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Résumé

Cet article décrit un protocole pour la génération des cellules T CD8 antigène-spécifiques, et leur expansion in vitro, dans le but de produire un nombre élevé de lymphocytes T fonctionnels pour une utilisation in vitro et in vivo.

Résumé

Le diabète de type 1 (T1D) est caractérisé par une auto-immunité spécifique aux islets entraînant la destruction des cellules bêta et la perte absolue de production d'insuline. Dans le modèle spontané de souris de diabète non-obèse (NOD), l'insuline est la cible primaire, et la manipulation génétique de ces animaux pour enlever un épitope d'insuline clé simple empêche la maladie. Ainsi, l'élimination sélective des cellules professionnelles de présentation d'antigène (APC) portant cet épitope pathogène est une approche pour inhiber les réponses autoimmunes insulino-spécifiques non désirées, et a probablement un plus grand potentiel translationnel.

Les récepteurs d'antigènes chimériques (RAC) peuvent rediriger les lymphocytes T vers des antigènes pathogènes de manière sélective. Cette technique est fondamentale pour les tentatives récentes d'utiliser l'ingénierie cellulaire pour la thérapie cellulaire adoptive pour traiter les cancers multiples. Dans ce protocole, nous décrivons un protocole optimisé de rétrovirus à cellule T (RV) et de transduction in vitro qui génère un grand nombre de cellules CD8 CAR-T fonctionnelles spécifiques à l'antigène à partir d'un faible nombre de cellules naïves. Auparavant, plusieurs protocoles de cellules CAR-T ont été décrits, mais généralement avec une efficacité de transduction relativement faible et la viabilité cellulaire après la transduction. En revanche, notre protocole fournit jusqu'à 90% d'efficacité de transduction, et les cellules générées peuvent survivre plus de deux semaines in vivo et retarder considérablement l'début de la maladie à la suite d'une seule perfusion. Nous fournissons une description détaillée du protocole d'entretien et de transduction des cellules, de sorte que les étapes critiques peuvent être facilement suivies. L'ensemble de la procédure de l'isolement cellulaire primaire à l'expression de la RCA peut être effectuée dans les 14 jours. La méthode générale peut être appliquée à n'importe quel modèle de maladie de souris dans lequel la cible est connue. De même, l'application spécifique (ciblant un complexe pathogène de classe II peptide/MHC) s'applique à tout autre modèle de maladie auto-immune pour lequel un complexe clé a été identifié.

Introduction

Étant donné le risque probablement réduit d'effets non désirés hors cible, les thérapies immunitaires spécifiques aux antigènes (ASI) sont des traitements prometteurs pour les maladies auto-immunes telles que le DT1. L'accumulation de preuves suggère que les réponses immunitaires à l'insuline (prépro) peuvent être particulièrement importantes dans le DT11. Au cours de la dernière décennie, des études de plusieurs groupes, y compris le nôtre, suggèrent fortement que la présentation d'un épitope contenant des acides aminés de la chaîne de l'insuline B 9 à 23 par des molécules spécifiques de classe II du MHC (B:9-23/MHCII), joue un rôle important dans le développement du DT1 souris et les humains2,3,4,5. Pour cibler sélectivement le complexe B:9-23/MHCII, nous avons généré un anticorps monoclonal, nommé mAb287, qui n'a aucune réactivité croisée à l'insuline hormonale ou aux complexes contenant d'autres peptides6. MAb287 bloque la présentation d'antigène in vitro, et l'administration hebdomadaire de mAb287 aux souris prédiabétiques de NOD a retardé le développement du T1D dans 35% des souris traitées6. Pour bloquer la présentation d'antigène in vivo, des injections fréquentes sont généralement nécessaires afin de maintenir une concentration circulante élevée. Nous avons émis l'hypothèse que nous pourrions surmonter cette difficulté en profitant de la grande spécificité d'Ab287 pourreprogrammer les lymphocytes T, fournissant ainsi une thérapie à cellule T spécifique à l'antigène améliorée pour le DT7 .

Les lymphocytes T cytotoxiques seraient capables de tuer leur cible si même une seule copie de leur ligand cognate est exprimée8,9,10. Ainsi, on s'attend à ce que les lymphocytes T CD8 spécifiques B:9-23/MHCII aient une plus grande efficacité en éliminant la présentation indésirable d'antigène que l'anticorps parent, qui devra probablement se lier à plusieurs complexes sur le même APC pour exercer son effet. Les cellules T de CAR ont été employées pour traiter les cancers humains multiples11,12,13,et peuvent également être efficaces dans l'autoimmunité14. Cependant, les cellules CAR-T avec la spécificité pour les complexes pathogènes peptide-MHC n'ont pas été jusqu'ici employées pour modifier la progression du DT1. En utilisant la technique optimisée de transduction de cellules T CD8 décrite ci-dessous, nous avons récemment démontré la preuve de principe que cela représente en effet une approche viable7.

Dans ce protocole, nous dénoncions une méthode de transduction et d'expansion efficace et rationalisée. Notre protocole s'applique à d'autres études nécessitant la génération de cellules T CD8 CAR de souris à haut rendement.

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Protocole

Les souris ont été maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes dans un établissement de souris transgéniques, et toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux du Baylor College of Medicine.

REMARQUE : L'expérience nécessite la préparation du virus et des lymphocytes T en parallèle. Le tableau 1 résume le protocole. Les réactifs et tampons clés sont répertoriés dans le Tableau des matériaux. Nous nous concentrons sur la génération et l'expansion des cellules CAR-T ciblant des populations spécifiques d'APC dans ce protocole.

1. Génération et validation de l'anticorps Fab à chaîne unique (scFab)-RAC.

REMARQUE: Les RAC contiennent généralement 3 domaines critiques : un domaine de ciblage antigène, un domaine spatial/transmembrane et un domaine de signalisation cytoplasmique. La conception précise de chaque RAC dépend de la cible visée et, en dehors des caractéristiques clés de la construction pertinente à la génération du rétrovirus, ne sera pas décrite en détail dans ce protocole. La conception globale des RAC utilisées pour les études décrites ci-dessous est illustrée à la figure 1. En bref, le domaine de ciblage comprend l'ensemble de la chaîne légère et variable et CH1 domaine de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal parent lié par un maillon semi-rigide. Le domaine spacer/transmembrane provient de la souris CD28, et le domaine de signalisation est une fusion contenant des éléments de souris CD28, CD137 (4-1BB) et CD247 (CD3). Ces éléments sont assemblés par des procédures de biologie moléculaire standard telles que l'épissure chevauchement de réaction en chaîne de polymérase (PCR), ou la synthèse d'un « bloc génétique » approprié. Les détails de la génération de la CAR mAB287 sont contenus dans Zhang et al.7. Les séquences d'ADNc peuvent être obtenues auprès des auteurs sur demande.

  1. Assemblage de la construction centrafricaine
    1. Synthétiser séparément l'anticorps Fab à chaîne unique de ciblage (scFab) et les domaines combinés espaceur/signalisation, et utilisez une technique de ligature « 3 points »15 pour assembler la construction finale (Figure 1).
      REMARQUE: L'exigence clé de l'encart CAR est qu'il contienne des sites d'endonucléase de restriction de l'accompagnement permettant la ligature dans le vecteur d'expression rétrovirale pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II), ou un dérivé connexe15 sont également approprié.
  2. Validation de l'expression de surface de la RCA
    1. Transduce les cellules hybridome à l'aide de particules rétrovirales dérivées de pMIGII générées par un protocole standard (p. ex. Holst et al.16 ).
    2. Analyse de cytométrie du débit d'exécution pour détecter l'expression du GFP à partir du vecteur CAR17.
    3. Expression de surface de tache de la RCA des hybridomas transducés à l'aide d'anticorps étiquetés contre la chaîne de la souris (p. ex., clone RMK-45)17.
      NOTE: 18.
  3. Validation de la spécificité CAR
    1. Stimulez les cellules hybrides transductées avec des antigènes cellulaires ou cellulaires appropriés. Après la co-culture de nuit recueillir supernatants et cytokines sécrétés, et admis par l'analyse immunosorbent enzymatique (ELISA)7.
      REMARQUE: Idéalement, chaque RCA doit être validé de façon indépendante avant d'être utilisé pour la transduction. À cette étape, l'expérience peut être interrompue et redémarrée plus tard.

2. Transfection des cellules productrices virales (jour -4 au jour 3)

REMARQUE: Le rétrovirus est produit à l'aide de cellules Phoenix-ECO (voir le Tableau des matériaux)19,20. Prendre les précautions appropriées pour la génération d'agents potentiellement infectieux (y compris de préférence un cabinet BSL-2 désigné et un incubateur séparé pour la culture des cellules transfectées/transduced).

  1. Décongélation des cellules Phoenix (Jour -4)
    1. Décongeler 2 x 106 cellules Phoenix-Eco. Échelle du nombre de cellules Phoenix si plusieurs transductions sont planifiées.
    2. Les déposer dans un plat de culture tissulaire de 10 cm avec 10 ml de milieu (le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum fœtal de veau (FCS)).
  2. Cellules De Phoenix de passage (Jour -3)
    1. Retirer le milieu et laver à l'huile de 5 ml de salin tamponné par le phosphate (DPBS) de Dulbecco.
    2. Ajouter 3 ml de trypsine de 0,25 % et incuber à 37 oC sous 10 % d'atmosphère de CO2 pendant 3 min.
    3. Récolter les cellules puis pelleter par centrifugation pendant 3 min à 200 x g. Re-plaquer les cellules avec un milieu frais de 10 ml et incuber à 37 oC.
  3. Irradiation des cellules Phoenix (Jour -1 après-midi)
    1. Pour minimiser la division cellulaire, recueillir les cellules Phoenix telles que décrites à l'étape 2.2, resuspendre dans 5 ml de milieu, et les cellules d'irradiation gamma sur la glace (1000 rad).
      REMARQUE: La prudence doit être utilisée pour les travaux de radiothérapie afin d'éviter l'exposition du personnel.
    2. Centrifuger les cellules irradiées, resuspendre dans un milieu frais, plaquer à 2 x 106 cellules (dans 10 ml de milieu)/plaque/CAR, et incuber.
  4. Transfection (Jour 0 - matin)
    1. Aspirez le supernatant des cellules Phoenix, lavez-le avec 5 ml de saline tamponnée par phosphate (PBS), et ajoutez soigneusement 7 ml de milieu sérique réduit (p. ex., Opti-MEM) dans le sens de la chute à la paroi latérale de la plaque pour éviter de déranger la monocouche. Transférer les cellules à l'incubateur.
    2. Prendre deux tubes de polypropylène à fond rond de 14 ml et ajouter 1,5 ml de milieu sérique réduit à chacun. Dans un tube, ajouter 40 l de réactif de transfection (voir le Tableau des matériaux).
    3. Dans l'autre tube, ajouter 15 g d'Ab-CAR-plasmide (généré à l'étape 1) et 5 g d'enveloppe et de plasmide d'emballage (5 g pCL-Eco). Incuber les tubes à température ambiante pendant 5 min.
    4. Ajouter le mélange de réactif de transfection de l'étape 2.4.2 goutte à la deuxième tube sans entrer en contact avec les côtés du tube, et mélanger en pipetting la solution de haut en bas doucement 3 fois. Incuber à température ambiante pendant au moins 20 min.
    5. Ajouter 3 ml du mélange dans le sens de la goutte aux cellules Phoenix, et placer dans un incubateur de culture tissulaire.
    6. Après 4 à 5 h ajouter 1 ml de FCS. Cellules de culture pendant la nuit à 37 oC.
  5. Changement moyen (Jour 1)
    1. Retirez le supernatant contenant les complexes de réactifs plasmides/transfection et éliminez-les conformément aux procédures institutionnelles de manipulation des matières infectieuses. Ajouter 4 ml de milieu de culture frais et préréchauffé aux cellules.
  6. Virus de la récolte pour la transduction (Jour 2)
    1. Recueillir le milieu contenant le virus des cellules Phoenix avec une seringue stérile, un filtre (0,45 m) pour enlever les débris de cellules résiduelles, et recueillir dans un nouveau tube.
    2. Ajouter le bouillon de rhIL-2 à une concentration finale de 200 UI/mL. Utilisez le virus immédiatement pour la transduction (étape 5.3). Ajouter 4 ml de milieu frais aux cellules Phoenix et placer dans l'incubateur.
  7. Collecte répétée de virus (Jour 3)
    1. Répétez l'étape 2.6, mais jetez les cellules Phoenix comme déchets infectieux au lieu d'ajouter du milieu frais. Ce supernatant est utilisé à l'étape 5.4.

3. Isolation et activation des lymphocytes T CD8 primaires (jour -1 au jour 0)

REMARQUE: Auparavant, recueillir des lymphocytes T CD8 à partir de souris femelles de NOD à 4-5 semaines, un point de temps avant que l'inflammation d'islet commence21,22. Manipulez toutes les souris suivant les protocoles approuvés par l'IACUC. Les lymphocytes T CD8 sont enrichis à partir de splenocytes à l'aide d'un kit de sélection négative commerciale.

  1. Plaques de revêtement avec anticorps CD3/CD28 (Jour -1)
    1. Ajouter 1 ml d'un mélange d'anticorps Anti-souris CD3 et CD28 (tous deux à 1 g/mL en PBS) à chaque puits d'une plaque de 24 puits, et couver à 4 oC pendant la nuit.
    2. Le lendemain, lavez les plaques avec 1 ml de PBS stérile 3 fois avant d'ajouter les lymphocytes T Murine CD8 (étape 4.1).
      REMARQUE: Le nombre de puits à enduire varie pour chaque expérience, selon le nombre total de lymphocytes T CD8 activés requis.
  2. Collection de splenocytes (Jour 0)
    1. Euthanasiez deux souris femelles NOD âgées de 4 à 5 semaines en utilisant l'inhalation de CO2 suivie de la décapitation. Récoltez les rates et mettez-les sur une passoire cellulaire trempée dans 10 mL de PBS dans un plat de culture cellulaire sur la glace.
    2. Dans une hotte de culture cellulaire, couper chaque rate en 3 à 5 morceaux, presser les tissus avec un piston stérile d'une seringue de 3 ou 5 ml pour forcer les fragments de rate à part et permettre aux cellules de passer à travers le treillis métallique.
    3. Enlever délicatement les globules rouges en rependant les splenocytes dans un tampon dilué de lyse des cellules rouges dilués (1 ml de tampon de lyse dans 3 ml de PBS pour une rate), et en couvant pendant 5 minutes à température ambiante.
    4. Ensuite, diluer 10 l de la suspension cellulaire avec la solution de colorant bleu trypan pour compter les cellules avec un hémocytomètre, et pelleter le reste des cellules par centrifugation à 350 x g pendant 7 min.
  3. Enrichissement des lymphocytes T CD8 (Jour 0)
    1. Enrichissez les lymphocytes T CD8 par sélection négative à l'aide d'un kit d'isolation des cellules T CD8 de souris, suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE: Pour assurer une grande pureté, arrondissons toujours le nombre de cellules lors du calcul du volume d'anticorps biotinylated à ajouter (p. ex., utiliser le volume de réactifs suggérés pour 108 cellules pour un calcul de 9,1 x 107 cellules).
    2. Suspendre les granulés cellulaires dans 400 l de tampon et 100 l de cocktail biotine-anticorps par 1 x 108 cellules, bien mélanger et incuber pendant 5 min au réfrigérateur (4 oC) pour permettre la fixation des anticorps.
    3. Ajouter 300 l de tampon d'étiquetage et 200 l de micro-perles d'antibiotine par 1 x 108 cellules, bien mélanger et incuber pendant 10 min à 4 oC.
    4. En attendant la liaison micro-perle, configurez la colonne de séparation sur le séparateur. Laver la colonne en rinçant avec 3 ml de tampon d'étiquetage.
    5. Passer 1000 l de mélange perlé/cellule à travers une passoire cellulaire de 40 m avant de charger sur la colonne de séparation pour enlever les agrégats cellulaires. Recueillir le flux de la colonne dans un tube pré-réfrigéré de 15 ml.
    6. Laver la colonne selon les instructions du fabricant, en recueillant tous les effluents dans le même tube. Déterminer le numéro de cellule (même étape 3.2.4) et recueillir par centrifugation à 350 x g pendant 5 min. Laver les cellules en reconpendant 2 ml de milieu cellulaire T complet (RPMI-1640 contenant DU SFC, 2-mercaptoethanol, rhIL-2 (200 U/mL), mIL-7 (0,5 ng/mL), ITS , HEPES et pénicilline-streptomycine) et centrifuge à 350 x g pendant 5 min.
    7. Resuspendre les cellules dans le milieu cellulaire T complet pré-chauffé (37 oC) à une concentration de 0,25 à 0,5 x 106/mL.

4. Activation des lymphocytes T (Jour 0 à 2)

  1. Ajouter 2 ml de la suspension cellulaire (0,25 x 0,5 x 106/mL) à chaque puits enduit de l'anticorps CD3/CD28 enduit 24 puits de l'étape 3.1.2. Utilisez un mouvement tourbillonnant pour distribuer les cellules uniformément.
    REMARQUE: Ajoutez les cellules à l'aide d'un mouvement tourbillonnant pour les répartir uniformément et minimiser les effets de bord. Si les cellules se regroupent le long du bord des puits, le taux de transduction et la viabilité des cellules seront diminués.
  2. En tant que contrôle, plaquez le même nombre de lymphocytes T CD8 dans un seul puits non enduit de la plaque. Incuber les cellules à 37 oC à l'aide d'un incubateur gazé co2 de 10 % pendant 48 h.
    REMARQUE: Après 48 h, l'activation peut être confirmée à l'aide d'un microscope; les cellules activées seront plus grandes que les cellules qui n'ont pas rencontré d'anticorps anti-CD3/CD28.

[place figure 2 ici]

5. Transduction des lymphocytes T CD8 activés (jours 1 à 3)

REMARQUE: Ce protocole utilise une méthode de spin-transduction. Une centrifugeuse avec un rotor de balançoire et des adaptateurs de plaque de culture tissulaire qui est capable de maintenir une température interne de 37 oC est nécessaire. Pour assurer une efficacité maximale, le jour de la transduction préchauffe la centrifugeuse à 37 oC avant de recueillir le virus.

  1. Préparation des plaques enduites de fragment de fibronetine humaine (Jour 1 au jour 2)
    1. Le jour 1, ajouter 0,5 ml de fibronectin (50 g/mL en PBS) aux puits d'une plaque de 24 puits, et couver toute la nuit à 4 oC.
      REMARQUE: En général, deux puits enduits de fibronectin sont nécessaires par plaque de cellules Phoenix transfectées.
    2. Le jour 2, retirez la solution de fibronectin et remplacez-la par 1 ml d'albumine bovine (BSA) de 2 % dans PBS. Incuber à température ambiante pendant 30 min pour « bloquer » les sites de liaison non spécifiques.
    3. Laver les puits traités avec 1 ml de PBS stérile. Après avoir enlevé la solution de lavage, la plaque est prête à l'emploi; ou, peut être scellé et stocké à 4 oC pendant une semaine.
  2. Collecte de lymphocytes T CD8 activés (Jour 2)
    1. Récoltez les lymphocytes T CD8 activés, comptez et calculez la viabilité cellulaire à l'aide du bleu trypan ou d'un instrument automatisé approprié.
    2. Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre à 5 x 106 cellules viables/mL pour la transduction. Maintenir un petit aliquot de cellules en culture dans le milieu cellulaire T complet dans l'incubateur de CO2 afin de fournir un contrôle pour le tri cellulaire activé par fluorescence ultérieure des cellules transductées (étape 6).
      REMARQUE: Après l'activation pendant 48 h, le nombre total de cellules aurait dû être multiplié par environ 1,5 et avoir une viabilité supérieure à 95 %.
  3. Transduction (Jour 2)
    1. Ajouter 100 l de suspension de cellules CD8 activées par puits (0,5 x 106 cellules) à la plaque enduite de fibronectin. Ajoutez ensuite 1,5 à 2 ml de milieu contenant le virus (à partir de l'étape 2.6) à chaque puits. Mélanger à l'aide d'un mouvement tourbillonnant pour distribuer les cellules uniformément (Figure 2).
    2. Placez la plaque dans un sac en plastique zip-lock et le joint (pour fournir un confinement secondaire). Centrifugeuse à 2000 x g pendant 90 min à 37 oC.
    3. Retirer la plaque de la centrifugeuse. Dans la sécurité biologique, l'armoire retire soigneusement le sac en plastique et s'assure que l'extérieur de la plaque n'est pas contaminé par un support.
    4. Transférer ensuite la plaque dans l'incubateur de CO2 dédié à 37 oC. Après 4 h, retirer 1 ml du milieu de chaque puits et remplacer par 1 ml de milieu cellulaire T complet préréchauffé. Remplacer la plaque dans l'incubateur CO 2.
      REMARQUE: Manipulez tous les médias des cellules transductées comme des déchets infectieux.
  4. Deuxième transduction (Jour 3)
    1. Dans l'armoire de sécurité biologique dédiée, inclinez la plaque contenant les cellules transduisées en se reposant sur le couvercle et retirez soigneusement la majeure partie du milieu (laissant 100 à 200 l) en veillant à ne pas entrer en contact avec les cellules au fond du puits.
    2. Ajoutez le milieu contenant le virus recueilli à l'étape 2.7 et répétez les étapes 5.3.2-5.3.4.
      REMARQUE: D'après notre expérience, une troisième transduction améliore rarement l'efficacité globale. En outre, la viabilité de la cellule diminuera probablement de façon significative si une troisième transduction est utilisée. Si les cellules sont plaquées à une concentration plus élevée que 0,5 x 106/puits, les lymphocytes T peuvent atteindre la confluence après l'incubation de nuit après la deuxième étape de transduction. Dans ce cas, les cellules divisées après l'incubation de 4 h le jour 3.
  5. Cellules de lavage (Jour 4)
    1. Retirer 1 ml de milieu de chaque puits, resuspendre les cellules dans le milieu restant et transférer dans un tube de 15 ml. Laver les puits avec 1 ml de milieu cellulaire T complet et ajouter au tube contenant les cellules mises en commun de chaque transduction.
    2. Centrifugeuse à 350 x g pendant 7 min, puis laver deux fois en rependant 2 ml de milieu cellulaire T complet et de granulés. Enfin resuspendre dans 2 ml de milieu et de déterminer le nombre de cellules.
      REMARQUE: Si 1 x 106 cellules ont été à l'origine transduisées, le rendement à ce stade devrait être de 3 x 106.
  6. transférer
    1. Transférer les aliquots de 0,5 x 1 x 106 cellules dans 2 ml de milieu cellulaire T complet aux puits d'une nouvelle plaque de 24 puits et incuber à 37 oC. Environ 48 à 72 h après la transduction, les cellules sont prêtes pour l'analyse de l'expression de la RCA et le tri cellulaire.
      REMARQUE: Le nombre de cellules CAR-T double habituellement chaque 24 h à ce stade. Il est essentiel de ne jamais les laisser grandir. Divisez les cellules immédiatement si la densité est supérieure à 2 x 106/mL (ou si le milieu devient jaune vif). D'après notre expérience, les cellules CAR-T prolifèrent plus solidement dans des plaques de 24 puits et de 12 puits que si elles étaient transférées à un plus grand vaisseau.

6. Purification des cellules transductées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (jour 5 ou jour 6)

  1. Recueillir les cellules.
    1. Resuspendre les cellules en faisant monter et descendre plusieurs fois (en prenant soin de ne pas causer d'écume), transférer à 15 ml de tubes et centrifugeuse à 350 x g pendant 5 min.
    2. Resuspendre dans le tampon de tri (2% BSA en PBS stérile contenant de la gentamicine) à 1 x 106 cellules/mL. Récoltez également les lymphocytes T CD8 témoins (non transducs) à partir de l'étape 5.2).
      REMARQUE: De 1 x 106 cellules au jour 2, un rendement de 2 x 107 cellules transductées est prévu à ce moment-là.
  2. Laver les cellules une fois avec un tampon de tri en centrifugeant à 350 x g pendant 5 min, et resuspendre à 1 x 107 cellules/mL dans le tampon de tri. Retirez un petit aliquot pour le contrôle de compensation Foxp3GFP (à utiliser à l'étape 6.4.1), et tachez le reste avec l'étiquette anti-souris CD8 (clone 53-6.7; 0.2 g d'anticorps/5 x 106 cellules) en couve pendant 20 min à 4 oC.
    1. De même, tacher un aliquot des lymphocytes T CD8 non transducérés pour fournir un contrôle de compensation pour le fluorophore étiquetant l'anticorps anti-CD8.
      REMARQUE: Évitez d'ajouter de l'azide de sodium à n'importe quel tampon, car cela est toxique pour les cellules.
  3. Laver les cellules étiquetées deux fois avec un tampon de tri, resuspendre dans un tampon de tri à froid à 1 x 107 cellules/mL.
  4. Triez les cellules.
    1. Trier le GFP CD8et les cellules positives dans un milieu cellulaire T complet préréfrigéré (figure 3B). Prenez un petit aliquot pour l'analyse post-tri pour déterminer la pureté.
      REMARQUE: Pour maximiser la pureté des cellules triées, des portes serrées doivent être utilisées. Utilisez une buse de 100 m pour assurer une viabilité cellulaire élevée. Réduisez le temps pendant lequel les cellules triées sont conservées sur la glace. Les lymphocytes T qui ont été maintenus sur la glace pendant plus de 3 h prennent beaucoup plus de temps à récupérer que les cellules refroidies pendant moins de 2 h. Ainsi, si 3 lignées cellulaires transductées doivent être triées, collecter et étiqueter la deuxième ligne pendant que la première est triée et ainsi de suite plutôt que d'avoir les deuxième et troisième lignes passer un temps prolongé à 0 oC. L'expression d'autres marqueurs de lymphocytes T tels que CD28 et CD3 peut également être surveillée (figure 3C) mais n'est pas essentielle pour le tri.
    2. (Stratégie de tri alternatif) Avant de tacher la population en vrac, analysez l'expression CD8 d'une petite population de lymphocytes T transductés. Si la pureté est de 99 %, la population en vrac peut être triée en toute sécurité uniquement sur la base de l'expression gFP.

7. Expansion des cellules CAR-T triées (Jour 5 à 10)

  1. Expansion des cellules CAR-T
    1. Laver les cellules CAR-T triées une fois, puis resuspendre dans le milieu complet de cellule T pré-chauffé à 2,5 x 5 x 105 cellules/mL, et la plaque 2 mL aliquots dans des plaques de 24 puits.
    2. Comptez et divisez les cellules tous les 1/2 jours. Habituellement, le nombre de cellules double tous les jours jusqu'au 10e jour, la viabilité restant supérieure à 95 %.
      REMARQUE: Sans restimulation, les cellules CAR-T cesseront de proliférer vers le 10e jour et finiront par mourir. Ainsi, les tests fonctionnels des lymphes T et les transferts d'adoption devraient être planifiés en conséquence.
  2. Stratégie d'expansion alternative
    1. Après le tri, la culture des cellules CAR-T dans le milieu complet de cellule T contenant le rhIL-2 à 100 U/mL plutôt que 200 U/mL.
      REMARQUE: Les cellules CAR-T prolifèrent à un rythme légèrement plus lent dans ce milieu. Cependant, ils continueront souvent à proliférer jusqu'aux jours 11 à 13 sans re-stimulation. Ainsi, bien que cette stratégie d'expansion alternative ne génère pas un plus grand nombre de cellules, elle fournit une fenêtre de temps légèrement plus longue pour les essais en aval à effectuer.

8. Vérification de la spécificité et de la fonctionnalité de l'antigène des lymphocytes T CAR.

REMARQUE: La spécificité de liaison des cellules T CAR ciblant les complexes peptide/MHC peut être vérifiée par la coloration tétramer7,23. De même, leur fonctionnalité peut être confirmée en mesurant la sécrétion de cytokine ou la cytotoxicité après stimulation par leurs ligands cognate. Le NIH Tetramer Core Facility (TCF) de l'Université Emory est une source recommandée de «tetramers» et de protocoles de coloration pertinents.

  1. Peptide-MHC Tetramer coloration.
    1. Étiqueter les aliquots de 2 x 105 cellules CAR-T transduisantes dans 100 l de tampon de tri en couve avec 0,6 g de tétragènes antigènes et de contrôle fluorescents à 37 oC pendant 2 h.
    2. Pelleter les cellules par centrifugation pendant 5 min à 350 x g, puis laver deux fois en reconpendant dans 0,5 ml de tampon de tri et de re-centrirfuging. Enfin, resuspendre les cellules dans 300 l de tampon de tri et d'analyser par cytométrie de flux (Figure 4).
      REMARQUE: Pour ces études, nous utilisons généralement des tétracères BV421-labeled IAg7-B:9-23(RE) (test) et IAg7-HEL (contrôle). Cependant, toute combinaison fluorophore/tétramer qui convient aux CAR(s) à l'étude peut être utilisée à la place. Dans ce cas, la concentration et le temps de coloration doivent être optimisés pour chaque tétramer utilisé. Les cellules CAR-T triées et non triées peuvent être utilisées pour la coloration des tétramères.
  2. Mesure de spécificité par stimulation ligand.
    1. Incuber 2 x 105 cellules CAR-T triées dans 200 L de milieu cellulaire Sans cytokine avec des ligands cellulaires ou liés à des plaques appropriés.
    2. Après 6-24 h mesurent la production de cytokine par ELISA ou coloration intracellulaire utilisant les protocoles du fabricant.
      REMARQUE: Pour nos études de IAg7-B:9-23 redirigés lymphocytes T, nous culture les cellules du jour au lendemain avec M12C3 cellules murines b-cellules lymphome exprimant IAg7-B:R3 ou "vide" IAg724,25, puis collecter les supernatants et mesurer l'interféron de souris sécrétée gamma (IFN-) par ELISA26 (Figure 5).

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Résultats

En règle générale, l'efficacité de la transduction à l'aide de ce protocole est de 60-90%. Dans l'expérience montrée dans la figure 3, avant le tri d'environ, 70 % des lymphocytes T CD8 ont co-exprimé le PFG. Ils ont également co-exprimé CD28 et CD3 (figure 3C). Fait important, toutes les cellules « test » De GFPsont également tachées de tétragraphes IAg7-B:R3, mais pas avec le tétramère de ...

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Discussion

Ce protocole décrit une méthode efficace pour produire des cellules CD8 CAR-T spécifiques à l'antigène par transduction rétrovirale. L'efficacité de la transduction de notre protocole est généralement élevée, et l'expression robuste de la RCA est généralement observée. Les lymphocytes T CAR élargis conservent les caractéristiques essentielles des lymphocytes T activés par les parents, et la spécificité des anticorps, et conviennent à l'utilisation in vitro et in vivo. Nous avons appliqué des lymphocy...

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Déclarations de divulgation

MAb287 et ses dérivés sont protégés par un brevet américain délivré en 2014.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par les subventions de la FRDJ 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, et SRA-2-S-2018-648-S-B, un Prix d'éducation et d'action sur le diabète, et le Fonds de droit Caroline Wiess pour la recherche en médecine moléculaire au Baylor College of Medicine. Le tri cellulaire a été appuyé par le Cytometry and Cell Sorting Core du Baylor College of Medicine grâce à un financement des NIH (S10RR024574 et P30CA125123). Tous les tétratiers peptidiques-MHC ont été obtenus à partir de l'installation de base de Tetramer des NIH.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoethanol (50mM)Gibco21985-02350 μM
5’ RACE PCRClontech634859
anti-mouse CD28 antibodieseBioscience14-0281-86final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibodyeBioscience145-2C11final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γBD Biosciences554410Working concentration at 0.5 µg/ml
BSASigmaA7030
Endo-free Maxi-Prep kitQiagen12362
GentamicinGibco15750-060Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCSHycloneSH30087.03Final 10% FCS
HEPES (100X)Gibco15630-0801X
IAg7-CLIP tetramer-BV421NIH tetramer Facility at Emoryper approvalWorking concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421NIH tetramer Facility at Emoryper approvalWorking concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)ThermoFisher51500056Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Separation BufferMiltenyi Biotec130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation KitMiletenyi Biotec Inc130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation KitMiltenyi Biotec130-104-075
Opti-MEM mediumThermoFisher31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)ThermoFisher1507006350 U/ml
Phoenix-ECO cellsATCCCRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco10010-023
pMIG IIAddgene52107
pMSCV-IRES-GFP IIAddgene52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γBD Biosciences551216Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis bufferSigmaR7767
RetroNectinTakaraT100AWorking concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)Peprotech200-02Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)R&D407-ML-005Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640Gibco11875-093
Sterile Cell StrainersFisher Scientific22-363-548
TrypleGibco12605-028

Références

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