Automatizado Rat single-pellet atingindo com 3-dimensional reconstrução de pata e dígitos trajetórias

Resumo

O alcance hábil do roedor é comumente usado para estudar habilidades destosas, mas requer tempo e esforço significativos para implementar a tarefa e analisar o comportamento. Nós descrevemos uma versão automatizada do alcance hábil com seguimento do movimento e reconstrução tridimensional de trajetórias do alcance.

Resumo

O alcance hábil do roedor é comumente usado para estudar habilidades destosas, mas requer tempo e esforço significativos para implementar a tarefa e analisar o comportamento. Várias versões automatizadas de alcance hábil foram desenvolvidas recentemente. Aqui, descrevemos uma versão que automaticamente apresenta pelotas para ratos durante a gravação de vídeo de alta definição a partir de vários ângulos em altas taxas de quadros (300 fps). A pata e os dígitos individuais são rastreados com o deeplabcut, um algoritmo de aprendizado de máquina para estimativa de pose alinhamento. Este sistema também pode ser sincronizado com gravações fisiológicas, ou ser usado para desencadear intervenções fisiológicas (por exemplo, estimulação elétrica ou óptica).

Introdução

Os seres humanos dependem fortemente da habilidade destreza, definida como movimentos que exigem movimentos multiarticulares e de dígitos precisamente coordenados. Essas habilidades são afetadas por uma série de patologias comuns do sistema nervoso central, incluindo lesões estruturais (por exemplo, acidente vascular cerebral, tumor, lesões desmielinantes), doença neurodegenerativa (por exemplo, doença de Parkinson) e anormalidades funcionais do motor circuitos (por exemplo, distonia). Entender como habilidades destosas são aprendidas e implementadas por circuitos motores centrais, portanto, tem o potencial de melhorar a qualidade de vida de uma grande população. Além disso, tal entendimento é susceptível de melhorar o desempenho motor em pessoas saudáveis, otimizando estratégias de treinamento e reabilitação.

A dissecação dos circuitos neurais subjacentes à habilidade destreza em humanos é limitada por considerações tecnológicas e éticas, necessitando do uso de modelos animais. Os primatas não humanos são comumente usados para estudar movimentos de membros dexterosos, dada a semelhança de seus sistemas motores e repertório comportamental para os seres humanos¹. No entanto, os primatas não humanos são caros com tempos de geração longos, limitando números de sujeitos de estudo e intervenções genéticas. Além disso, enquanto a caixa de ferramentas neurocientífica aplicável aos primatas não humanos é maior do que para os seres humanos, muitos avanços tecnológicos recentes estão indisponíveis ou significativamente limitados em primatas.

O alcance hábil do roedor é uma aproximação complementar a estudar o controle de motor Dexterous. Ratos e camundongos podem ser treinados para alcançar, agarrar e recuperar uma pelota de açúcar em uma seqüência estereotipada de movimentos homous aos padrões de alcance humano². Devido ao seu tempo de geração relativamente curto e menor custo de habitação, bem como a sua capacidade de adquirir qualificados atingindo ao longo de dias a semanas, é possível estudar um grande número de assuntos durante as fases de aprendizagem e de consolidação de habilidades. O uso de roedores, especialmente camundongos, também facilita o uso de poderosas ferramentas neurocientíficas modernas (por exemplo, optogenética, imagem de cálcio, modelos genéticos da doença) para estudar habilidade destreza.

O alcance hábil do roedor foi usado por décadas para estudar o controle normal do motor e como é afetado por patologias específicas como o curso e a doença de Parkinson³. No entanto, a maioria das versões desta tarefa são de trabalho e tempo intensivo, mitigando os benefícios de estudar roedores. As implementações típicas envolvem a colocação de roedores em uma câmara de alcance com uma prateleira na frente de um entalhe estreito através de que o roedor deve alcangar. Um pesquisador coloca manualmente pelotas de açúcar na prateleira, aguarda o animal chegar e, em seguida, coloca um outro. Atinge são marcados como sucessos ou falhas em tempo real ou por vídeo revisão⁴. No entanto, simplesmente marcar atinge como sucessos ou falhas ignora dados cinemáticos ricos que podem fornecer informações sobre como (ao contrário de simplesmente se) atingindo é prejudicada. Este problema foi abordado através da implementação de uma revisão detalhada do alcance dos vídeos para identificar e pontuar os submovimentos do alcance do escore⁵. Enquanto isso acrescentou alguns dados sobre a cinemática de alcance, também aumentou significativamente o tempo e o esforço do experimentador. Além disso, altos níveis de envolvimento experimentador podem levar a inconsistências na metodologia e análise de dados, mesmo dentro do mesmo laboratório.

Mais recentemente, várias versões automatizadas de alcance hábil foram desenvolvidas. Alguns atribuem à gaiola de casa^6,7, eliminando a necessidade de transferir animais. Isto reduz o stress nos animais e elimina a necessidade de aclimatar os a uma câmara de alcance especializada. Outras versões permitem o seguimento da pata de modo que as mudanças cinemáticas intervenções específicas possam ser estudadas^8,9,10, ou têm mecanismos para determinar automaticamente se as pelotas foram derrubados fora da prateleira¹¹. As tarefas de alcance hábil automatizadas são especialmente úteis para o treinamento de alta intensidade, como pode ser exigido para a reabilitação após uma lesão¹². Os sistemas automatizados permitem que os animais realizem um grande número de alcances sobre longos períodos de tempo sem exigir a participação intensiva do investigador. Além disso, os sistemas que permitem rastreamento de pata e pontuação de resultado automatizada reduzem o tempo de pesquisador gasto realizando a análise de dados.

Nós desenvolvemos um sistema automatizado de alcance hábil do rato com diversas características especializadas. Primeiramente, usando um suporte móvel para trazer o pellet em "alcançando a posição" de abaixo, nós obtemos uma vista quase desobstruída do forelimb. Em segundo lugar, um sistema de espelhos permite múltiplas visões simultâneas do alcance com uma única câmera, permitindo a reconstrução tridimensional (3-D) de trajetórias de alcance usando uma câmera de alta resolução, de alta velocidade (300 fps). Com o desenvolvimento recente de algoritmos de aprendizado de máquina robustos para rastreamento de movimento alinhamento¹³, agora rastreamos não só a pata, mas os Knuckles individuais para extrair o alcance detalhado e compreender a cinemática. Em terceiro lugar, um frame-grabber que executa o processamento de vídeo simples permite a identificação em tempo real de distintas fases de alcance. Essas informações são usadas para acionar a aquisição de vídeo (a aquisição contínua de vídeo não é prática devido ao tamanho do arquivo) e também pode ser usada para acionar intervenções (por exemplo, optogenética) em momentos precisos. Finalmente, os frames video individuais são disparados pelos pulsos da lógica do transistor-transistor (TTL), permitindo que o vídeo seja sincronizado precisamente com as gravações neural (por exemplo, eletrofisiologia ou fotometria). Aqui, descrevemos como construir este sistema, treinar ratos para executar a tarefa, sincronizar o aparelho com sistemas externos, e reconstruir as trajetórias de alcance 3-D.

Protocolo

Todos os métodos que envolvem o uso animal aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de Michigan.

1. Configurando a câmara de alcance

Nota: Ver Ellens et al.¹⁴ para detalhes e diagramas do aparelho. Os números de peça referem-se à Figura 1.

1. Painéis claros do policarbonato da ligação com cimento acrílico para construir a câmara de alcance (15 cm largamente por 40 cm por muito tempo por 40 cm de altura) (parte #1). Um painel lateral (parte #2) tem uma porta articulada (18 cm de largura por 15 cm de altura) com um cadeado. Se o rato será amarrado a um cabo, corte uma fenda (5 cm de largura por 36 cm de comprimento) no teto da câmara para acomodá-lo (parte #12). O painel do assoalho tem 18 furos (diâmetro de 1,75 cm) (parte #13) cortado nele e não é lig ao descanso da câmara.
2. Monte e alinhe sensores infravermelhos (parte #3) nos painéis laterais 4,5 cm da parte traseira da câmara e 3,8 cm do assoalho. O software comportamental tem um indicador (' IR voltar ') que é verde quando o feixe de infravermelho é ininterrupta e vermelho quando o feixe é quebrado. Uma vez que o software é configurado, isso pode ser usado para verificar o alinhamento do sensor.
3. Montar um espelho (15 cm x 5 cm, parte #4) 10 cm acima da ranhura de alcance (parte #14). Ângulo do espelho para que a haste de entrega da pelota é visível para a câmera.
4. Coloque a câmara sobre uma caixa de apoio higientizável (59 cm de largura por 67,3 cm de comprimento por 30,5 cm de altura, parte #5). A câmara repousa sobre um orifício na caixa de apoio (12 cm de largura por 25 cm de comprimento) que permite que a maca caia pelos orifícios do piso (parte #13) e fora da câmara de alcance. Corte um segundo furo (7 cm de largura por 6 cm de comprimento, peça #15) na caixa de suporte na frente do slot de alcance, o que permite que uma haste de entrega da pelota traga pelotas para o slot de alcance.
5. Monte dois espelhos (8,5 cm de largura x 18,5 cm de altura, parte #6) para o chão com ímãs em ambos os lados da câmara de modo que a borda longa do espelho está tocando o painel lateral 3 cm da frente da caixa de alcance. Ângulo os espelhos de modo que a câmera pode ver na caixa e na área na frente da ranhura de alcance onde a pelota será entregada.
6. Monte a câmera de alta definição (parte #7) 17 cm da ranhura de alcance, de frente para a caixa.
7. Monte o papel preto (parte #18) em ambos os lados da câmera para que o fundo nos espelhos laterais esteja escuro. Isso aumenta o contraste para melhorar a detecção de pata em tempo real e off-line.
8. Monte o atuador linear (parte #16) em um frame sanitizable (25 cm largamente por 55 cm por muito tempo por 24 cm de altura, parte #8) com parafusos. O atuador é montado de cabeça para baixo para evitar que a poeira da pelota se acumule dentro do seu potenciômetro de detecção de posição.
9. Insira um anel-O em espuma no pescoço do reservatório da pelota (funil) (parte #9) para evitar que a poeira se acumule na montagem. Monte o funil abaixo de um furo (~ 6 cm de diâmetro, parte #17) na parte superior do quadro, deslizando as bordas do funil acima de três parafusos perfurados na parte inferior do topo do quadro. Insira o tubo guia (parte #10) no pescoço do funil.
10. Prenda o conector T de plástico à extremidade da haste de aço do atuador. Insira a extremidade cônica da haste de entrega da pelota na parte superior do conector e a extremidade do mãos colocadas através do tubo guia no reservatório da pelota.
11. Coloc o conjunto do atuador linear a câmara de alcance hábil de modo que a haste de entrega da pelota possa estender através do furo (parte #15) na frente do entalhe de alcance.
12. Coloc o instrumento de alcance inteiro em um armário rodado (121 cm x 119 cm x 50 cm) ventilado com ventiladores de computador (o interior começ morno quando well-lit) e alinhado com espuma acústica.
13. Construir cinco painéis de luz (parte #11) aderindo tiras de luz LED em 20,3 cm por 25,4 cm painéis de apoio. Monte a película do difusor sobre as tiras claras. Monte um painel de luz no teto sobre a área da haste de entrega da pelota. Monte os outros quatro nos lados dos armários ao longo da câmara de alcance.
    Nota: é importante iluminar a área em torno do entalhe de alcance e da haste de entrega da pelota para a identificação em tempo real da pata.

2. Configurando o computador e o hardware

1. Instale o grabber de quadros FPGA e os cartões de extensão digital de acordo com as instruções do fabricante (consulte a tabela de materiais).
   Observação: Recomendamos pelo menos 16 GB de RAM e um disco rígido interno de estado sólido para armazenamento de dados, como streaming de vídeo de alta velocidade requer capacidade de armazenamento em buffer significativa.
2. Instale os drivers para a câmera de alta definição e conecte-o ao framegrabber FPGA. O software comportamental deve estar rodando e interfaceando com a câmera para usar o software associado à câmera.
   Nota: o código incluído (ver ficheiros suplementares) acede a registos programáveis na câmara e pode não ser compatível com outras marcas. Recomendamos gravar pelo menos em 300 frames por segundo (FPS); em 150 FPS descobrimos que as principais mudanças na postura da pata eram muitas vezes perdidas.
3. Copie o código incluído (projeto) em "SR Automation_dig_ext_card_64bit" para o computador.

3. treinamento comportamental

1. Prepare ratos antes do treinamento.
   1. Casa Long-Evans ratos (masculino ou feminino, idades 10-20 semanas) em grupos de 2 – 3 por gaiola em um reverso luz/ciclo escuro. Três dias antes do treino, coloque os ratos na restrição alimentar para manter o peso corporal 10 – 20% abaixo do valor basal.
   2. Manuseie ratos por vários minutos por dia durante pelo menos 5 dias. Após a manipulação, coloc 4 – 5 pelotas do açúcar por o rato em cada gaiola Home para introduzir o alimento novo.
2. Habituar o rato à câmara de alcance (1 – 3 dias)
   1. Ligue as luzes LED e coloque 3 pelotas de açúcar na parte dianteira e traseira da câmara.
   2. Coloque o rato na câmara e permitir que o rato para explorar por 15 min. monitor se ele come as pelotas. Repita esta fase até que o rato come todas as pelotas fora do assoalho.
   3. Limpe a câmara com etanol entre ratos.
      Nota: realize treinamentos e testes durante a fase escura. Treinar ratos ao mesmo tempo diariamente.
3. Treinar o rato para alcançar e observar a preferência da pata (1 – 3 dias).
   1. Gire sobre as luzes e coloc o rato na câmara de alcance hábil.
   2. Usando fórceps, segure um pellet através da ranhura de alcance na frente da caixa (Figura 1, Figura 2). Deixe o rato comer 3 pelotas do fórceps.
   3. A próxima vez que o rato tentar comer o pellet do fórceps, puxe a pelota para trás. Eventualmente, o rato tentará alcangar para a pelota com sua pata.
   4. Repita este 11 vezes. A pata que o rato usa a maioria das 11 tentativas é a "preferência pata" do rato.
      Nota: uma tentativa é definida como a pata que alcanga para fora após o entalhe de alcance. O rato não precisa obter com sucesso e comer o pellet.
4. Treinar o rato para chegar à haste de entrega da pelota (1 – 3 dias)
   1. Alinhe a haste de entrega da pelota com o lado do entalhe de alcance contralateral à pata preferida do rato (use um guia para assegurar a colocação consistente 1,5 cm da parte dianteira da câmara de alcance). A parte superior da haste de entrega deve alinhar-se com a parte inferior da ranhura de alcance (Figura 2b). Coloque um pellet na haste de entrega.
      Nota: posicionar a haste de entrega em frente à pata preferida do rato torna difícil para o rato obter a pelota com a sua pata não preferida. Não tivemos problemas com ratos usando sua pata não preferida. Entretanto, em determinados modelos (por exemplo, curso) isto pode ainda ocorrer e uma limitação no membro de alcance não-preferido pode ser adicionada.
   2. Isca o rato com uma pelota realizada usando fórceps, mas direcionar o rato para a haste de entrega de modo que sua pata atinge o pellet na haste. Se o rato derruba o pellet fora da haste, substituí-lo. Alguns ratos não podem inicialmente chegar longe o suficiente. Neste caso, mova a haste de entrega da pelota mais perto do entalhe de alcance e mova-a então lentamente mais afastado enquanto o rato melhora.
   3. Depois de cerca de 5 – 15 iscadas atinge o rato começará a chegar para o pellet na haste de entrega espontaneamente. Uma vez que o rato tentou 10 alcances à haste de entrega sem ser baited, pode avançar à fase seguinte.
5. Treinar o rato para pedir um pellet (2 – 8 dias).
   Nota: embora tenhamos tido 100% de sucesso de formação de ratos para alcançar Pelotas, cerca de 10% dos ratos não conseguem aprender a pedir uma pelota, movendo-se para a parte de trás da câmara.
   1. Posicione a haste de entrega da pelota com base na preferência da pata do rato e defina-a para a posição 2 (Figura 2a). Ajuste as posições da altura da haste de entrega da pelota usando o controle remoto do atuador. Segurando os botões 1 e 2 simultaneamente move a haste de entrega para cima, enquanto segurando os botões 3 e 2 move a haste de entrega para baixo. Quando a haste de entrega está na altura correta, mantenha pressionado o número desejado até que a luz pisca em vermelho para definir.
   2. Coloque o rato na câmara e isca o rato para trás com um pellet. Quando o rato se move suficientemente longe para a parte de trás da câmara que iria quebrar o feixe de infravermelhos se a versão automatizada estava em execução, mova a haste de entrega da pelota para a posição 3 (Figura 2b).
   3. Aguarde até que o rato chegue para o pellet e, em seguida, mova a haste de entrega da pelota de volta para a posição 2 (Figura 2a). Coloque um novo pellet na haste de entrega se ele foi derrubado.
   4. Repita estas etapas, gradualmente baiting o rato menos e menos, até que o rato comece a: (i) Mova-se para trás para pedir um pellet sem ser baited, e (II) Mova-se imediatamente para a parte dianteira após ter pedido um pellet na parte traseira. Uma vez que o rato fêz este 10 vezes, está pronto para treinar na tarefa automatizada.

4. treinamento de ratos usando o sistema automatizado

1. Configure o sistema automatizado.
   1. Acender as luzes na câmara e encher o reservatório da pelota, se necessário.
   2. Posicione a haste de entrega da pelota de acordo com a preferência da pata do rato. Verifique se as posições do atuador estão ajustadas corretamente (como na Figura 2a).
   3. Ligue o computador e abra o programa de alcance habilidoso (SR_dig_extension_card_64bit_ (HOST) _ 3. vi). Digite o número de identificação do rato em assunto e selecione a preferência de pata no menu suspenso mão . Especifique o caminho de salvamento para os vídeos.
   4. Definir tempo de sessão e máximo de vídeos (número de vídeos no qual terminar a sessão em). O programa irá parar de funcionar em qualquer limite é atingido primeiro.
   5. Ajuste a duração do elevador da pelota (duração do tempo que a haste de entrega permanece na posição "3" depois que o rato pede um pellet). Ative ou desative a penalidade de alcance antecipado (a haste de entrega redefine para a posição "1" e depois volta para "2" se o rato chegar antes de solicitar um pellet).
2. Tirar imagens de calibração. A reconstrução da trajetória 3-D usa uma caixa de ferramentas de visão computacional para determinar as matrizes de transformação apropriadas, o que requer a identificação de pontos correspondentes em cada vista. Para fazer isso, use um pequeno cubo com padrões de tabuleiro de xadrez em cada lado (Figura 3).
   1. Coloc a mão amiga dentro da câmara de alcance e picar o grampo do jacaré através da ranhura de alcance. Segure o cubo na frente da ranhura de alcance com o clip jacaré.
   2. Posicione o cubo de modo que o lado vermelho apareça no espelho superior, o lado verde no espelho esquerdo e o lado azul no espelho direito. Toda a face de cada um dos três lados deve ser visível nos espelhos (Figura 3).
   3. No programa comportamental, certifique-se de que o ROI Threshold esteja definido para um valor muito grande (por exemplo, 60000). Clique no botão Executar (seta branca). Uma vez que o botão inicializado da câmera fica verde, pressione Start. Observe que o vídeo está sendo adquirido.
   4. Clique em modo Cal. Em seguida, pegue uma imagem clicando em tirar Cal Image. O caminho do diretório de imagem aparecerá agora em "caminho. png" com o nome de arquivo. png formatado como "GridCalibration_YYYYMMDD_img #. png".
   5. Mova o cubo levemente e pegue outra imagem. Repita novamente para um total de 3 imagens.
   6. Pare o programa clicando em parar e, em seguida, o botão parar sinal. Retire a mão amiga e o cubo da caixa.
   7. Tenha cuidado para não bater nada na câmara comportamental depois de imagens de calibração foram tiradas naquele dia. Se algo se move, novas imagens de calibração precisam ser tomadas.
3. Execute o sistema automatizado.
   Observação: Determine as configurações de "limiar de ROI" (descritas abaixo) para cada espelho antes de executar ratos para a aquisição de dados real. Uma vez que essas configurações foram determinadas, pré-defini-las antes de iniciar o programa e ajustar durante a aquisição, se necessário.
   1. Coloc o rato na câmara de alcance hábil. Clique na seta branca para executar o programa.
   2. Antes de clicar em Iniciar, defina a posição do ROI para a detecção de pata ajustando x-offset (coordenada x do canto superior esquerdo do retângulo de ROI), deslocamento y (coordenada y do canto superior esquerdo do ROI), largura do ROI e Altura do ROI.
   3. Posicione o ROI no espelho lateral que mostra o dorso da pata, diretamente na frente do slot de alcance (Figura 2C). Certifique-se de que a haste de entrega da pelota não entra no ROI e que o ROI não se estende na caixa para impedir que a pelota ou a pele do rato disparem um vídeo quando o rato não está alcançando.
   4. Clique em Iniciar para iniciar o programa.
   5. Ajuste o valor do "limiar de ROI baixo" até que o "valor do disparador do ROI vivo" esteja oscilando entre "0" e "1" (quando o rato não está alcangando). Esse valor é o número de pixels dentro do ROI com valores de intensidade no intervalo de limite.
   6. Defina o limiar de ROI. Observe o valor de gatilho de ROI ao vivo quando o rato pica seu nariz para o ROI e quando o rato atinge o pellet. Defina o limiar de ROI para ser significativamente maior do que o "Live ROI Trigger Value" durante Pokes nariz e inferior ao "Live ROI Trigger Value" quando o rato atinge. Ajustar até que os vídeos são acionados consistentemente quando o rato atinge, mas não quando ele pica seu nariz através do slot
      Nota: isto supõe que a pata é de cor mais clara do que o nariz; os ajustes seriam invertidos se a pata é mais escura do que o nariz.
   7. Monitore os primeiros testes para garantir que tudo esteja funcionando corretamente. Quando um rato atinge antes de solicitar uma pelota (haste de entrega na posição "2"), o número "Early atinge" aumenta. Quando um rato atinge depois de solicitar uma pelota (haste de entrega na posição "3"), o número de "vídeos" aumenta e um vídeo é salvo como um arquivo. bin com o nome "RXXXX_YYYYMMDD_HH_MM_SS_trial #".
      Nota: o padrão é para que os vídeos contenham 300 frames (isto é, 1 s) antes e 1000 frames após o evento do disparador (isto é configurável no software), que é suficientemente longo para conter o movimento inteiro do alcance-à-aperto que inclui a retração da pata.
   8. Uma vez que o tempo de sessão ou máximo de vídeos é atingido, o programa pára. Pressione o botão parar sinal.
   9. Limpe a câmara com etanol e repita com outro rato, ou se feito para o dia proceder à conversão de vídeos.
4. Converta arquivos. bin em arquivos. avi.
   Nota: comprimir vídeos durante a aquisição provoca quadros ignorados, para que os ficheiros binários são transmitido para o disco durante a aquisição (utilizar uma unidade de estado sólido devido a taxas de transferência de dados de alta). Esses arquivos binários devem ser compactados off-line ou os requisitos de armazenamento são proibitivamente grandes.
   1. Abra o programa "bin2avi-color_1473R_noEncode. vi".
   2. Em "controle de caminho do arquivo" clique no botão de pasta para selecionar a sessão (por exemplo, R0235_20180119a) que você deseja converter. Repita para cada sessão (até seis).
   3. Clique na seta branca (executar) e, em seguida, "START" para começar. Você pode monitorar a compactação de vídeo no "progresso geral (%)" Bar. Deixe o programa executar durante a noite.
   4. Antes de começar a treinar animais no dia seguinte, verifique se os vídeos foram convertidos e exclua os arquivos. bin para que haja espaço suficiente para adquirir novos vídeos.

5. analisando vídeos com o DeepLabCut

Nota: as redes diferentes são treinadas para cada preferência da pata (pata direita e pata esquerda) e para cada vista (vista direta e vista do espelho esquerdo para ratos pawed direito, vista direta e vista direita do espelho para ratos pawed esquerdos). A vista de espelho superior não é usada para reconstrução 3D — apenas para detectar quando o nariz entra no slot, o que pode ser útil para desencadear intervenções (por exemplo, optogenética). Cada rede é então usada para analisar um conjunto de vídeos recortados para a pata e a vista correspondentes.

1. Treine as redes DeepLabCut (instruções detalhadas são fornecidas na documentação do DeepLabCut no https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut).
   1. Crie e configure um novo projeto no deeplabcut, um algoritmo de aprendizado de máquina para estimativa de pose de alinhamento¹³.
   2. Use o programa para extrair quadros do habilidoso alcançando vídeos e recortar imagens para a exibição para incluir (visão direta ou espelho) na interface do programa. Os frames da colheita grandes bastante de modo que o rato e ambas as patas dianteiras sejam visíveis.
      Observação: normalmente, as redes exigem 100 – 150 quadros de treinamento. Mais quadros de treinamento são necessários quando a pata está dentro, em comparação com fora da câmara por causa da iluminação. O recorte mais apertado reduz o tempo de processamento, mas tenha cuidado para que as regiões cortadas sejam suficientemente grandes para detectar a trajetória completa da pata para cada rato. Deve ser largo bastante para que o corpo inteiro do rato ajuste no frame (vista direta), e para ver tão distante para trás na câmara como possível e na frente da haste de entrega (vista do espelho).
   3. Use o programa GUI para rotular partes do corpo. A etiqueta 16 aponta em cada quadro: 4 junções metacarpophalangeal (MCP), 4 junções interphalangeal proximal (PIP), 4 pontas do dígito, o dorso da pata de alcance, o nariz, o dorso da pata não-alcangando, e o pellet (Figura 4).
   4. Siga as instruções DeepLabCut (abreviadas como DLC doravante) para criar o conjunto de dados de treinamento, treinar a rede e avaliar a rede treinada.
2. Analise vídeos e refine a rede.
   1. Antes de analisar todos os vídeos com uma rede recém-treinada, analise 10 vídeos para avaliar o desempenho da rede. Se houver erros consistentes em determinadas poses, extraia quadros de treinamento adicionais contendo essas poses e retreine a rede.
   2. Ao analisar vídeos, certifique-se de arquivos. csv de saída, que serão alimentados no código para a reconstrução da trajetória 3D.

6. calibração da caixa

Observação: essas instruções são usadas para determinar as matrizes de transformação para converter pontos identificados nas exibições diretas e espelhadas em coordenadas 3-D. Para obter a versão mais atualizada e mais detalhes sobre como usar o pacote boxCalibration, consulte o Leventhal Lab GitHub: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration, que inclui instruções passo a passo para seu uso.

1. Colete todas as imagens de calibração na mesma pasta.
2. Usando ImageJ/Fiji, marque manualmente os pontos de tabuleiro de xadrez para cada imagem de calibração. Guarde esta imagem como "GridCalibration_YYYYMMDD_ #. tif" onde ' YYYYMMDD ' é a data em que a imagem de calibração corresponde e ' # ' é o número da imagem para essa data.
   1. Use a função de medição no ImageJ (na barra de ferramentas, selecione Analyze | Medida). Isso exibirá uma tabela contendo coordenadas para todos os pontos marcados. Guarde este ficheiro com o nome "GridCalibration_YYYYMMDD_ #. csv", onde a data e o número da imagem são os mesmos que o ficheiro. tif correspondente.
3. No pacote Boxcalibration , abra o arquivo ' SetParams. m '. Este arquivo contém todas as variáveis necessárias e sua descrição. Edite variáveis conforme necessário para ajustar as especificações do projeto.
4. Execute a função Calibrateboxes . Várias solicitações serão exibidas na janela de comando. O primeiro prompt pergunta se deve analisar todas as imagens na pasta. Digitando Y terminará os prompts, e todas as imagens para todas as datas serão analisadas. Digitando N solicitará que o usuário insira as datas a serem analisados.
   Observação: dois novos diretórios serão criados na pasta de imagens de calibração: ' markedImages ' contém arquivos. png com as marcas de tabuleiro de xadrez definidas pelo usuário na imagem de calibração. A pasta ' boxCalibration ' contém arquivos. Mat com os parâmetros de calibração da caixa.
5. Execute a função Checkboxcalibration . Isso criará uma nova pasta, ' checkCalibration ' na pasta ' boxCalibration '. Cada data terá uma subpasta contendo as imagens e vários arquivos. Fig, que são usados para verificar se a calibração da caixa foi concluída com precisão.

7. reconstruindo trajetórias 3D

1. Monte os arquivos. csv que contêm a saída do programa de aprendizado na estrutura de diretórios descrita no script reconstruct3Dtrajectories .
2. Executar reconstruct3Dtrajectories. Este script irá Pesquisar a estrutura do diretório e corresponder pontos diretos/espelho com base em seus nomes no programa de inclinação (é importante usar os mesmos nomes de partes do corpo em ambos os modos de exibição).
3. Executar Calculatekinematics. Este script extrai características cinemáticas simples das reconstruções de trajetória 3-D, que podem ser adaptadas às necessidades específicas.
   Nota: o software estima a posição das partes do corpo fechadas com base em seus vizinhos e sua localização na vista complementar (por exemplo, a localização de uma parte do corpo na visão direta da câmera restringe seus locais possíveis na vista de espelho). Para momentos em que a pata é oclusada na vista de espelho à medida que passa através do slot, as coordenadas da pata são interpoladas com base em quadros vizinhos.

Resultados

Os ratos adquirem a tarefa de alcance hábil rapidamente uma vez aclimatados ao aparelho, com desempenho platô em termos de ambos os números de alcances e exatidão sobre 1 – 2 semanas (Figura 5). A Figura 6 mostra quadros de vídeo de amostra indicando estruturas identificadas pelo DeepLabCut, e a Figura 7 mostra trajetórias de alcance individual sobrepostas de uma única sessão. Finalmente, na Figura 8

Discussão

O alcance hábil do roedor transformou-se uma ferramenta padrão para estudar a fisiologia e a patofisiologia do sistema motor. Nós descrevemos como implementar uma tarefa de alcance hábil de rato automatizado que permite: treinamento e teste com supervisão mínima, a reconstrução da trajetória da pata 3-D e do dígito (durante alcangando, agarrando, e retração da pata), identificação do tempo real do pata durante o alcance, e sincronização com eletrônica externa. É adequado para correlacionar a cinemática...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
clear polycarbonate panels	TAP Plastics		cut to order (see box design)
infrared source/detector	Med Associates	ENV-253SD	30" range
camera	Basler	acA2000-340kc	2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link
camera lens	Megapixel (computar)	M0814-MP2	2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus
camera cables	Basler	#2000031083	Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables
mirrors	Amazon
linear actuator	Concentrics	LACT6P	Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer
pellet reservoir/funnel	Amico (Amazon)	a12073000ux0890	6" funnel
guide tube	ePlastics	ACREXT.500X.250	1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long
pellet delivery rod	ePlastics	ACRCAR.250	0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length)
plastic T connector	United States Plastic Corp	#62065	3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee
LED lights	Lighting EVER	4100066-DW-F	12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool
Light backing	ePlastics	ACTLNAT0.125X12X36	0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet
Light diffuser films	inventables	23114-01	.007x8.5x11", matte two sides
cabinet and custom frame materials	various (Home Depot, etc.)		3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure)
acoustic foam	Acoustic First		FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick)
ventilation fans	Cooler Master (Amazon)	B002R9RBO0	Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers
cabinet door hinges	Everbilt (Home Depot	#14609	continuous steel hinge (1.4" x 48")
cabinet wheels	Everbilt (Home Depot	#49509	Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake
cabinet door handle	Everbilt (Home Depot	#15094	White light duty door pull (4.5")
computer	Hewlett Packard	Z620	HP Z620 Desktop Workstation
Camera Link Frame Grabber	National Instruments	#781585-01	PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full
Multifunction RIO Board	National Instruments	#781100-01	PCIe-17841R
Analog RIO Board Cable	National Instruments	SCH68M-68F-RMIO	Multifunction Cable
Digital RIO Board Cable	National Instruments	#191667-01	SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series
Analog Terminal Block	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
Digital Terminal Block	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
24 position relay rack	Measurement Computing Corp.	SSR-RACK24	Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel
DC switch	Measurement Computing Corp.	SSR-ODC-05	Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A
DC Sense	Measurement Computing Corp.	SSR-IDC-05	solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC
DC Power Supply	BK Precision	1671A	Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply
sugar pellets	Bio Serv	F0023	Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored)
LabVIEW	National Instruments	LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions	64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW
MATLAB	Mathworks	Matlab R2019a	box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox