JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكولًا لتوليد خلايا CD8 T الخاصة بالمستضد، وتوسيعها في المختبر، بهدف إنتاج أعداد كبيرة من الخلايا T الوظيفية لاستخدامها في المختبر وفي الجسم الحي.

Abstract

يتميز مرض السكري من النوع 1 (T1D) بالحصانة الذاتية الخاصة بالأنواع مما يؤدي إلى تدمير خلايا بيتا والفقدان المطلق لإنتاج الأنسولين. في نموذج الماوس غير السمنة التلقائي ة مرض السكري (NOD)، الأنسولين هو الهدف الرئيسي، والتلاعب الوراثي لهذه الحيوانات لإزالة epitope الأنسولين مفتاح واحد يمنع المرض. وهكذا، فإن القضاء الانتقائي على المستضد المهني للخلايا المقدمة (APCs) التي تحمل هذا الظهارة المسببة للأمراض هو نهج لمنع استجابات المناعة الذاتية غير المرغوب فيها الخاصة بالأنسولين، ومن المرجح أن يكون لديه إمكانات أكبر للترجمة.

يمكن لمستقبلات مستضد الشميري (CARs) إعادة توجيه الخلايا T لاستهداف المستضدات المسببة للأمراض بشكل انتقائي. هذه التقنية أساسية للمحاولات الأخيرة لاستخدام الهندسة الخلوية لعلاج الخلايا بالتبني لعلاج السرطانات المتعددة. في هذا البروتوكول، ونحن نصف الأمثل T-خلية الرجعية (RV) transduction وبروتوكول التوسع في المختبر الذي يولد أعدادا كبيرة من الخلايا وظيفية مستضد محدد CD8 CAR-T بدءا من عدد قليل من الخلايا السذاجة. وقد تم وصف بروتوكولات خلايا CAR-T متعددة في السابق، ولكن عادة مع كفاءة تحويل منخفضة نسبيا وصلاحية الخلية بعد التحويل. وعلى النقيض من ذلك، يوفر بروتوكولنا ما يصل إلى 90٪ من كفاءة التحويل، والخلايا التي تم إنشاؤها يمكن البقاء على قيد الحياة أكثر من أسبوعين في الجسم الحي وتأخير كبير بداية المرض بعد ضخ واحد. نحن نقدم وصفا مفصلا لصيانة الخلايا وبروتوكول التحويل، بحيث يمكن اتباع الخطوات الحرجة بسهولة. يمكن تنفيذ الإجراء بأكمله من عزل الخلية الأساسية إلى تعبير CAR في غضون 14 يومًا. يمكن تطبيق الطريقة العامة على أي نموذج مرض الماوس الذي يعرف الهدف. وبالمثل، فإن التطبيق المحدد (الذي يستهدف مركباً من الفئة الثانية للبببتيد المسبب للأمراض) ينطبق على أي نموذج آخر من نماذج أمراض المناعة الذاتية التي تم تحديد مركب رئيسي لها.

Introduction

وبالنظر إلى احتمال انخفاض خطر الآثار غير المرغوب فيها خارج الهدف، فإن العلاجات المناعية الخاصة بالمستضد (ASI) هي علاجات واعدة لأمراض المناعة الذاتية مثل T1D. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن الاستجابات المناعية للأنسولين (بريبرو) قد تكون ذات أهمية خاصة في T1D1. في العقد الماضي، والدراسات من مجموعات متعددة، بما في ذلك منطقتنا، تشير بقوة إلى أن تقديم epitope التي تحتوي على الأنسولين B سلسلة الأحماض الأمينية 9 إلى 23 من قبل جزيئات محددة MHC الفئة الثانية (B:9-23/MHCII)، يلعب دورا هاما في تطوير T1D في الفئران والبشر2،3،4،5. لاستهداف مجمع B:9-23/MHCII بشكل انتقائي، قمنا بإنشاء جسم مضاد أحادي النسيلة، اسمه mAb287، ليس لديه تفاعل متقاطع مع هرمون الأنسولين أو المجمعات التي تحتوي على ببتيدات أخرى6. MAb287 كتل عرض مستضد في المختبر، والإدارة الأسبوعية من mAb287 إلى الفئران NOD ما قبل السكري تأخر تطوير T1D في 35٪ من الفئران المعالجة6. لمنع عرض مستضد في الجسم الحي, وعادة ما تكون هناك حاجة إلى الحقن المتكررة من أجل الحفاظ على تركيز تعميم عالية. افترضنا أننا يمكن التغلب على هذه الصعوبة من خلال الاستفادة من خصوصية عالية من Ab287 لإعادة برمجة الخلايا T، وبالتالي توفير تحسين العلاج بالخلايا T مستضد محددة لT1D7.

ويقال أن الخلايا T السامة للخلايا لتكون قادرة على قتل هدفهم إذا تم التعبير عن حتى نسخة واحدة من ligand كونيت8،9،10. وهكذا، B:9-23/MHCII خلايا CD8 T محددة من المتوقع أن يكون أعلى كفاءة في القضاء على العرض التقديمي مستضد غير المرغوب فيه من الأجسام المضادة الأم، والتي من المرجح أن تحتاج إلى ربط إلى مجمعات متعددة على نفس APC لممارسة تأثيرها. وقد استخدمت خلايا CAR T لعلاج السرطانات البشرية المتعددة11،12،13،ويمكن أيضا أن تكون فعالة في المناعة الذاتية14. ومع ذلك، لم يتم استخدام خلايا CAR-T مع خصوصية لمجمعات الببتيد-MHC المسببة للأمراض حتى الآن لتعديل تطور T1D. باستخدام تقنية نقل الخلايا CD8 T الأمثل الموضحة أدناه، أظهرنا مؤخرًا إثباتًا للمبدأ بأن هذا يمثل في الواقع نهجًا قابلًا للتطبيق7.

وفي هذا البروتوكول، نحدد طريقة فعالة ومبسطة للتنقل والتوسع. بروتوكولنا ينطبق على دراسات أخرى تتطلب توليد الماوس CD8 CAR T الخلايا مع كفاءة عالية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم الحفاظ على الفئران في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في مرفق الماوس المعدلة وراثيا، وأجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها كلية بايلور للرعاية الحيوانية والاستفادة منها لجنة.

ملاحظة: تتطلب التجربة إعداد الفيروس والخلايا T في نفس الوقت. ويلخص الجدول 1 البروتوكول. يتم سرد الكواشف الرئيسية والمخازن المؤقتة في جدول المواد. ونحن نركز على توليد وتوسيع خلايا CAR-T التي تستهدف مجموعات محددة من الناقلات المضادة للأفراد في هذا البروتوكول.

1. توليد والتحقق من صحة واحدة سلسلة فاب الأجسام المضادة (scFab) -CARs.

ملاحظة:تحتوي CARs عادةً على 3 مجالات حرجة - مجال استهداف مستضد ومجال فاصل/عبر الغشاء ومجال إشارة السيتوبلازمية. ويعتمد التصميم الدقيق لكل سيارة من سيارات أفريقيا على الهدف المقصود، وبالتالي، وبصرف النظر عن السمات الرئيسية للبناء ذات الصلة بتوليد الفيروس الرجعي، لن يرد وصف تفصيلي في هذا البروتوكول. ويرد في الشكل 1التصميم العام للتقارير CA المستخدمة في الدراسات المبينة أدناه. وباختصار، يشمل مجال الاستهداف سلسلة الضوء بأكملها والنطاق المتغير وCH1 للسلسلة الثقيلة من الأجسام المضادة أحادية النسيلة الأم المرتبطة بوصلة شبه جامدة. المجال فاصل/عبر الغشاء من الماوس CD28 ومجال الإشارة هو انصهار يحتوي على عناصر من الماوس CD28 و CD137 (4-1BB) و CD247 (CD3י). يتم تجميع هذه العناصر من خلال إجراءات البيولوجيا الجزيئية القياسية مثل لصق تتداخل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، أو تركيب "كتلة الجينات" المناسبة. وترد تفاصيل توليد MAB287 CAR في تشانغ وآخرون7. ويمكن الحصول على تسلسل اتّباع الـ cDNA من المؤلفين عند الطلب.

  1. تجميع بناء CAR
    1. توليف استهداف سلسلة واحدة Fab الأجسام المضادة (scFab) والجمع بين المجالات فاصل / إشارة بشكل منفصل، واستخدام "3نقطة" تقنية الربط15 لتجميع البناء النهائي (الشكل 1).
      ملاحظة: الشرط الرئيسي لإدراج CAR هو أنه ينبغي أن تحتوي على مواقع endonuclease تقييد المحيطة السماح ربط في التعبير الفيروسي الرجعي ناقلات pMSCV-IRES-GFP الثاني (pMIG II)، أو مشتق ذات الصلة15 هي أيضا المناسبه.
  2. التحقق من صحة التعبير السطحي CAR
    1. تحويل خلايا الورم الهجين باستخدام pMIG II المستمدة من الجسيمات الفيروسية الرجعية الناتجة عن بروتوكول قياسي (على سبيل المثال، Holst et al.16).
    2. تشغيل تحليل قياس التدفق للسيتوميللكشف للكشف عن التعبير GFP من ناقلات CAR17.
    3. وصمة عار التعبير السطحي من جمهورية أفريقيا الوسطى من الأورام الهجينة المستحثة باستخدام الأجسام المضادة المسماة ضد سلسلة الماوس (على سبيل المثال، استنساخ RMK-45)17.
      ملاحظة: 18.
  3. التحقق من خصوصية جمهورية أفريقيا الوسطى
    1. تحفيز خلايا الورم الهجين المستحث ة مع مستضدات مناسبة مرتبطة باللوحة أو خلوية. بعد ليلة وضحاها جمع الثقافة المشتركة supernatants والسيتوكينات تفرز، والفحص عن طريق أنزيم المرتبطة الفحص المناعي (ELISA)7.
      ملاحظة:من الناحية المثالية، يجب التحقق من صحة كل سيارة بشكل مستقل قبل استخدامها للتبديل. في هذه الخطوة، قد يتم إيقاف التجربة مؤقتاً وإعادة تشغيلها لاحقاً.

2. نقل الخلايا المنتجة الفيروسية (اليوم -4 إلى اليوم 3)

ملاحظة: يتم إنتاج الرجعية باستخدام خلايا فينيكس منظمة التعاون الاقتصادي (انظر جدولالمواد)19،20. استخدام الاحتياطات المناسبة لتوليد العوامل المعدية المحتملة (ويفضل أن تشمل مجلس الوزراء BSL-2 المعين وحاضنة منفصلة لزراعة الخلايا المنقولة/المستحثة).

  1. ذوبان خلايا فينيكس (اليوم -4)
    1. ذوبان 2 × 106 فينيكس ايكو الخلايا. زيادة عدد خلايا فينيكس إذا تم التخطيط لأنابيب متعددة.
    2. طبقها في طبق زراعة الأنسجة 10 سم مع 10 مل من المتوسطة (دولبكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)).
  2. مرور خلايا فينيكس (اليوم -3)
    1. إزالة المتوسطة، وغسل مع 5 مل من المالحة دلبيكو الفوسفات المخزنة (DPBS).
    2. إضافة 3 مل من 0.25٪ تريبسين وحضانة في 37 درجة مئوية تحت 10٪ CO2 الغلاف الجوي لمدة 3 دقائق.
    3. حصاد الخلايا ثم بيليه عن طريق الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 × ز. إعادة لوحة الخلايا مع 10 مل المتوسطة الطازجة وحضانة في 37 درجة مئوية.
  3. تشعيع خلايا فينيكس (بعد ظهر اليوم -1)
    1. لتقليل المزيد من انقسام الخلايا، جمع خلايا فينيكس كما هو موضح في الخطوة 2.2، إعادة تعليق في 5 مل من الخلايا المتوسطة، وخلايا أشعة غاما على الجليد (1000 راد).
      ملاحظة:ينبغي توخي الحذر في العمل الإشعاعي لتجنب تعرض الأفراد.
    2. طرد مركزي للخلايا المشععة، وإعادة تعليقفي المتوسطة الطازجة، لوحة في 2 × 106 خلايا (في 10 مل من المتوسطة) / لوحة / CAR، والحضانة.
  4. الانقباة (اليوم 0 - الصباح)
    1. يستنشق supernatant من خلايا فينيكس، وغسل مع 5 مل من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)، وإضافة بعناية 7 مل من انخفاض المصل المتوسطة (على سبيل المثال، Opti-MEM) قطرة إلى الجدار الجانبي لللوحة لتجنب إزعاج الطبقة الأحادية. نقل الخلايا مرة أخرى إلى الحاضنة.
    2. خذ اثنين من أنابيب البولي بروبلين السفلية المستديرة 14 مل، وإضافة 1.5 مل من المصل المنخفض المتوسط لكل منهما. إلى أنبوب واحد، إضافة 40 درجة مئوية من الكاشف transfection (انظر جدول المواد).
    3. إلى الأنبوب الآخر، أضف 15 ميكروغرام من Ab-CAR-plasmid (ولدت في الخطوة 1) و 5 ميكروغرام من المغلف والتعبئة والتغليف بلازميد (5 ميكروغرام pCL-Eco). أنابيب الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. إضافة خليط الكاشف transfection من الخطوة 2.4.2 dropwise إلى الأنبوب الثاني دون الاتصال الجانبين أنبوب، ومزيج عن طريق الأنابيب الحل صعودا وهبوطا بلطف 3 مرات. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على الأقل.
    5. إضافة 3 مل من الخليط قطرة إلى خلايا فينيكس، ووضعها في حاضنة زراعة الأنسجة.
    6. بعد 4-5 ح إضافة 1 مل من FCS. خلايا الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  5. تغيير متوسط (اليوم الأول)
    1. إزالة supernatant التي تحتوي على المجمعات الكاشف بلازميد / الانسياق والتخلص منها وفقا للإجراءات المؤسسية للتعامل مع المواد المعدية. أضف 4 مل من الثقافة الطازجة والدافئة مسبقاً إلى الخلايا.
  6. فيروس الحصاد للترانسدوكتيون (اليوم 2)
    1. جمع المتوسطة التي تحتوي على الفيروس من خلايا فينيكس مع حقنة معقمة، مرشح (0.45 ميكرومتر) لإزالة الحطام الخلية المتبقية، وجمع في أنبوب جديد.
    2. يضاف مخزون rhIL-2 إلى تركيز نهائي قدره 200 وحدة IU/mL. استخدم الفيروس مباشرة للنقل (الخطوة 5.3). إضافة 4 مل من المتوسطة الطازجة إلى خلايا فينيكس ووضعها في الحاضنة.
  7. تكرار جمع الفيروسات (اليوم 3)
    1. كرر الخطوة 2.6، ولكن تجاهل خلايا فينيكس كنفايات معدية بدلاً من إضافة وسط جديد. يتم استخدام هذا supernatant في الخطوة 5.4.

3. الرئيسية CD8 T عزل الخلية وتفعيل (يوم -1 إلى يوم 0)

ملاحظة: سابقا، جمع خلايا CD8 T من الفئران NOD الإناث في 4-5 أسابيع، نقطة زمنية قبل التهاب islet يبدأ21،22. التعامل مع كافة الفئران التالية IACUC البروتوكولات المعتمدة. يتم إثراء خلايا CD8 T من الخلايا اللصقية باستخدام مجموعة اختيار سلبية تجارية.

  1. لوحات طلاء مع الأجسام المضادة CD3 /CD28 (اليوم -1)
    1. إضافة 1 مل من خليط من الأجسام المضادة للماوس CD3 وCD28 (كلاهما في 1 ميكروغرام / مل في PBS) إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا، وحضانة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    2. في اليوم التالي، اغسل الأطباق بـ 1 مل من PBS المعقمة 3 مرات قبل إضافة خلايا murine CD8 T (الخطوة 4.1).
      ملاحظة:يختلف عدد الآبار التي سيتم تغطيتها لكل تجربة، اعتماداً على العدد الإجمالي لخلايا CD8 T المنشطة المطلوبة.
  2. مجموعة من الخلايا الصفر (اليوم 0)
    1. قتل اثنين من الفئران الإناث NOD الذين تتراوح أعمارهم بين 4-5 أسابيع باستخداماستنشاق ثاني أكسيد الكربون تليها قطع الرأس. حصاد الطحال ووضعها على مصفاة الخلية نقع في 10 مل PBS في طبق ثقافة الخلية على الجليد.
    2. في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، وقطع كل الطحال إلى 3-5 قطع، اضغط على الأنسجة مع الغطاس المعقمة من حقنة 3 أو 5 مل لإجبار شظايا الطحال على حدة والسماح للخلايا بالمرور عبر الشبكة السلكية.
    3. إزالة خلايا الدم الحمراء بلطف عن طريق إعادة تعليق الخلايا السمعة في 1:4 المخفف ة الخلية الحمراء الاسفل العازلة (1 مل من الاسفل العازلة في 3 مل من PBS لطحال واحد)، وحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. ثم، تخفيف 10 درجة مئوية من تعليق الخلية مع حل صبغ الأزرق trypan لعد الخلايا مع مقياس الهيموشتوي، وبيليه بقية الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 7 دقائق.
  3. إثراء خلايا CD8 T (اليوم 0)
    1. قم بإثراء خلايا CD8 T عن طريق التحديد السالب باستخدام مجموعة عزل خلايا CD8 T الماوس، باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
      ملاحظة:لضمان النقاء العالي دائمًا تقريب أرقام الخلايا عند حساب حجم الأجسام المضادة biotinylated التي سيتم إضافتها (على سبيل المثال، استخدم حجم الكواشف المقترح لـ 10خلايا 8 خلايا لخلايا محسوبة 9.1 × 107).
    2. تعليق الكريات الخلية في 400 درجة مئوية من العازلة و 100 درجة مئوية من كوكتيل البيوتين الأجسام المضادة لكل 1 × 108 خلايا، مزيج جيدا وحضانة لمدة 5 دقائق في الثلاجة (4 درجة مئوية) للسماح ربط الأجسام المضادة.
    3. إضافة 300 درجة مئوية من وضع العلامات العازلة و 200 درجة مئوية من المضادة للبيوتين الخرز الصغير لكل 1 × 108 الخلايا، مزيج جيدا وحضانة لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    4. أثناء انتظار ربط حبة صغيرة، قم بإعداد عمود الفصل على الفاصل. غسل العمود عن طريق الرين مع 3 مل من المخزن المؤقت وضع العلامات.
    5. تمرير 1000 درجة مئوية من حبة / خلية خليط من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر قبل التحميل على عمود الفصل لإزالة المجاميع الخلية. جمع تدفق العمود من خلال في أنبوب قبل المبردة 15 مل.
    6. غسل العمود وفقا لتعليمات من قبل الشركة المصنعة، وجمع جميع النفايات السائلة في نفس الأنبوب. تحديد رقم الخلية (نفس الخطوة 3.2.4) وجمع عن طريق الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق. ، HEPES والبنسلين-ستربيماتيوسين) والطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق.
    7. إعادة تعليق الخلايا في pre-warmed (37 درجة مئوية) كاملة T خلية المتوسطة بتركيز 0.25-0.5 × 106/مل.

4. تنشيط الخلية T (اليوم 0 إلى 2)

  1. أضف 2 مل من تعليق الخلية (0.25-0.5 × 10 6/mL) إلى كل بئر مغطى من لوحة الأجسام المضادة CD3/CD28 المغلفة 24 بئرًا من الخطوة 3.1.2. استخدام حركة دوامة لتوزيع الخلايا بالتساوي.
    ملاحظة:إضافة الخلايا باستخدام حركة دوامة لتوزيعها بالتساوي وتقليل تأثيرات الحافة. إذا كانت الخلايا تتجمع على طول حافة الآبار، سيتم تقليل كل من معدل التحويل وصلاحية الخلية.
  2. كعنصر تحكم، لوحة نفس العدد من خلايا CD8 T في بئر واحد غير المغلفة من لوحة. حضانة الخلايا في 37 درجة مئوية باستخدام حاضنة غاز CO2 10٪ لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة:بعد 48 ساعة، يمكن تأكيد التنشيط باستخدام المجهر. ستكون الخلايا المنشطة أكبر من الخلايا التي لم تواجه الأجسام المضادة CD3/CD28.

[مكان الشكل 2 هنا]

5. تحويل خلايا CD8 T المنشطة (أيام 1 إلى 3)

ملاحظة:يستخدم هذا البروتوكول أسلوب تحويل تدور. مطلوب جهاز طرد مركزي مع الدوار سوينغ التدريجي ومحولات لوحة ثقافة الأنسجة التي هي قادرة على الحفاظ على درجة حرارة داخلية من 37 درجة مئوية. لضمان أقصى قدر من الكفاءة، في يوم التحويل قبل تسخين الطرد المركزي إلى 37 درجة مئوية قبل جمع الفيروس.

  1. الإعداد من لوحات فيبرونيكتين البشرية المغلفة (اليوم 1 إلى اليوم 2)
    1. في اليوم الأول، أضف 0.5 مل من الفيبرونكتين (50 ميكروغرام/مل في PBS) إلى آبار طبق 24 بئرًا، واحتضنه بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية.
      ملاحظة:عادة، مطلوب اثنين من الآبار المغلفة فيبرونيكتين لكل لوحة من خلايا فينيكس المنقولة.
    2. في اليوم 2 إزالة محلول فيبرونيكتين، واستبدالها ب1 مل من 2٪ ألبوم المصل البقري (BSA) في PBS. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ل "منع" مواقع ملزمة غير محددة.
    3. غسل الآبار المعالجة مع 1 مل من PBS معقمة. بعد إزالة محلول الغسيل، لوحة جاهزة للاستخدام. أو، يمكن ختمها وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  2. مجموعة خلايا CD8 T المنشطة (اليوم 2)
    1. حصاد خلايا CD8 T المنشطة، عد وحساب صلاحية الخلية باستخدام الأزرق تريبان أو أداة آلية مناسبة.
    2. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق في 5 × 106 خلايا قابلة للحياة / مل لنقل. الحفاظ على aliquot صغيرة من الخلايا في الثقافة في وسط الخلية T كاملة في حاضنة CO2 لتوفير السيطرة على الفلورة اللاحقة تنشيط فرز الخلايا من الخلايا المنقولة (الخطوة 6).
      ملاحظة:بعد التنشيط لمدة 48 ساعة، يجب أن يكون العدد الإجمالي للخلايا قد زاد بحوالي 1.5 أضعاف، وأن يكون لها قدرة على البقاء أكبر من 95%.
  3. الانقبش (اليوم الثاني)
    1. إضافة 100 درجة مئوية من تعليق خلية CD8 المنشطة لكل بئر (0.5 × 106 خلايا) إلى لوحة المغلفة فيبرونيكتين. ثم أضف 1.5-2 مل من الوسائط التي تحتوي على الفيروس (من الخطوة 2.6) إلى كل بئر. مزيج باستخدام حركة الدوامة لتوزيع الخلايابالتساوي (الشكل 2).
    2. وضع لوحة في كيس من البلاستيك الرمز البريدي قفل وختم (لتوفير الاحتواء الثانوي). الطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 90 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    3. إزالة لوحة من الطرد المركزي. في السلامة البيولوجية، مجلس الوزراء إزالة بعناية كيس من البلاستيك وضمان أن خارج لوحة ليست ملوثة مع أي وسيلة.
    4. ثم نقل لوحة إلى حاضنة مخصصة 37 درجة مئوية CO2. بعد 4 ساعة، قم بإزالة 1 مل من المتوسط من كل بئر واستبداله بـ 1 مل من وسط خلية T كاملة مُسخّنة مسبقاً. استبدال لوحة في حاضنة CO 2.
      ملاحظة:التعامل مع جميع وسائل الإعلام من الخلايا المستحثة كنفايات معدية.
  4. الانكلد الثاني (اليوم الثالث)
    1. في خزانة السلامة البيولوجية المخصصة، يميل اللوحة التي تحتوي على الخلايا المستحثة عن طريق الاستلقاء على الغطاء وإزالة بعناية معظم المتوسطة (ترك 100-200 درجة مئوية) للتأكد من عدم الاتصال بالخلايا في الجزء السفلي من البئر.
    2. إضافة الوسيط الذي يحتوي على الفيروس الذي تم تجميعه في الخطوة 2.7 ثم كرر الخطوات 5.3.2 إلى 5.3.4.
      ملاحظة:في تجربتنا، نادرا ً ما يحسن الانتقال الثالث من الكفاءة العامة. وبالإضافة إلى ذلك، من المرجح أن تنخفض صلاحية الخلية بشكل كبير إذا تم استخدام تحويل ثالث. إذا كانت الخلايا مطلية بتركيز أعلى من 0.5 × 106/well، قد تصل الخلايا T إلى التقاء بعد الحضانة بين عشية وضحاها بعد الخطوة الانتقالية الثانية. في هذه الحالة، انقسام الخلايا بعد حضانة 4 ح في اليوم 3.
  5. خلايا الغسيل (اليوم 4)
    1. إزالة 1 مل من المتوسط من كل بئر، وإعادة تعليق الخلايا في الوسط المتبقي ونقلها إلى أنبوب 15 مل. غسل الآبار مع 1 مل من خلية T كاملة المتوسطة وإضافة إلى أنبوب يحتوي على الخلايا المجمعة من كل transduction.
    2. الطرد المركزي في 350 × غرام لمدة 7 دقائق، ثم يغسل مرتين عن طريق إعادة تعليق في 2 مل من كامل T خلية المتوسطة والكريات. أخيرا إعادة تعليق في 2 مل من المتوسطة وتحديد رقم الخلية.
      ملاحظة:إذا تم نقل 1 × 106 خلايا في الأصل، يجب أن يكون العائد في هذه المرحلة ~ 3 × 106.
  6. نقل
    1. نقل aliquots من 0.5-1 × 106 خلايا في 2 مل من خلية T كاملة المتوسطة إلى الآبار من لوحة جديدة 24 جيدا وحضانة في 37 درجة مئوية. حوالي 48-72 ساعة بعد نقل الخلايا جاهزة لتحليل التعبير CAR وفرز الخلايا.
      ملاحظة:عدد خلايا CAR-T عادة ما يتضاعف كل 24 ساعة في هذه المرحلة. ومن الأهمية بمكان ألا نسمح لهم بالنمو المفرط. تقسيم الخلايا على الفور إذا كانت الكثافة أعلى من 2 × 106/مل (أو إذا كان متوسط من أي وقت مضى يصبح أصفر مشرق). في تجربتنا تنتشر خلايا CAR-T بشكل أكثر قوة في 24-جيدا و 12-جيدا لوحات مما لو تم نقلها إلى سفينة أكبر.

6- تنقية الخلايا المستحثة عن طريق فرز الخلايا المنشط ة بالفلور (FACS) (اليوم 5 أو اليوم 6)

  1. جمع الخلايا.
    1. إعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات (مع الحرص على عدم التسبب في زبد)، ونقل إلى أنابيب 15 مل والطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق.
    2. إعادة الإيقاف في المخزن المؤقت للفرز (2٪ BSA في PBS المعقمة التي تحتوي على جنتاميسين) في 1 × 106 خلايا / مل. أيضا حصاد عنصر التحكم (un-transduced) خلايا CD8 T من الخطوة 5.2).
      ملاحظة:من 1 × 106 خلايا في اليوم 2، من المتوقع أن ينتج حوالي 2 × 107 الخلايا المستحثة في هذه النقطة الزمنية.
  2. اغسل الخلايا مرة واحدة مع المخزن المؤقت للفرز بواسطة الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 5 دقائق، وإعادة تعليق في 1 × 107 خلايا /مل في المخزن المؤقت الفرز. إزالة aliquot صغيرة للتحكم في التعويضGFP Foxp3 (لاستخدامها في الخطوة 6.4.1)، ووصمة عار الباقي مع CD8 المضادة للماوس المسمى (استنساخ 53-6.7؛ 0.2 ميكروغرام من الأجسام المضادة / 5 × 106 خلايا) عن طريق حضانة لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    1. وبالمثل، وصمة عار aliquot من الخلايا CD8 T غير المستحثة لتوفير مراقبة التعويض عن الفلوروفور وضع العلامات على الأجسام المضادة للCD8 المضادة.
      ملاحظة:تجنب إضافة أزيد الصوديوم إلى أي المخزن المؤقت، لأن هذا سام للخلايا.
  3. اغسل الخلايا المسماة مرتين مع المخزن المؤقت للفرز، ثم قم بإعادة الإيقاف المؤقت في المخزن المؤقت للفرز البارد في 1 × 107 خلايا/مل.
  4. فرز الخلايا.
    1. فرز CD8 GFP+ الخلايا الإيجابية في ما قبل المبردة كاملة T خلية المتوسطة (الشكل3B). خذ aliquot صغيرة لتحليل ما بعد الفرز لتحديد النقاء.
      ملاحظة:لتحقيق أقصى قدر من نقاء الخلايا التي تم فرزها يجب استخدام بوابات ضيقة. استخدم فوهة 100 درجة مئوية لضمان قدرة عالية على البقاء في الخلايا. تقليل مقدار الوقت الذي يتم الاحتفاظ الخلايا التي تم فرزها على الجليد. الخلايا T التي تم الاحتفاظ بها على الجليد لأكثر من 3 ح يستغرق وقتا أطول بكثير لاسترداد من الخلايا المبردة لأقل من 2 ح. وهكذا، إذا كان 3 خطوط الخلايا المنقولة تحتاج إلى فرز، وجمع وتسمية السطر الثاني في حين يتم فرز الأول وهكذا دواليك بدلا من وجود السطرين الثاني والثالث قضاء وقت طويل في 0 درجة مئوية. يمكن أيضًا مراقبة التعبير عن علامات الخلايا T الأخرى مثل CD28 وCD3 (الشكل3C)ولكنه ليس ضروريًا لأغراض الفرز.
    2. (استراتيجية الفرز البديلة) قبل تلطيخ السكان بالجملة، تحليل التعبير CD8 من مجموعة صغيرة من الخلايا T المنقولة. إذا كان النقاء >99% ثم يمكن فرز معظم السكان بأمان فقط على أساس التعبير GFP.

7. توسيع خلايا CAR-T المصنفة (اليوم 5 إلى 10)

  1. CAR-T توسيع الخلية
    1. اغسل خلايا CAR-T التي تم فرزها مرة واحدة، ثم أعيد تعليقها في وسط خلية T كاملة مُسخّنة مسبقًا عند 2.5-5 × 105 خلايا/مل، ولوحة 2 مل aliquots في 24 لوحة جيدة.
    2. عد الخلايا وقسّمها كل يوم أو يومين. عادة ما يتضاعف عدد الخلايا كل يوم حتى ~ اليوم 10، مع البقاء على البقاء فوق 95٪.
      ملاحظة:دون إعادة التحفيز، سوف تتوقف خلايا CAR-T عن الانتشار حول اليوم 10 وتموت في نهاية المطاف. وبالتالي، ينبغي جدولة الاختبارات الوظيفية للخلية T وعمليات النقل بالتبني وفقا لذلك.
  2. استراتيجية التوسع البديلة
    1. بعد الفرز، زراعة خلايا CAR-T في كامل T خلية المتوسطة التي تحتوي على rhIL-2 في 100 U/mL بدلا من 200 U / مل.
      ملاحظة:تنتشر خلايا CAR-T بمعدل أبطأ قليلاً في هذه الوسيلة. ومع ذلك، فإنها غالبا ما تستمر في الانتشار حتى أيام 11 إلى 13 دون إعادة التحفيز. وبالتالي، على الرغم من أن استراتيجية التوسع البديلة هذه لا تولد عدداً أكبر من الخلايا فإنه يوفر نافذة زمنية أطول قليلاً للعمليات النهائية التي يتعين إجراؤها.

8. التحقق من خصوصية مستضد ووظائف الخلايا T CAR.

ملاحظة:يمكن التحقق من خصوصية ملزمة من خلايا CAR T التي تستهدف المجمعات الببتيد / MHC عن طريق تلطيخ رباعي7،23. وبالمثل، يمكن تأكيد وظائفها عن طريق قياس إفراز السيتوكين أو السمية الخلوية بعد التحفيز من قبل الأربطة الكونية الخاصة بهم. يعتبر مرفق تترامر الأساسي التابع للمعهد الوطني للصحة في جامعة إيموري مصدراً موصى به لـ "رباعيات" وبروتوكولات تلطيخ ذات الصلة.

  1. الببتيد-MHC تترامر تلطيخ.
    1. aliquots التسمية من 2 × 105 الخلايا المولدة CAR-T في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الفرز عن طريق الحضانة مع ~ 0.6 ميكروغرام من مستضد الفلورسنت المسمى محددة ورباعيات التحكم في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    2. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 × ز، ثم يغسل مرتين عن طريق إعادة تعليق في 0.5 مل من العازلة الفرز وإعادة الطرد المركزي. وأخيرا، إعادة تعليق الخلايا في 300 درجة مئوية من المخزنالمؤقت الفرز وتحليلها عن طريق قياس التدفق (الشكل 4).
      ملاحظة:لهذه الدراسات، ونحن عادة استخدام BV421 المسمى IAg7-B:9-23(RE) (اختبار) وIAg7-HEL(التحكم) رباعيات. ومع ذلك، يمكن بدلاً من ذلك استخدام أي تركيبة فلوروفور/رباعي مر مناسبة لـ CAR (المركبات) قيد التحقيق. في هذه الحالة، يجب تحسين التركيز والوقت تلطيخ لكل رباعي المستخدمة. يمكن استخدام كل من خلايا CAR-T المصنفة وغير المصنفة لتلطيخ رباعي.
  2. قياس الخصوصية عن طريق التحفيز ligand.
    1. احتضان 2 × 105 فرز خلايا CAR-T في 200 درجة مئوية من السيتوكين خالية من T خلية المتوسطة مع الأربطة المناسبة لوحة ملزمة أو الخلوية.
    2. بعد 6-24 ساعة قياس إنتاج السيتوكين من قبل ELISA أو تلطيخ داخل الخلايا باستخدام بروتوكولات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: لدراساتنا من IAg7-B:9-23 إعادة توجيه الخلايا T، ونحن ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها مع M12C3 murine B-خلية الخلايا الليمفاوية الخلايا المنفية التعبير عن IAG7-B:R3 أو "فارغة" IAG724،25، ثم جمع supernatants وقياس تفرز الماوس الإنترفيرون غاما (IFN-γ) من قبل ELISA26 (الشكل5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

عادةً ما تكون كفاءة التحويل باستخدام هذا البروتوكول ~ 60-90%. في التجربة المبينة في الشكل 3، قبل الفرز تقريبا ، 70 ٪ من خلايا CD8 T شارك في التعبير GFP. كما شاركا في التعبير عن CD28 وCD3 (الشكل3C). الأهم من ذلك، كل من "اختبار" GFP+ الخلايا أيضا ملطخة با?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لإنتاج خلايا CD8 CAR-T الخاصة بالمستضد عن طريق الانكلب الفيروسي. كفاءة نقل بروتوكولنا عادة عالية، ويلاحظ عموما التعبير القوي عن جمهورية أفريقيا الوسطى. تحتفظ خلايا CAR T الموسعة بالميزات الأساسية للخلايا T التي يتم تنشيطها من قبل الوالدين، وخصوصية الأجسام المضاد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

MAb287 ومشتقاتها محمية بموجب براءة اختراع أمريكية صدرت في عام 2014.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل JDRF المنح 1-INO-2015-74-S-B، 2-SRA-2016-238-S-B، و SRA-2-S-2018-648-S-B، جائزة التعليم والعمل في مجال مرض السكري، وصندوق كارولين ويس القانوني للبحوث في الطب الجزيئي في كلية بايلور للطب. تم دعم فرز الخلايا من قبل علم الخلايا وخلية فرز الأساسية في كلية بايلور للطب بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (S10RR024574 و P30CA125123). تم الحصول على جميع رباعيات الببتيد MHC من مرفق نواه رباعي النواة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoethanol (50mM)Gibco21985-02350 μM
5’ RACE PCRClontech634859
anti-mouse CD28 antibodieseBioscience14-0281-86final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibodyeBioscience145-2C11final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γBD Biosciences554410Working concentration at 0.5 µg/ml
BSASigmaA7030
Endo-free Maxi-Prep kitQiagen12362
GentamicinGibco15750-060Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCSHycloneSH30087.03Final 10% FCS
HEPES (100X)Gibco15630-0801X
IAg7-CLIP tetramer-BV421NIH tetramer Facility at Emoryper approvalWorking concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421NIH tetramer Facility at Emoryper approvalWorking concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)ThermoFisher51500056Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Separation BufferMiltenyi Biotec130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation KitMiletenyi Biotec Inc130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation KitMiltenyi Biotec130-104-075
Opti-MEM mediumThermoFisher31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)ThermoFisher1507006350 U/ml
Phoenix-ECO cellsATCCCRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco10010-023
pMIG IIAddgene52107
pMSCV-IRES-GFP IIAddgene52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γBD Biosciences551216Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis bufferSigmaR7767
RetroNectinTakaraT100AWorking concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)Peprotech200-02Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)R&D407-ML-005Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640Gibco11875-093
Sterile Cell StrainersFisher Scientific22-363-548
TrypleGibco12605-028

References

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
  2. Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).
  3. Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
  4. Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).
  5. Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).
  6. Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
  7. Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
  8. Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
  9. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
  10. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
  11. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  12. Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
  13. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
  14. Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).
  15. Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor. N.Y. (1982).
  16. Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).
  17. Johnstone, A., Thorpe, R. Immunochemistry in practice. , 3rd edn, Blackwell Science. Cambridge, MA. (1996).
  18. Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. Lymphocytes: a practical approach. , 2nd ed, Practical approach series. New York. (2000).
  19. Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).
  20. Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).
  21. Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8 (3), e59701(2013).
  22. Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).
  23. Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).
  24. Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).
  25. Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).
  26. Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1501chimerictransductionepitopeCD8 TNOD

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved