض المهرة الوصول هو نهج تكميلي لدراسة السيطرة على السيارات حاذق. يمكن تدريب الفئران والفئران للوصول إلى، فهم، واسترداد بيليه السكر في تسلسل نمطي من الحركات متجانسة لأنماط الإنسان الوصول². ونظراً لضيق وقت توليدها نسبياً وانخفاض تكاليف السكن، فضلاً عن قدرتها على اكتساب مهارات تصل إلى مدى أيام إلى أسابيع، فمن الممكن دراسة أعداد كبيرة من المواضيع خلال مرحلتي التعلم وتوحيد المهارات على حد سواء. كما أن استخدام القوارض، ولا سيما الفئران، يسهل استخدام أدوات علمية عصبية حديثة قوية (مثل علم الوراثة البصرية، وتصوير الكالسيوم، والنماذج الوراثية للمرض) لدراسة المهارة البارعة.

وقد استخدمت القوارض المهرة الوصول لعقود لدراسة السيطرة الحركية العادية وكيف يتأثر بأمراض محددة مثل السكتة الدماغية ومرض باركنسون³. ومع ذلك، فإن معظم إصدارات هذه المهمة هي العمل والوقت الكثيف، والتخفيف من فوائد دراسة القوارض. وتشمل عمليات التنفيذ النموذجية وضع القوارض في غرفة الوصول مع رف أمام فتحة ضيقة من خلالها القوارض يجب أن تصل. يضع الباحث كريات السكر يدويًا على الرف، وينتظر وصول الحيوان، ثم يضع واحدة أخرى. يتم تسجيل الوصول إلى النجاحات أو الفشل إما في الوقت الحقيقي أو عن طريق استعراض الفيديو⁴. ومع ذلك، فإن مجرد تسجيل النقاط يصل إلى النجاحات أو الفشل يتجاهل البيانات الحركية الغنية التي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول كيفية (بدلاً من مجرد ما إذا) الوصول إلى ضعف. وقد عولجت هذه المشكلة من خلال تنفيذ استعراض مفصل للوصول إلى أشرطة الفيديو لتحديد ودرجات شبه كمية تصل إلى الحركات الفرعية⁵. وفي حين أضاف هذا بعض البيانات المتعلقة بالوصول إلى الحركية، إلا أنه زاد أيضاً بشكل كبير من وقت التجربة وجهدها. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤدي المستويات العالية من مشاركة التجارب إلى عدم الاتساق في المنهجية وتحليل البيانات، حتى داخل المختبر نفسه.

وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير عدة إصدارات آلية من الوصول الماهر. بعض نعلق على القفص المنزلي^6،7، والقضاء على الحاجة إلى نقل الحيوانات. وهذا يقلل من الضغط على الحيوانات ويلغي الحاجة إلى تكييفها إلى غرفة الوصول المتخصصة. إصدارات أخرى تسمح تتبع مخلب بحيث يمكن دراسةالتغييرات الحركية في إطار تدخلات محددة 8،^9،10،أو لديها آليات لتحديد ما إذا كان قد طرقت الكريات من على الرف^11. المهام الآلية الماهرة الوصول مفيدة بشكل خاص للتدريب عالية الكثافة، كما قد تكون هناك حاجة لإعادة التأهيل بعد إصابة^12. تسمح الأنظمة الآلية للالحيوانات بإجراء أعداد كبيرة من الروافد على مدى فترات طويلة من الزمن دون الحاجة إلى مشاركة مكثفة من الباحثين. وعلاوة على ذلك، فإن النظم التي تسمح بتتبع الكفات وتسجيل النتائج الآلي تقلل من الوقت الذي يقضيه الباحث في إجراء تحليل البيانات.

قمنا بتطوير نظام آلي للوصول إلى الفئران الماهرة مع العديد من الميزات المتخصصة. أولا، باستخدام قاعدة متحركة لجلب بيليه في "موقف الوصول" من أدناه، نحصل على وجهة نظر دون عائق تقريبا من الطرف السفلي. ثانياً، يسمح نظام المرايا بمشاهدة متعددة في وقت واحد للوصول باستخدام كاميرا واحدة، مما يسمح بإعادة بناء مسارات الوصول ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) باستخدام كاميرا عالية الدقة وعالية السرعة (300 إطار في الثانية). مع التطور الأخير لخوارزميات التعلم الآلي قوية لتتبع الحركة بلا علامات^13،ونحن الآن تتبع ليس فقط مخلب ولكن المفاصل الفردية لاستخراج الوصول مفصلة واستيعاب الحركية. ثالثاً، يسمح ممسك الإطار الذي يقوم بمعالجة فيديو بسيطة بتحديد المراحل التي تم الوصول إليها بشكل حقيقي. يتم استخدام هذه المعلومات لتحريك الحصول على الفيديو (الحصول المستمر على الفيديو ليس عمليا بسبب حجم الملف)، ويمكن أيضا أن تستخدم لتحريك التدخلات (على سبيل المثال، علم الوراثة البصرية) في لحظات دقيقة. وأخيراً، يتم تشغيل إطارات الفيديو الفردية بواسطة نبضات منطق الترانزستور-الترانزستور (TTL)، مما يسمح بمزامنة الفيديو بدقة مع التسجيلات العصبية (على سبيل المثال، الفيزيولوجيا الكهربائية أو القياس الضوئي). هنا، ونحن نصف كيفية بناء هذا النظام، وتدريب الفئران لأداء المهمة، ومزامنة الجهاز مع النظم الخارجية، وإعادة بناء مسارات الوصول 3-D.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق التي تنطوي على استخدام الحيوانات المذكورة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة ميشيغان.

1. إنشاء غرفة الوصول

ملاحظة: انظر Ellens et al.¹⁴ للاطلاع على التفاصيل والرسوم البيانية للجهاز. تشير أرقام الأجزاء إلى الشكل 1.

1. ربط لوحات البولي واضحة مع الاسمنت الاكريليك لبناء غرفة الوصول (15 سم واسعة من قبل 40 سم طويلة من قبل 40 سم طويل) (جزء #1). لوحة جانبية واحدة (جزء #2) لديه باب يتوقف (18 سم واسعة من قبل 15 سم طويل القامة) مع قفل. إذا كان سيتم ربط الفئران إلى كابل، وقطع شق (5 سم واسعة من قبل 36 سم طويلة) في سقف الغرفة لاستيعابذلك (الجزء #12). لوحة الكلمة لديها 18 ثقوب (1.75 سم قطرها) (جزء #13) مقطعة في ذلك، وليس المستعبدين لبقية الغرفة.
2. قم بتركيب ومحاذاة مستشعرات الأشعة تحت الحمراء (الجزء #3) في الألواح الجانبية 4.5 سم من الجزء الخلفي من الغرفة و3.8 سم من الأرض. يحتوي البرنامج السلوكي على مؤشر ('IR Back') يكون أخضرًا عندما يكون شعاع الأشعة تحت الحمراء غير منكسر وأحمر عند كسر الحزمة. بمجرد إعداد البرنامج، يمكن استخدام هذا للتحقق من محاذاة أجهزة الاستشعار.
3. قم بتركيب مرآة (15 سم × 5 سم، جزء #4) 10 سم فوق الفتحة الوصولية (الجزء #14). زاوية المرآة حتى بيليه قضيب التسليم مرئية للكاميرا.
4. ضع الغرفة على صندوق دعم قابل للتعقيم (بعرض 59 سم بطول 67.3 سم وطوله 30.5 سم، وهو جزء #5). تقع الغرفة فوق ثقب في صندوق الدعم (بعرض 12 سم وطولها 25 سم) تسمح للقمامة بالسقوط من خلال فتحات الأرضية (الجزء #13) والخروج من الغرفة التي تصل. قطع ثقب ثان (7 سم واسعة من قبل 6 سم طويلة، جزء #15) في مربع الدعم أمام فتحة الوصول، والذي يسمح قضيب تسليم بيليه لجلب الكريات إلى فتحة الوصول.
5. جبل اثنين من المرايا (8.5 سم واسعة × 18.5 سم طويل القامة، جزء #6) إلى الأرض مع المغناطيس على جانبي الغرفة بحيث الحافة الطويلة للمرآة هو لمس لوحة جانبية 3 سم من الجزء الأمامي من مربع الوصول. زاوية المرايا بحيث يمكن للكاميرا أن نرى في المربع والمنطقة أمام فتحة الوصول حيث سيتم تسليم بيليه.
6. قم بتركيب الكاميرا عالية الوضوح (الجزء #7) 17 سم من الفتحة الوصولية، التي تواجه الصندوق.
7. جبل ورقة سوداء (جزء #18) على جانبي الكاميرا حتى الخلفية في المرايا الجانبية مظلمة. وهذا يعزز التباين لتحسين الكشف عن مخلب في الوقت الحقيقي وخارج الخط.
8. قم بتركيب المحرك الخطي (الجزء #16) على إطار قابل للتعقيم (بعرض 25 سم وطوله 55 سم وطوله 24 سم، #8 جزء) بمسامير. يتم تركيب هذا الكم بيّن ًا لمنع تراكم غبار بيليه داخل مقياس الجهد الذي يستشعر هُنا.
9. إدراج رغوة O-الدائري في عنق خزان بيليه (قمع) (جزء #9) لمنع الغبار من تراكم في الجمعية. جبل قمع تحت حفرة (~ 6 سم قطرها، جزء #17) في الجزء العلوي من الإطار عن طريق الانزلاق حواف قمع فوق ثلاثة مسامير حفر في الجانب السفلي من الجزء العلوي الإطار. أدخل الأنبوب الإرشادي (الجزء #10) في عنق القمع.
10. إرفاق موصل T البلاستيك إلى نهاية قضيب الصلب من المعمل. إدراج نهاية مدبب من قضيب تسليم بيليه في الجزء العلوي من الموصل ونهاية المقبب من خلال أنبوب دليل في خزان بيليه.
11. وضع الجمعية المحرك الخطي تحت غرفة الوصول المهرة بحيث يمكن أن تمتد قضيب تسليم بيليه من خلال ثقب (جزء #15) أمام فتحة الوصول.
12. ضع جهاز الوصول بأكمله في خزانة ذات عجلات (121 سم × 119 سم × 50 سم) مهواة مع مراوح الكمبيوتر (الداخلية تصبح دافئة عندما مضاءة جيدا) واصطف مع رغوة الصوتية.
13. بناء خمس لوحات الضوء (جزء #11) عن طريق التمسك شرائط ضوء LED على 20.3 سم من قبل لوحات الدعم 25.4 سم. جبل فيلم الناشر على شرائط الضوء. جبل لوحة ضوء واحد على السقف على منطقة بيليه تسليم قضيب. جبل الأربعة الآخرين على جانبي خزانات على طول الغرفة الوصول.
    ملاحظة: من المهم أن تضيء المنطقة حول فتحة الوصول وبيليه قضيب التسليم لتحديد مخلب في الوقت الحقيقي.

2. إعداد الكمبيوتر والأجهزة

1. قم بتثبيت ممسك إطار FPGA وبطاقات التوسيع الرقمي حسب تعليمات الشركة المصنعة (راجع جدولالمواد).
   ملاحظة: نوصي على الأقل 16 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي ومحرك أقراص ثابتة الحالة الصلبة الداخلية لتخزين البيانات، كما يتطلب دفق الفيديو عالي السرعة سعة التخزين المؤقت كبيرة.
2. قم بتثبيت برامج تشغيل للكاميرا عالية الوضوح وتوصيله بـ FPGA framegrabber. يجب تشغيل البرنامج السلوكي والتفاعل مع الكاميرا لاستخدام البرنامج المقترن بالكاميرا.
   ملاحظة: التعليمات البرمجية المضمنة (راجع الملفات التكميلية) بالوصول إلى السجلات القابلة للبرمجة في الكاميرا وقد لا تكون متوافقة مع العلامات التجارية الأخرى. نوصي بتسجيل ما لا يقل عن 300 إطار في الثانية (إطارا في الثانية)؛ في 150 إطارا في الثانية وجدنا أن التغييرات الرئيسية في موقف مخلب غاب في كثير من الأحيان.
3. نسخ التعليمات البرمجية المضمنة (المشروع) في "SR Automation_dig_ext_card_64bit" إلى الكمبيوتر.

3. التدريب السلوكي

1. إعداد الفئران قبل التدريب.
   1. بيت الفئران لونغ إيفانز (ذكر أو أنثى، الذين تتراوح أعمارهم بين 10-20 أسبوعا) في مجموعات من 2-3 لكل قفص على ضوء عكسي / دورة مظلمة. قبل ثلاثة أيام من التدريب، ضع الفئران على تقييد الطعام للحفاظ على وزن الجسم 10-20٪ تحت خط الأساس.
   2. التعامل مع الفئران لعدة دقائق في اليوم لمدة 5 أيام على الأقل. بعد المناولة، ضع 4-5 كريات سكر لكل فأر في كل قفص منزلي لتقديم الطعام الجديد.
2. التعاشر الجرذ إلى غرفة الوصول (1-3 أيام)
   1. تشغيل أضواء LED ووضع 3 الكريات السكر في الجزء الأمامي والخلفي من الغرفة.
   2. وضع الفئران في الغرفة والسماح للفأر لاستكشاف لمدة 15 دقيقة. كرر هذه المرحلة حتى يأكل الجرذ كل الكريات من الأرض.
   3. تنظيف الغرفة مع الإيثانول بين الفئران.
      ملاحظة: إجراء التدريب والاختبار أثناء المرحلة المظلمة. تدريب الفئران في نفس الوقت يوميا.
3. تدريب الفئران للوصول ومراقبة تفضيل مخلب (1-3 أيام).
   1. تشغيل الأضواء ووضع الفئران في غرفة الوصول المهرة.
   2. باستخدام ملقط، عقد بيليه من خلال فتحة الوصولفي الجزء الأمامي من مربع (الشكل 1، الشكل2). السماح للفأر لتناول الطعام 3 الكريات من ملقط.
   3. في المرة القادمة يحاول الفئران أكل بيليه من ملقط، وسحب بيليه مرة أخرى. في نهاية المطاف، فإن الفئران محاولة للوصول إلى بيليه مع مخلب لها.
   4. كرر هذا 11 مرة. مخلب أن الفئران يستخدم أكثر من 11 محاولات هو "تفضيل مخلب" الفئران.
      ملاحظة: يتم تعريف محاولة كمخلب الوصول إلى الماضي الفتحة الوصول. الفئران لا تحتاج إلى الحصول بنجاح وأكل بيليه.
4. تدريب الفئران للوصول إلى قضيب تسليم بيليه (1-3 أيام)
   1. محاذاة قضيب التسليم بيليه مع جانب فتحة الوصول contralateral إلى مخلب الفئران المفضلة (استخدام دليل لضمان وضع متسقة 1.5 سم من الجزء الأمامي من الغرفة الوصول). يجب أن تتماشى الجزء العلوي من قضيب التسليم مع الجزء السفلي من فتحة الوصول (الشكل2B). وضع بيليه على قضيب التسليم.
      ملاحظة: وضع قضيب التسليم مقابل مخلب الفئران المفضل يجعل من الصعب على الفئران الحصول على بيليه مع مخلب غير المفضل. لم يكن لدينا مشاكل مع الفئران باستخدام مخلب غير المفضلة. ومع ذلك، في بعض النماذج (مثل السكتة الدماغية) قد لا يزال يحدث هذا ويمكن إضافة ضبط النفس على الطرف الوصول غير المفضل.
   2. طعم الفئران مع بيليه عقد باستخدام ملقط، ولكن توجيه الفئران نحو قضيب التسليم بحيث مخلب يضرب بيليه على قضيب. إذا كان الجرذ يطرق بيليه من قضيب، واستبدالها. بعض الفئران قد لا تصل في البداية بعيدا بما فيه الكفاية. في هذه الحالة، نقل قضيب التسليم بيليه أقرب إلى فتحة الوصول ومن ثم تتحرك ببطء بعيدا كما يحسن الفئران.
   3. بعد حوالي 5-15 الطعم يصل إلى الفئران سوف تبدأ في الوصول إلى بيليه على قضيب التسليم تلقائيا. مرة واحدة وقد حاول الفئران 10 تصل إلى قضيب التسليم دون أن يكون الطعم، فإنه يمكن أن تتقدم إلى المرحلة التالية.
5. تدريب الفئران لطلب بيليه (2-8 أيام).
   ملاحظة: على الرغم من أن لدينا 100٪ نجاح الفئران التدريب للوصول إلى الكريات، حوالي 10٪ من الفئران تفشل في تعلم طلب بيليه عن طريق الانتقال إلى الجزء الخلفي من الغرفة.
   1. وضع قضيب التسليم بيليه على أساس تفضيل مخلب الفئران وتعيينها إلى موقف 2 (الشكل2A). تعيين مواقف الارتفاع من قضيب التسليم بيليه باستخدام جهاز التحكم عن بعد المعمل. أزرار عقد 1 و 2 يتحرك في وقت واحد قضيب التسليم حتى، في حين عقد أزرار 3 و 2 يتحرك قضيب التسليم إلى أسفل. عندما يكون قضيب التسليم في الارتفاع الصحيح، اضغط باستمرار على الرقم المطلوب حتى يومض الضوء باللون الأحمر لتعيين.
   2. وضع الفئران في الغرفة وطعم الفئران إلى الخلف مع بيليه. عندما يتحرك الفئران بعيدا بما فيه الكفاية إلى الجزء الخلفي من الغرفة أنه سيتم كسر شعاع الأشعة تحت الحمراء إذا كان الإصدار الآلي قيد التشغيل، نقل قضيب التسليم بيليه إلى موقف 3 (الشكل2B).
   3. انتظر الفئران للوصول إلى بيليه ومن ثم نقل قضيب التسليم بيليه مرة أخرى إلى موقف 2 (الشكل2A). وضع بيليه جديدة على قضيب التسليم إذا كان طرقت قبالة.
   4. كرر هذه الخطوات، وطعم تدريجيا الفئران أقل وأقل، حتى يبدأ الفئران إلى: '1' الانتقال إلى الخلف لطلب بيليه دون أن يتم اصطيادها، و (2) الانتقال على الفور إلى الجبهة بعد طلب بيليه في الظهر. مرة واحدة وقد فعلت الفئران هذا 10 مرات، وأنها على استعداد للتدريب على المهمة الآلية.

4- تدريب الفئران باستخدام النظام الآلي

1. إعداد النظام التلقائي.
   1. تشغيل الأضواء في الغرفة وإعادة ملء الخزان بيليه إذا لزم الأمر.
   2. وضع قضيب التسليم بيليه وفقا لتفضيل مخلب الفئران. تحقق من تعيين مواضع الشغل بشكل صحيح (كما هو الحال في الشكل 2A).
   3. تشغيل الكمبيوتر وفتح برنامج "الوصول المهرة" (SR_dig_extension_card_64bit_(HOST)_3.vi). أدخل رقم معرف الفئران ضمن الموضوع وحدد تفضيل الكفة من القائمة المنسدلة اليد. حدد مسار حفظ لمقاطع الفيديو.
   4. تعيين وقت الجلسة ومقاطع فيديو Max (عدد مقاطع الفيديو التي يتم فيها إنهاء الجلسة في). سيتوقف البرنامج عن التشغيل في أي حد يتم الوصول إليه أولاً.
   5. تعيين بيليه رفع المدة (مدة الوقت الذي لا يزال قضيب التسليم في موقف "3" بعد الفئران يطلب بيليه). تمكين أو تعطيل عقوبة الوصول المبكر (إعادة تعيين قضيب التسليم إلى موقف "1" ثم العودة إلى "2" إذا وصل الفئران قبل طلب بيليه).
2. التقاط صور المعايرة. يستخدم إعادة إنشاء المسار ثلاثي الدّي مجموعة أدوات رؤية حاسوبية لتحديد مصفوفات التحويل المناسبة، الأمر الذي يتطلب تحديد النقاط المتطابقة في كل طريقة عرض. للقيام بذلك، استخدم مكعب صغير مع أنماطرقعة الداما على كل جانب (الشكل 3).
   1. وضع يد المساعدة داخل غرفة الوصول وكزة مقطع التمساح من خلال فتحة الوصول. عقد المكعب أمام فتحة الوصول مع مقطع التمساح.
   2. ضع المكعب بحيث يظهر الجانب الأحمر في المرآة العليا، والجانب الأخضر في المرآة اليسرى، والجانب الأزرق في المرآة اليمنى. يجب أن يكون الوجه بأكمله لكل من الجوانبالثلاثة مرئية في المرايا (الشكل 3).
   3. في البرنامج السلوكي، تأكد من تعيين عتبة عائد الاستثمار إلى قيمة كبيرة جداً (على سبيل المثال، 60000). انقر فوق زر التشغيل (سهم أبيض). بمجرد أن يتحول الزر تهيئة الكاميرا إلى اللون الأخضر، اضغط START. لاحظ أنه يتم الحصول على الفيديو.
   4. انقر فوق وضع Cal. ثم، التقاط صورة بالنقر فوق التقاط صورة Cal. سيظهر مسار دليل الصورة الآن ضمن مسار ".png" مع تنسيق اسم الملف .png كـ "GridCalibration_YYYYMMDD_img#.png".
   5. نقل المكعب قليلا، واتخاذ صورة أخرى. كرر مرة أخرى لما مجموعه 3 صور.
   6. إيقاف البرنامج بالنقر فوق إيقاف ثم زر علامة الإيقاف. إزالة يد المساعدة والمكعب من المربع.
   7. يجب الحرص على عدم عثرة أي شيء في الغرفة السلوكية بعد أن تم التقاط صور المعايرة في ذلك اليوم. إذا تحرك أي شيء، يجب التقاط صور معايرة جديدة.
3. تشغيل النظام التلقائي.
   ملاحظة: تحديد إعدادات "عتبة عائد الاستثمار" (الموضحة أدناه) لكل نسخة متطابقة قبل تشغيل الفئران للحصول على البيانات الفعلية. بمجرد تحديد هذه الإعدادات، قم بتعيينها مسبقًا قبل بدء البرنامج وضبطها أثناء الاكتساب إذا لزم الأمر.
   1. ضع الجرذ في غرفة الوصول الماهرة. انقر على السهم الأبيض لتشغيل البرنامج.
   2. قبل النقر فوق START، قم بتعيين موضع عائد الاستثمار للكشف عن المخلب عن طريق ضبط x-Offset (x-coordinate من الزاوية العلوية اليسرى من مستطيل عائد الاستثمار)، وإزاحة y (إحداثيات y في الزاوية العلوية اليسرى من عائد الاستثمار)، وعرض عائد الاستثمار و عائد الاستثمار الارتفاع.
   3. ضع عائد الاستثمار في المرآة الجانبية التي تظهر دوروم مخلب، مباشرة أمام فتحة الوصول (الشكل2C). تأكد من أن قضيب تسليم بيليه لا يدخل عائد الاستثمار وأن عائد الاستثمار لا يمتد إلى المربع لمنع بيليه أو فرو الفئران من تشغيل الفيديو عندما لا يصل الفئران.
   4. انقر فوق ابدأ لبدء تشغيل البرنامج.
   5. اضبط قيمة "عتبة عائد الاستثمار المنخفض" حتى تتأرجح "قيمة مشتيد عائد الاستثمار المباشر" بين "0" و"1" (عندما لا يصل الجرذ). هذه القيمة هي عدد وحدات البكسل داخل عائد الاستثمار مع قيم الكثافة في نطاق العتبة.
   6. تعيين عتبة عائد الاستثمار. مراقبة قيمة الزناد العائد على الاستثمار لايف عندما الفئران كدس أنفه في عائد الاستثمار وعندما يصل الفئران لبيليه. تعيين عتبة عائد الاستثمار لتكون أكبر بكثير من "قيمة الزناد العائد على الاستثمار لايف" أثناء كدس الأنف وأقل من "قيمة الزناد العائد على الاستثمار لايف" عندما يصل الفئران. ضبط حتى يتم تشغيل أشرطة الفيديو باستمرار عندما يصل الفئران ولكن ليس عندما كدس أنفه من خلال فتحة
      ملاحظة: هذا يفترض مخلب أخف الملونة من الأنف; سيتم عكس التعديلات إذا كان مخلب أغمق من الأنف.
   7. مراقبة التجارب القليلة الأولى للتأكد من أن كل شيء يعمل بشكل صحيح. عندما يصل الجرذ قبل طلب بيليه (قضيب التسليم في الموقف "2")، يزيد عدد "الوصول المبكر". عندما يصل فأر بعد طلب بيليه (قضيب التسليم في الموضع "3")، يزيد عدد "أشرطة الفيديو" ويتم حفظ الفيديو كملف .bin مع اسم "RXXXX_YYYYMMDDD_HH_MM_SS_trial#".
      ملاحظة: الافتراضي لأشرطة الفيديو أن تحتوي على 300 إطارات (أي 1 ق) قبل و 1000 إطارات بعد الحدث الزناد (وهذا هو شكلي في البرنامج)، وهو طويل بما فيه الكفاية لاحتواء حركة الوصول إلى قبضة كاملة بما في ذلك تراجع مخلب.
   8. بمجرد الوصول إلى وقت الجلسة أو مقاطع الفيديو القصوى، يتوقف البرنامج. اضغط على زر علامة الإيقاف.
   9. تنظيف الغرفة مع الإيثانول وكرر مع فأر آخر، أو إذا فعلت لهذا اليوم المضي قدما لتحويل أشرطة الفيديو.
4. تحويل ملفات .bin إلى ملفات .avi.
   ملاحظة: ضغط أشرطة الفيديو أثناء الحصول على يؤدي الإطارات التي تم إسقاطها، بحيث يتم دفق الملفات الثنائية إلى القرص أثناء الاكتساب (استخدام محرك أقراص حالة صلبة بسبب ارتفاع معدلات نقل البيانات). يجب ضغط هذه الملفات الثنائية خارج الخط أو متطلبات التخزين كبيرة بشكل لا يمكن.
   1. افتح البرنامج "bin2avi-color_1473R_noEncode.vi".
   2. ضمن "التحكم في مسار الملف" انقر فوق زر المجلد لتحديد جلسة العمل (على سبيل المثال، R0235_20180119a) الذي تريد تحويله. كرر لكل جلسة (حتى ستة).
   3. انقر فوق السهم الأبيض (تشغيل) ثم "ابدأ" للبدء. يمكنك مراقبة ضغط الفيديو في "التقدم العام (%)" بار. دع البرنامج يعمل بين عشية وضحاها.
   4. قبل البدء في تدريب الحيوانات في اليوم التالي، تحقق من أن مقاطع الفيديو قد تم تحويلها وحذف ملفات .bin بحيث تتوفر مساحة كافية للحصول على مقاطع فيديو جديدة.

5. تحليل أشرطة الفيديو مع DeepLabCut

ملاحظة: يتم تدريب شبكات مختلفة لكل تفضيل مخلب (مخلب اليمين ومخلب اليسار) ولكل عرض (عرض مباشر وعرض مرآة اليسار للفئران مخلب الحق، وعرض مباشر وعرض مرآة الحق للفئران مخلب اليسار). لا يتم استخدام عرض المرآة العلوية لإعادة الإعمار ثلاثي الدُعد - فقط للكشف عن الوقت الذي يدخل فيه الأنف الفتحة، والتي قد تكون مفيدة لتحريك التدخلات (على سبيل المثال، علم الوراثة البصرية). ثم يتم استخدام كل شبكة لتحليل مجموعة من أشرطة الفيديو اقتصاص لمخلب المقابلة وعرض.

1. تدريب شبكات DeepLabCut (يتم توفير تعليمات مفصلة في وثائق DeepLabCut على https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut).
   1. إنشاء وتكوين مشروع جديد في DeepLabCut، خوارزمية التعلم الآلي لتقدير تشكل بلا علامات¹³.
   2. استخدم البرنامج لاستخراج الإطارات من مقاطع الفيديو الماهرة التي تصل إلى الصور والاقتصاص إلى طريقة العرض لتضمين (عرض مباشر أو متطابق) في واجهة البرنامج. إطارات المحاصيل كبيرة بما فيه الكفاية بحيث الفئران وكلا الكفوف الأمامية مرئية.
      ملاحظة: تتطلب الشبكات عادةً 100-150 إطار تدريب. هناك حاجة إلى المزيد من أطر التدريب عندما يكون مخلب داخل بالمقارنة مع خارج الغرفة بسبب الإضاءة. يقلل الاقتصاص الأكثر إحكامًا من وقت المعالجة، ولكن كن حذراً من أن المناطق المزروعة كبيرة بما يكفي للكشف عن المسار الكامل للمخلب لكل فأر. وينبغي أن تكون واسعة بما فيه الكفاية لجسم الفئران بأكمله لتناسب في الإطار (وجهة نظر مباشرة)، ونرى بقدر العودة إلى الغرفة قدر الإمكان وأمام قضيب التسليم (مرآة عرض).
   3. استخدم واجهة المستخدم الرسومية للبرنامج لتسمية أجزاء الجسم. تسمية 16 نقطة في كل إطار: 4 المفاصل metacarpophalangeal (MCP)، 4 المفاصل بين الكتائب القريبة (PIP)، 4 نصائح أرقام، وdorsum من مخلب الوصول، والأنف، وdorsum من مخلب غير الوصول، وبيليه (الشكل4).
   4. اتبع تعليمات DeepLabCut (المختصرة باسم DLC من الآن فصاعداً) لإنشاء مجموعة بيانات التدريب، وتدريب الشبكة، وتقييم الشبكة المدربة.
2. تحليل مقاطع الفيديو وتحسين الشبكة.
   1. قبل تحليل جميع مقاطع الفيديو باستخدام شبكة مدربة حديثًا، قم بتحليل 10 مقاطع فيديو لتقييم أداء الشبكة. إذا كانت هناك أخطاء متسقة في أوضاع معينة، استخراج إطارات تدريب إضافية تحتوي على تلك يطرح وإعادة تدريب الشبكة.
   2. عند تحليل مقاطع الفيديو، تأكد من إخراج ملفات .csv، والتي سيتم إدخالها في التعليمات البرمجية لإعادة بناء المسار ثلاثي الدقة.

6. مربع معايرة

ملاحظة: يتم استخدام هذه الإرشادات لتحديد مصفوفات التحويل لتحويل النقاط المحددة في طرق العرض المباشرة والمتطابقة إلى إحداثيات ثلاثية الد. للحصول على أحدث إصدار ومزيد من التفاصيل حول كيفية استخدام حزمة boxCalibration، راجع مختبر الحادي عشر GitHub: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration، والذي يتضمن إرشادات خطوة بخطوة لاستخدامها.

1. جمع كافة صور المعايرة في نفس المجلد.
2. باستخدام ImageJ/Fiji، قم بوضع علامة على نقاط لوحة الداما يدويًا لكل صورة معايرة. حفظ هذه الصورة باسم "GridCalibration_YYYYMMDD_#.tif" حيث "YYYYMMDD" هو التاريخ الذي تتوافق معه صورة المعايرة و '#' هو رقم الصورة لذلك التاريخ.
   1. استخدم وظيفة القياس في ImageJ (في شريط الأدوات، حدد تحليل | قياس). سيؤدي ذلك إلى عرض جدول يحتوي على إحداثيات لكافة النقاط التي تم وضع علامة عليها. حفظ هذا الملف مع اسم "GridCalibration_YYYYYMMDD_#.csv"، حيث التاريخ ورقم الصورة هي نفس ملف .tif المطابق.
3. من حزمة المعايرة المربعة، افتح الملف 'setParams.m'. يحتوي هذا الملف على كافة المتغيرات المطلوبة ووصفها. تحرير المتغيرات حسب الحاجة لاحتواء مواصفات المشروع.
4. تشغيل وظيفة معايرة مربعات. ستظهر عدة مطالبات في إطار الأوامر. يسأل كُلّ المطالبة الأولى ما إذا كان سيتم تحليل كافة الصور في المجلد. سوف كتابة Y إنهاء المطالبات، وسيتم تحليل جميع الصور لجميع التواريخ. ستطالب كتابة N المستخدم بإدخال التواريخ لتحليلها.
   ملاحظة: سيتم إنشاء دليلين جديدين في مجلد صور المعايرة: 'markedImages' يحتوي على ملفات .png مع علامات الداما المعرفة من قبل المستخدم على صورة المعايرة. يحتوي المجلد 'boxCalibration' على ملفات .mat مع معلمات معايرة المربع.
5. تشغيل الدالة checkBoxالمعايرة. سيؤدي هذا إلى إنشاء مجلد جديد، 'checkالمعايرة' في المجلد 'boxCalibration'. سيكون لكل تاريخ مجلد فرعي يحتوي على الصور والعديد من ملفات .fig، والتي يتم استخدامها للتحقق من اكتمال معايرة المربع بدقة.

7. إعادة بناء مسارات 3D

1. تجميع ملفات .csv التي تحتوي على إخراج برنامج التعلم في بنية الدليل الموضحة في البرنامج النصي إعادة بناء 3Dtrajectories.
2. تشغيل إعادة بناء3Dtrajectories. سيقوم هذا البرنامج النصي بالبحث في بنية الدليل ومطابقة النقاط المباشرة/المتطابقة استناداً إلى أسمائها في البرنامج المائل (من المهم استخدام نفس أسماء أجزاء النص في كلا العرضين).
3. تشغيل حسابالكينماتيكس. يستخرج هذا البرنامج النصي ميزات حركية بسيطة من عمليات إعادة بناء المسار ثلاثي الد، والتي يمكن تصميمها لتلبية احتياجات محددة.
   ملاحظة: يقدّر البرنامج موضع أجزاء الجسم المُكَكَفّة استنادًا إلى جيرانها وموقعها في طريقة العرض التكميلية (على سبيل المثال، يحد موقع جزء من الجسم في عرض الكاميرا المباشر من مواقعه المحتملة في طريقة العرض المتطابقة). في الأوقات التي يتم فيها الانسداد مخلب في عرض المرآة كما يمر من خلال فتحة، يتم استيفاء إحداثيات مخلب على أساس الإطارات المجاورة.

النتائج

الفئران تكتسب مهمة الوصول المهرة بسرعة مرة واحدة تكييفها إلى الجهاز، مع استقرار الأداء منحيث كل من أعداد تصل والدقة على مدى 1-2 أسابيع (الشكل 5). ويبين الشكل 6 نماذج إطارات الفيديو التي تشير إلى الهياكل التي حددتها DeepLabCut، ويبين الشكل 7 مسارات ا...

Discussion

أصبح وصول القوارض المهرة أداة قياسية لدراسة علم وظائف الأعضاء نظام المحرك والفيزيولوجيا المرضية. لقد وصفنا كيفية تنفيذ مهمة الفئران المهرة الآلي الوصول الذي يسمح: التدريب والاختبار مع الحد الأدنى من الإشراف، 3-D مخلب وأرقام مسار إعادة الإعمار (أثناء الوصول، واستيعاب، وتراجع مخلب)، وتحديد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
clear polycarbonate panels	TAP Plastics		cut to order (see box design)
infrared source/detector	Med Associates	ENV-253SD	30" range
camera	Basler	acA2000-340kc	2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link
camera lens	Megapixel (computar)	M0814-MP2	2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus
camera cables	Basler	#2000031083	Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables
mirrors	Amazon
linear actuator	Concentrics	LACT6P	Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer
pellet reservoir/funnel	Amico (Amazon)	a12073000ux0890	6" funnel
guide tube	ePlastics	ACREXT.500X.250	1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long
pellet delivery rod	ePlastics	ACRCAR.250	0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length)
plastic T connector	United States Plastic Corp	#62065	3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee
LED lights	Lighting EVER	4100066-DW-F	12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool
Light backing	ePlastics	ACTLNAT0.125X12X36	0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet
Light diffuser films	inventables	23114-01	.007x8.5x11", matte two sides
cabinet and custom frame materials	various (Home Depot, etc.)		3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure)
acoustic foam	Acoustic First		FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick)
ventilation fans	Cooler Master (Amazon)	B002R9RBO0	Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers
cabinet door hinges	Everbilt (Home Depot	#14609	continuous steel hinge (1.4" x 48")
cabinet wheels	Everbilt (Home Depot	#49509	Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake
cabinet door handle	Everbilt (Home Depot	#15094	White light duty door pull (4.5")
computer	Hewlett Packard	Z620	HP Z620 Desktop Workstation
Camera Link Frame Grabber	National Instruments	#781585-01	PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full
Multifunction RIO Board	National Instruments	#781100-01	PCIe-17841R
Analog RIO Board Cable	National Instruments	SCH68M-68F-RMIO	Multifunction Cable
Digital RIO Board Cable	National Instruments	#191667-01	SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series
Analog Terminal Block	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
Digital Terminal Block	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
24 position relay rack	Measurement Computing Corp.	SSR-RACK24	Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel
DC switch	Measurement Computing Corp.	SSR-ODC-05	Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A
DC Sense	Measurement Computing Corp.	SSR-IDC-05	solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC
DC Power Supply	BK Precision	1671A	Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply
sugar pellets	Bio Serv	F0023	Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored)
LabVIEW	National Instruments	LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions	64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW
MATLAB	Mathworks	Matlab R2019a	box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox