Rat automatisé Single-Pellet Atteindre avec la reconstruction en 3 dimensions des trajectoires de patte et de chiffres

Résumé

L'atteinte habile de rongeur est couramment employée pour étudier des qualifications habiles, mais exige le temps et l'effort significatifs pour mettre en œuvre la tâche et analyser le comportement. Nous décrivons une version automatisée de l'atteinte habile avec le suivi de mouvement et la reconstruction tridimensionnelle des trajectoires de portée.

Résumé

L'atteinte habile de rongeur est couramment employée pour étudier des qualifications habiles, mais exige le temps et l'effort significatifs pour mettre en œuvre la tâche et analyser le comportement. Plusieurs versions automatisées de la portée qualifiée ont été développées récemment. Ici, nous décrivons une version qui présente automatiquement des granulés aux rats tout en enregistrant la vidéo haute définition sous plusieurs angles à des taux d'images élevés (300 fps). La patte et les chiffres individuels sont suivis avec DeepLabCut, un algorithme d'apprentissage automatique pour l'estimation de pose sans marqueur. Ce système peut également être synchronisé avec des enregistrements physiologiques, ou être utilisé pour déclencher des interventions physiologiques (par exemple, stimulation électrique ou optique).

Introduction

Les humains dépendent fortement de l'habileté habile, définie comme des mouvements qui nécessitent des mouvements multi-joints et numériques coordonnés avec précision. Ces compétences sont affectées par une gamme de pathologies courantes du système nerveux central, y compris les lésions structurelles (p. ex., accident vasculaire cérébral, tumeur, lésions démyélinisés), les maladies neurodégénératives (p. ex. la maladie de Parkinson) et les anomalies fonctionnelles du moteur. circuits (p. ex. dystonie). Comprendre comment les compétences habiles sont apprises et mises en œuvre par les circuits moteurs centraux a donc le potentiel d'améliorer la qualité de vie d'une grande population. En outre, une telle compréhension est susceptible d'améliorer la performance motrice chez les personnes en bonne santé en optimisant les stratégies de formation et de réadaptation.

La dissection des circuits neuronaux sous-jacents à l'habileté de l'homme est limitée par des considérations technologiques et éthiques, nécessitant l'utilisation de modèles animaux. Les primates non humains sont couramment utilisés pour étudier les mouvements des membres habiles étant donné la similitude de leurs systèmes moteurs et le répertoire comportemental à l'homme¹. Cependant, les primates non humains sont coûteux avec de longs temps de génération, limitant le nombre de sujets étudiés et les interventions génétiques. En outre, alors que la boîte à outils neuroscientifique applicable aux primates non humains est plus grande que pour les humains, de nombreuses avancées technologiques récentes sont soit indisponibles, soit considérablement limitées chez les primates.

L'atteinte habile de rongeur est une approche complémentaire à l'étude du contrôle moteur habile. Les rats et les souris peuvent être formés pour atteindre, saisir et récupérer une granule de sucre dans une séquence stéréotypée de mouvements homologues aux modèles d'atteinte humains². En raison de leur temps de génération relativement court et de coûts de logement plus bas, ainsi que de leur capacité à acquérir des compétences qui s'échelonnent sur des jours à des semaines, il est possible d'étudier un grand nombre de sujets pendant les phases d'apprentissage et de consolidation des compétences. L'utilisation de rongeurs, en particulier de souris, facilite également l'utilisation de puissants outils neuroscientifiques modernes (p. ex., optogénétique, imagerie calcique, modèles génétiques de la maladie) pour étudier les habiletés habiles.

Rongeur habile atteindre a été utilisé pendant des décennies pour étudier le contrôle moteur normal et comment il est affecté par des pathologies spécifiques comme l'AVC et la maladie de Parkinson³. Cependant, la plupart des versions de cette tâche sont laborieuse et chronolaborante, atténuant les avantages de l'étude des rongeurs. Les implémentations typiques consistent à placer les rongeurs dans une chambre d'atteindre avec une étagère devant une fente étroite à travers laquelle le rongeur doit atteindre. Un chercheur place manuellement des granulés de sucre sur l'étagère, attend que l'animal atteigne, puis place un autre. Les portées sont notées comme des succès ou des échecs en temps réel ou par examen vidéo⁴. Cependant, la simple notation atteint comme succès ou échecs ignore les données cinématiques riches qui peuvent fournir un aperçu de la façon dont (par opposition à simplement si) atteindre est altérée. Ce problème a été résolu par la mise en œuvre d'un examen détaillé de la portée des vidéos pour identifier et semi-quantitativement score atteindre les sous-mouvements⁵. Bien que cela a ajouté quelques données concernant la cinématique d'atteindre, il a également considérablement augmenté le temps et l'effort de l'expérimentateur. De plus, des niveaux élevés de participation des expérimentants peuvent entraîner des incohérences dans la méthodologie et l'analyse des données, même au sein d'un même laboratoire.

Plus récemment, plusieurs versions automatisées de la portée qualifiée ont été développées. Certains attachent à la cage à la maison^6,7, éliminant la nécessité de transférer des animaux. Cela réduit le stress sur les animaux et élimine la nécessité de les acclimater à une chambre d'atteinte spécialisée. D'autres versions permettent le suivi des pattes de sorte que les changements cinématiques dans le cadre d'interventions spécifiques peuvent être étudiés^8,9,10, ou ont des mécanismes pour déterminer automatiquement si les granulés ont été frappés hors de l'étagère¹¹. Les tâches d'atteinte automatisées sont particulièrement utiles pour l'entraînement de haute intensité, comme cela peut être nécessaire pour la réadaptation après une blessure¹². Les systèmes automatisés permettent aux animaux d'effectuer un grand nombre d'exécutions sur de longues périodes de temps sans nécessiter la participation intensive des chercheurs. De plus, les systèmes qui permettent le suivi des pattes et la notation automatisée des résultats réduisent le temps consacré aux chercheurs à l'analyse des données.

Nous avons développé un système automatisé de rat habile avec plusieurs caractéristiques spécialisées. Tout d'abord, en utilisant un piédestal mobile pour mettre la pastille en «position d'atteinte» par le bas, nous obtenons une vue presque dégagée de l'avant-membre. Deuxièmement, un système de miroirs permet de multiples vues simultanées de la portée avec une seule caméra, permettant la reconstruction en trois dimensions (3-D) des trajectoires de portée à l'aide d'une haute résolution, haute vitesse (300 fps) caméra. Avec le développement récent d'algorithmes robustes d'apprentissage automatique pour le suivi des mouvements sans marqueurs¹³, nous suivons maintenant non seulement la patte, mais les articulations individuelles pour extraire la portée détaillée et saisir la cinématique. Troisièmement, un frame-grabber qui effectue un traitement vidéo simple permet l'identification en temps réel de phases d'atteinte distinctes. Ces informations sont utilisées pour déclencher l'acquisition de vidéos (l'acquisition vidéo continue n'est pas pratique en raison de la taille du fichier), et peuvent également être utilisées pour déclencher des interventions (par exemple, l'optogénétique) à des moments précis. Enfin, les images vidéo individuelles sont déclenchées par des impulsions de logique transistor-transistor (TTL), ce qui permet de synchroniser la vidéo avec précision avec des enregistrements neuronaux (par exemple, l'électrophysiologie ou la photométrie). Ici, nous décrivons comment construire ce système, former les rats à effectuer la tâche, synchroniser l'appareil avec des systèmes externes, et reconstruire des trajectoires de portée 3D.

Protocole

Toutes les méthodes d'utilisation des animaux décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université du Michigan.

1. Mise en place de la chambre d'atteindre

REMARQUE: Voir Ellens et coll.¹⁴ pour plus de détails et de diagrammes de l'appareil. Les numéros de pièce se réfèrent à la figure 1.

1. Attachez des panneaux de polycarbonate transparents avec du ciment acrylique pour construire la chambre d'atteinte (15 cm de large sur 40 cm de long sur 40 cm de hauteur) (partie #1). Un panneau latéral (partie #2) a une porte à charnières (18 cm de large sur 15 cm de hauteur) avec une serrure. Si le rat est attaché à un câble, couper une élitre (5 cm de large sur 36 cm de long) dans le plafond de la chambre pour l'accueillir (partie #12). Le panneau de plancher a 18 trous (1,75 cm de diamètre) (partie #13) coupé sa place et n'est pas collé au reste de la chambre.
2. Montez et alignez les capteurs infrarouges (partie #3) dans les panneaux latéraux à 4,5 cm de l'arrière de la chambre et à 3,8 cm du plancher. Le logiciel comportemental a un indicateur ('IR Back') qui est vert lorsque le faisceau infrarouge est ininterrompu et rouge lorsque le faisceau est cassé. Une fois que le logiciel est mis en place, cela peut être utilisé pour vérifier l'alignement du capteur.
3. Monter un miroir (15 cm x 5 cm, partie #4) à 10 cm au-dessus de la fente d'atteinte (partie #14). Angle le miroir de sorte que la tige de livraison de granulés est visible à la caméra.
4. Placez la chambre sur une boîte de soutien aseptisable (59 cm de large sur 67,3 cm de long sur 30,5 cm de hauteur, partie #5). La chambre repose au-dessus d'un trou dans la boîte de soutien (12 cm de large sur 25 cm de long) qui permet à la litière de tomber à travers les trous de plancher (partie #13) et hors de la chambre d'atteinte. Couper un deuxième trou (7 cm de large sur 6 cm de long, partie #15) dans la boîte de soutien devant la fente d'atteinte, ce qui permet à une tige de livraison de granulés d'apporter des granulés à la fente d'atteinte.
5. Montez deux miroirs (8,5 cm de large x 18,5 cm de hauteur, une partie #6) au sol avec des aimants de chaque côté de la chambre de sorte que le long bord du miroir touche le panneau latéral à 3 cm de l'avant de la boîte d'atteinte. Angle les miroirs de sorte que la caméra peut voir dans la boîte et la zone en face de la fente d'atteindre où le granule sera livré.
6. Montez la caméra haute définition (partie #7) à 17 cm de la fente d'atteinte, face à la boîte.
7. Montez le papier noir (partie #18) de chaque côté de la caméra de sorte que l'arrière-plan dans les rétroviseurs latéraux est sombre. Cela améliore le contraste pour améliorer la détection des pattes en temps réel et hors ligne.
8. Monter l'actionneur linéaire (partie #16) sur un cadre adicisable (25 cm de large sur 55 cm de long sur 24 cm de haut, partie #8) avec des vis. L'actionneur est monté à l'envers pour empêcher la poussière de granule de s'accumuler à l'intérieur de son potentiomètre de détection de position.
9. Insérer une mousse O-anneau dans le cou du réservoir de granulés (funnel) (partie #9) pour empêcher la poussière de s'accumuler dans l'assemblage. Montez l'entonnoir sous un trou (6 cm de diamètre, partie #17) dans le haut du cadre en glissant les bords de l'entonnoir au-dessus de trois vis forées dans le dessous du dessus du cadre. Insérer le tube guide (partie #10) dans le col de l'entonnoir.
10. Fixez le connecteur T en plastique à l'extrémité de la tige d'acier de l'actionneur. Insérez l'extrémité effilée de la tige de livraison de granulés dans le haut du connecteur et l'extrémité coupée à travers le tube guide dans le réservoir de granulés.
11. Placez l'ensemble de l'actionneur linéaire sous la chambre d'atteinte de façon à ce que la tige de livraison de granulés puisse s'étendre à travers le trou (partie #15) devant la fente d'atteinte.
12. Placer l'appareil d'atteinte entier dans une armoire à roues (121 cm x 119 cm x 50 cm) ventilée avec des ventilateurs d'ordinateur (l'intérieur se réchauffe lorsqu'il est bien éclairé) et doublé de mousse acoustique.
13. Construisez cinq panneaux lumineux (partie #11) en adhérant des bandes lumineuses LED sur des panneaux de soutien de 20,3 cm sur 25,4 cm. Film de diffuseur de montage au-dessus des bandes de lumière. Montez un panneau lumineux sur le plafond au-dessus de la zone de tige de livraison de granulés. Montez les quatre autres sur les côtés des armoires le long de la chambre d'arrivée.
    REMARQUE : Il est important d'éclairer la zone autour de la fente d'atteinte et de la tige de livraison de granulés pour l'identification en temps réel de patte.

2. Mise en place de l'ordinateur et du matériel

1. Installer le grabber de cadre FPGA et les cartes d'extension numériques selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Nous recommandons au moins 16 Go de RAM et un disque dur interne à l'état solide pour le stockage des données, car la diffusion en continu de la vidéo haute vitesse nécessite une capacité tampon importante.
2. Installez des pilotes pour la caméra haute définition et connectez-la au framegrabber FPGA. Le logiciel comportemental doit être en cours d'exécution et d'interaction avec la caméra pour utiliser le logiciel associé à la caméra.
   REMARQUE : Le code inclus (voir les fichiers supplémentaires) accède aux registres programmables dans l'appareil photo et peut ne pas être compatible avec d'autres marques. Nous recommandons d'enregistrer au moins 300 images par seconde (fps); à 150 fps nous avons constaté que les changements clés dans la posture de patte ont été souvent manqués.
3. Copiez le code inclus (projet) dans "SR Automation-dig-ext-card-64bit" à l'ordinateur.

3. Formation comportementale

1. Préparer les rats avant l'entraînement.
   1. Maison Les rats Long-Evans (mâles ou femelles, âgés de 10 à 20 semaines) par groupes de 2 à 3 par cage sur un cycle de lumière ou d'obscurité inversée. Trois jours avant l'entraînement, placez les rats sous restriction alimentaire pour maintenir un poids corporel de 10 à 20 % inférieur à la ligne de base.
   2. Manipulez les rats plusieurs minutes par jour pendant au moins 5 jours. Après la manipulation, placez 4 à 5 granulés de sucre par rat dans chaque cage d'accueil pour introduire la nourriture nouvelle.
2. Habituer le rat à la chambre d'atteindre (1 à 3 jours)
   1. Allumez les lumières LED et placez 3 granulés de sucre à l'avant et à l'arrière de la chambre.
   2. Placez le rat dans la chambre et laissez le rat explorer pendant 15 min. Surveillez s'il mange les granulés. Répétez cette phase jusqu'à ce que le rat mange toutes les boulettes du sol.
   3. Nettoyer la chambre avec de l'éthanol entre les rats.
      REMARQUE : Effectuez de l'entraînement et des tests pendant la phase sombre. Entraînez les rats en même temps tous les jours.
3. Entraînez le rat à atteindre et observez la préférence de patte (1 à 3 jours).
   1. Allumez les lumières et placez le rat dans la chambre d'atteinte qualifiée.
   2. À l'aide de forceps, tenir une pastille à travers la fente d'atteinte à l'avant de la boîte (Figure 1, Figure 2). Laisser le rat manger 3 boulettes des forceps.
   3. La prochaine fois que le rat essaie de manger la boulette des forceps, tirez la boulette en arrière. Finalement, le rat tentera d'atteindre la pastille avec sa patte.
   4. Répétez cette opération 11 fois. La patte que le rat utilise le plus des 11 tentatives est la « préférence de patte » du rat.
      REMARQUE : Une tentative est définie comme la patte qui tend la main au-delà de la fente d'atteinte. Le rat n'a pas besoin d'obtenir et de manger avec succès la pastille.
4. Entraînez le rat à atteindre la tige de livraison de granulés (1 à 3 jours)
   1. Alignez la tige de livraison de granulés avec le côté de la fente d'atteinte contralatérale à la patte préférée du rat (utilisez un guide pour assurer un placement constant à 1,5 cm de l'avant de la chambre d'accès). Le haut de la tige de livraison doit s'aligner sur le bas de la fente d'atteinte (Figure 2B). Placez une boulette sur la tige de livraison.
      REMARQUE : Le fait de positionner la tige de livraison en face de la patte préférée du rat rend difficile pour le rat d'obtenir le granule avec sa patte non préférée. Nous n'avons pas eu de problèmes avec les rats en utilisant leur patte non-préférée. Toutefois, dans certains modèles (p. ex., aVC), cela peut encore se produire et une restriction sur le membre d'atteinte non préféré peut être ajoutée.
   2. Appâter le rat avec une boulette tenue à l'aide de forceps, mais diriger le rat vers la tige de livraison de sorte que sa patte frappe la pastille sur la tige. Si le rat frappe le granule de la tige, remplacez-le. Certains rats peuvent ne pas atteindre au départ assez loin. Dans ce cas, déplacez la tige de livraison de granulés plus près de la fente d'atteinte, puis déplacez-la lentement plus loin au fur et à mesure que le rat s'améliore.
   3. Après environ 5-15 appâts atteint le rat va commencer à atteindre pour le granule sur la tige de livraison spontanément. Une fois que le rat a tenté 10 atteint à la tige de livraison sans être appâté, il peut passer à la phase suivante.
5. Entraînez le rat à demander une boulette (2 à 8 jours).
   REMARQUE: Bien que nous ayons eu 100% de succès de formation des rats à atteindre pour les granulés, environ 10% des rats ne parviennent pas à apprendre à demander une boulette en se déplaçant à l'arrière de la chambre.
   1. Placez la tige de livraison de granulés en fonction de la préférence du rat et placez-la à la position 2 (Figure 2A). Définiz les positions de hauteur de la tige de livraison de granulés à l'aide de la télécommande de l'actionneur. Les boutons de retenue 1 et 2 déplacent simultanément la tige de livraison vers le haut, tandis que les boutons de fixation 3 et 2 déplace la tige de livraison vers le bas. Lorsque la tige de livraison est à la bonne hauteur, maintenez le nombre désiré jusqu'à ce que la lumière clignote en rouge pour définir.
   2. Placez le rat dans la chambre et appâtez le rat à l'arrière avec une boulette. Lorsque le rat se déplace assez loin à l'arrière de la chambre pour qu'il casse le faisceau infrarouge si la version automatisée était en cours d'exécution, déplacer la tige de livraison de granulés à la position 3 (Figure 2B).
   3. Attendez que le rat atteigne la pastille, puis déplacez la tige de livraison de granulés vers la position 2 (Figure 2A). Placez une nouvelle pastille sur la tige de livraison si elle a été renversée.
   4. Répétez ces étapes, appâtant graduellement le rat de moins en moins, jusqu'à ce que le rat commence à: (i) se déplacer vers l'arrière pour demander une pastille sans être appâté, et (ii) se déplacer immédiatement à l'avant après avoir demandé une boulette dans le dos. Une fois que le rat a fait cela 10 fois, il est prêt pour la formation sur la tâche automatisée.

4. Former les rats à l'aide du système automatisé

1. Configurez le système automatisé.
   1. Allumez les lumières dans la chambre et remplissez le réservoir de granulés si nécessaire.
   2. Placez la tige de livraison de granulés en fonction de la préférence du rat. Vérifiez que les positions de l'actionneur sont correctement fixées (comme à la figure 2A).
   3. Allumez l'ordinateur et ouvrez le programme Skilled Reaching (SR-dig-extension-card-64bitMD(HOST) 3.vi). Entrez le numéro d'iD de rat sous Sujet et sélectionnez la préférence de patte dans le menu Hand drop-down. Spécifiez le chemin d'enregistrement pour les vidéos.
   4. Définir l'heure de la session et les vidéos Max (nombre de vidéos pour terminer la session). Le programme cessera de fonctionner à n'importe quelle limite atteinte en premier.
   5. Définir la durée de levage des granulés (durée du temps pendant lequel la tige de livraison reste en position «3» après que le rat a demandé une pastille). Activer ou désactiver la pénalité d'accès précoce (la tige de livraison se réinitialise pour positionner « 1 », puis revenir à « 2 » si le rat atteint avant de demander une pastille).
2. Prenez des images d'étalonnage. La reconstruction de trajectoire 3D utilise une boîte à outils de vision par ordinateur pour déterminer les matrices de transformation appropriées, ce qui nécessite l'identification des points correspondants dans chaque vue. Pour ce faire, utilisez un petit cube avec des motifs de damier de chaque côté (Figure 3).
   1. Placez la main d'aide à l'intérieur de la chambre d'atteindre et piquez le clip d'alligator à travers la fente d'atteindre. Tenez le cube devant la fente d'atteinte avec le clip d'alligator.
   2. Placez le cube de sorte que le côté rouge apparaît dans le miroir supérieur, le côté vert dans le miroir gauche, et le côté bleu dans le miroir droit. La face entière de chacun des trois côtés doit être visible dans les miroirs (figure 3).
   3. Dans le programme comportemental, assurez-vous que le seuil de retour sur investissement est fixé à une valeur très importante (p. ex., 60000). Cliquez sur le bouton d'exécution (flèche blanche). Une fois que le bouton Caméra Initialized passe au vert, appuyez sur START. Notez que la vidéo est en cours d'acquisition.
   4. Cliquez sur Cal Mode. Ensuite, prenez une image en cliquant sur Take Cal Image. Le chemin de l'annuaire de l'image apparaîtra désormais sous ".png path" avec le nom de fichier .png formaté comme "GridCalibration -YYYYYMMDD-img.png".
   5. Déplacez légèrement le cube et prenez une autre image. Répétez l'opération pour un total de 3 images.
   6. Arrêtez le programme en cliquant sur STOP, puis le bouton de panneau d'arrêt. Retirez le coup de main et le cube de la boîte.
   7. Veillez à ne rien cogner dans la chambre comportementale après que des images d'étalonnage ont été prises ce jour-là. Si quelque chose bouge, de nouvelles images d'étalonnage doivent être prises.
3. Exécutez le système automatisé.
   REMARQUE : Déterminez les paramètres du « seuil de roi-retour » (décrit ci-dessous) pour chaque miroir avant d'exécuter des rats pour l'acquisition réelle de données. Une fois ces paramètres déterminés, préfixez-les avant de commencer le programme et ajustez-les lors de l'acquisition si nécessaire.
   1. Placez le rat dans la chambre d'atteinte qualifiée. Cliquez sur la flèche blanche pour exécuter le programme.
   2. Avant de cliquer sur START, définir la position du ROI pour la détection des pattes en ajustant x-Offset (x-coordonnées du coin supérieur gauche du rectangle de retour sur investissement), y-Offset (y-coordonnées du coin supérieur gauche du ROI), LARGEUR du ROI et HAUTEUR ROI.
   3. Placez le retour sur investissement dans le miroir latéral qui montre le dorsum de la patte, directement devant la fente d'atteinte (Figure 2C). Assurez-vous que la tige de livraison de granulés n'entre pas dans le retour sur investissement et que le retour sur investissement ne s'étend pas dans la boîte pour empêcher la pastille ou la fourrure du rat de déclencher une vidéo lorsque le rat n'atteint pas.
   4. Cliquez sur START pour commencer le programme.
   5. Ajustez la valeur « Seuil de faible roi-roi » jusqu'à ce que la « valeur de déclenchement du retour sur investissement en direct » oscille entre « 0 » et « 1 » (lorsque le rat n'atteint pas). Cette valeur est le nombre de pixels dans le ROI avec des valeurs d'intensité dans la plage de seuil.
   6. Définir le seuil de retour sur investissement. Observez la valeur de déclenchement du retour sur investissement en direct lorsque le rat fourre son nez dans le retour sur investissement et lorsque le rat atteint la pastille. Définir le seuil de retour sur investissement pour qu'il soit significativement plus élevé que la « valeur de déclenchement du retour sur investissement en direct » pendant les piques de nez et inférieur à la « valeur de déclenchement du retour sur investissement en direct » lorsque le rat atteint. Ajustez jusqu'à ce que les vidéos soient déclenchées de façon constante lorsque le rat atteint, mais pas quand il pique son nez à travers la fente
      REMARQUE: Cela suppose que la patte est de couleur plus claire que le nez; les réglages seraient inversés si la patte est plus foncée que le nez.
   7. Surveillez les premiers essais pour vous assurer que tout fonctionne correctement. Lorsqu'un rat atteint avant de demander une pastille (tige de livraison en position "2"), le nombre "Early Reaches" augmente. Lorsqu'un rat arrive après avoir demandé une pastille (la tige de livraison en position "3"), le numéro "Vidéos" augmente et une vidéo est enregistrée sous forme de fichier .bin avec le nom "RXXXX-YYYYMMDDD-HH-MM-SS-trial".
      REMARQUE : La valeur par défaut est que les vidéos contiennent 300 images (c.-à-d. 1 s) avant et 1 000 images après l'événement de déclenchement (cela est configurable dans le logiciel), ce qui est assez long pour contenir l'ensemble du mouvement de portée à saisir, y compris la rétraction de la patte.
   8. Une fois que l'heure de la session ou les vidéos max sont atteintes, le programme s'arrête. Appuyez sur le bouton du panneau d'arrêt.
   9. Nettoyer la chambre avec de l'éthanol et répéter avec un autre rat, ou si fait pour la journée procéder à la conversion des vidéos.
4. Convertir les fichiers .bin en fichiers .avi.
   REMARQUE : La compression des vidéos pendant l'acquisition provoque des images abandonnées, de sorte que les fichiers binaires sont diffusés sur disque lors de l'acquisition (utiliser un disque à l'état solide en raison de taux de transfert de données élevés). Ces fichiers binaires doivent être compressés hors ligne ou les exigences de stockage sont prohibitives.
   1. Ouvrez le programme "bin2avi-color-1473R-noEncode.vi".
   2. Sous "File Path Control" cliquez sur le bouton dossier pour sélectionner la session (par exemple, R0235-20180119a) que vous souhaitez convertir. Répétez l'opération pour chaque session (jusqu'à six).
   3. Cliquez sur la flèche blanche (courir) puis "START" pour commencer. Vous pouvez surveiller la compression vidéo dans le "Progrès global (%)" café. Laissez le programme fonctionner toute la nuit.
   4. Avant de commencer à entraîner les animaux le lendemain, vérifiez que les vidéos ont été converties et supprimez les fichiers .bin afin qu'il y ait assez d'espace pour acquérir de nouvelles vidéos.

5. Analyser des vidéos avec DeepLabCut

REMARQUE : Différents réseaux sont formés pour chaque préférence de patte (patte droite et patte gauche) et pour chaque vue (vue directe et vue gauche de miroir pour les rats à pattes droites, vue directe et vue du miroir droit pour les rats à pattes gauches). La vue du miroir supérieur n'est pas utilisée pour la reconstruction 3D, juste pour détecter quand le nez pénètre dans la fente, ce qui peut être utile pour déclencher des interventions (par exemple, l'optogénétique). Chaque réseau est ensuite utilisé pour analyser un ensemble de vidéos recadrées pour la patte et la vue correspondantes.

1. Entraînez les réseaux DeepLabCut (des instructions détaillées sont fournies dans la documentation DeepLabCut sur https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut).
   1. Créez et configurez un nouveau projet dans DeepLabCut, un algorithme d'apprentissage automatique pour l'estimation de pose sans marqueur¹³.
   2. Utilisez le programme pour extraire des images des vidéos et des images de culture d'atteindre habiles à la vue pour inclure (vue directe ou miroir) dans l'interface du programme. Cadres de culture assez grands pour que le rat et les deux pattes avant soient visibles.
      REMARQUE : Les réseaux nécessitent généralement de 100 à 150 cadres d'entraînement. Plus de cadres d'entraînement sont nécessaires lorsque la patte est à l'intérieur par rapport à l'extérieur de la chambre en raison de l'éclairage. Un recadrage plus serré réduit le temps de traitement, mais veillez à ce que les régions cultivées soient suffisamment grandes pour détecter la trajectoire complète de la patte pour chaque rat. Il devrait être assez large pour que tout le corps du rat s'adapte dans le cadre (vue directe), et de voir aussi loin dans la chambre que possible et en face de la tige de livraison (vue miroir).
   3. Utilisez le programme GUI pour étiqueter les parties du corps. Étiqueter 16 points dans chaque cadre : 4 articulations métacarpophalangeal (MCP), 4 joints interphalangeal proximal (PIP), 4 pointes de chiffres, le dorsum de la patte d'atteinte, le nez, le dorsum de la patte non-atteinte, et la pastille (Figure 4).
   4. Suivez les instructions DeepLabCut (abréviation de DLC désormais) pour créer le jeu de données de formation, former le réseau et évaluer le réseau formé.
2. Analysez les vidéos et affinez le réseau.
   1. Avant d'analyser toutes les vidéos avec un réseau nouvellement formé, analysez 10 vidéos pour évaluer les performances du réseau. S'il y a des erreurs constantes dans certaines poses, extraire des cadres d'entraînement supplémentaires contenant ces poses et recycler le réseau.
   2. Lors de l'analyse des vidéos, assurez-vous de sortie des fichiers .csv, qui seront introduits dans le code pour la reconstruction de trajectoire 3D.

6. Étalonnage de boîte

REMARQUE : Ces instructions sont utilisées pour déterminer les matrices de transformation pour convertir les points identifiés dans les vues directes et miroirs en coordonnées 3D. Pour la version la plus à jour et plus de détails sur la façon d'utiliser le paquet boxCalibration, voir le Leventhal Lab GitHub: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration, qui comprend des instructions étape par étape pour leur utilisation.

1. Recueillir toutes les images d'étalonnage dans le même dossier.
2. À l'aide d'ImageJ/Fiji, marquez manuellement les points de damier pour chaque image d'étalonnage. Enregistrez cette image sous le nom de "GridCalibration-YYYYMMDD-.tif" où 'YYYYMMDD' est la date à laquelle l'image d'étalonnage correspond et ''' est le numéro d'image pour cette date.
   1. Utilisez la fonction de mesure dans ImageJ (dans la barre d'outils, sélectionnez Analyser Mesure). Il affichera une table contenant des coordonnées pour tous les points marqués. Enregistrez ce fichier avec le nom "GridCalibration-YYYYMMDD-.csv", où la date et le numéro d'image sont les mêmes que le fichier .tif correspondant.
3. À partir de la boîteCalibration paquet, ouvrez le fichier 'setParams.m'. Ce fichier contient toutes les variables requises et leur description. Modifier les variables au besoin pour s'adapter aux spécifications du projet.
4. Exécutez la fonction calibrateBoxes. Plusieurs invites apparaîtront dans la fenêtre de commande. La première invite demande s'il faut analyser toutes les images dans le dossier. Taper Y mettra fin aux invites, et toutes les images pour toutes les dates seront analysées. Taper N incitera l'utilisateur à entrer les dates à analyser.
   REMARQUE : Deux nouveaux répertoires seront créés dans le dossier d'images d'étalonnage : 'markedImages' contient des fichiers .png avec les marques de damier définies par l'utilisateur sur l'image d'étalonnage. Le dossier 'boxCalibration' contient des fichiers .mat avec les paramètres d'étalonnage de la boîte.
5. Exécutez la fonction checkBoxCalibration. Cela créera un nouveau dossier, 'checkCalibration' dans le dossier 'boxCalibration'. Chaque date aura un sous-folder contenant les images et plusieurs fichiers .fig, qui sont utilisés pour vérifier que l'étalonnage de la boîte a été effectuée avec précision.

7. Reconstruire les trajectoires 3D

1. Assembler les fichiers .csv contenant la sortie du programme d'apprentissage dans la structure de l'annuaire décrite dans le script reconstruct3Dtrajectories.
2. Exécuter reconstruct3Dtrajectories. Ce script recherchera la structure de l'annuaire et correspondra aux points directs/miroirs en fonction de leurs noms dans le programme penché (il est important d'utiliser les mêmes noms de parties du corps dans les deux vues).
3. Exécuter calculerKinematics. Ce script extrait des caractéristiques cinématiques simples des reconstructions de trajectoire 3D, qui peuvent être adaptées à des besoins spécifiques.
   REMARQUE : Le logiciel estime la position des parties du corps occluded en fonction de leurs voisins et de leur emplacement dans la vue complémentaire (par exemple, l'emplacement d'une partie du corps dans la vue directe de la caméra limite ses emplacements possibles dans la vue du miroir). Pour les moments où la patte est occluded dans la vue du miroir comme il passe à travers la fente, coordonnées de la patte sont interpolées en fonction des cadres voisins.

Résultats

Les rats acquièrent rapidement la tâche d'atteinte habile une fois acclimaté à l'appareil, avec un plafonnement des performances en termes de nombre s'étend et de précision sur une semaine et demie (figure5). La figure 6 montre des images vidéo indiquant des structures identifiées par DeepLabCut, et la figure 7 montre des trajectoires de portée individuelles superposées à partir d'une seule session. Enfin, dans

Discussion

L'atteinte de la main de rongeur habile est devenue un outil standard pour étudier la physiologie et la pathophysiologie de système moteur. Nous avons décrit comment mettre en œuvre une tâche automatisée rat habile atteindre qui permet: la formation et les tests avec une supervision minimale, 3-D patte et la reconstruction de trajectoire numérique (pendant l'atteinte, la saisie et la rétraction des pattes), l'identification en temps réel de la patte pendant l'atteinte, et la synchronisation avec l'électronique ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
clear polycarbonate panels	TAP Plastics		cut to order (see box design)
infrared source/detector	Med Associates	ENV-253SD	30" range
camera	Basler	acA2000-340kc	2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link
camera lens	Megapixel (computar)	M0814-MP2	2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus
camera cables	Basler	#2000031083	Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables
mirrors	Amazon
linear actuator	Concentrics	LACT6P	Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer
pellet reservoir/funnel	Amico (Amazon)	a12073000ux0890	6" funnel
guide tube	ePlastics	ACREXT.500X.250	1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long
pellet delivery rod	ePlastics	ACRCAR.250	0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length)
plastic T connector	United States Plastic Corp	#62065	3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee
LED lights	Lighting EVER	4100066-DW-F	12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool
Light backing	ePlastics	ACTLNAT0.125X12X36	0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet
Light diffuser films	inventables	23114-01	.007x8.5x11", matte two sides
cabinet and custom frame materials	various (Home Depot, etc.)		3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure)
acoustic foam	Acoustic First		FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick)
ventilation fans	Cooler Master (Amazon)	B002R9RBO0	Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers
cabinet door hinges	Everbilt (Home Depot	#14609	continuous steel hinge (1.4" x 48")
cabinet wheels	Everbilt (Home Depot	#49509	Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake
cabinet door handle	Everbilt (Home Depot	#15094	White light duty door pull (4.5")
computer	Hewlett Packard	Z620	HP Z620 Desktop Workstation
Camera Link Frame Grabber	National Instruments	#781585-01	PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full
Multifunction RIO Board	National Instruments	#781100-01	PCIe-17841R
Analog RIO Board Cable	National Instruments	SCH68M-68F-RMIO	Multifunction Cable
Digital RIO Board Cable	National Instruments	#191667-01	SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series
Analog Terminal Block	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
Digital Terminal Block	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
24 position relay rack	Measurement Computing Corp.	SSR-RACK24	Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel
DC switch	Measurement Computing Corp.	SSR-ODC-05	Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A
DC Sense	Measurement Computing Corp.	SSR-IDC-05	solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC
DC Power Supply	BK Precision	1671A	Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply
sugar pellets	Bio Serv	F0023	Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored)
LabVIEW	National Instruments	LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions	64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW
MATLAB	Mathworks	Matlab R2019a	box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox